Osservazione dei Livelli di Allineamento e di Organizzazione in Strutture del Collageno Facendo Uso di Microscopia Atomica della Forza dagli Strumenti di JPK

Argomenti Coperti

Struttura e Funzione del Collageno
Tessuto Naturalmente Formato del Collageno
Fibrille Depositate del Collageno - Substrati per gli Studi delle Cellule di Osso
Strutture del Collageno all'interno dell'Osso Naturale
Pellicola Depositata del Collageno per gli Innesti
Livelli Stati Allineati del Collageno e Crescita Diretta delle Cellule
Conclusioni

Struttura e Funzione del Collageno

Il Collageno è la proteina più abbondante nel corpo umano, rappresentante intorno 30% della somma totale di proteina. Il Collageno è un contributo strutturale alla maggior parte dei tessuti nell'organismo come la matrice extracellulare ed è particolarmente abbondante in tessuto connettivo. L'Interfaccia, per esempio, è collageno di intorno 75% ed il collageno quindi ha un ruolo vitale in molti trattamenti come guarigione della ferita. La produzione o la mineralizzazione del Collageno è la base per la formazione di cartilagine, tendini o ossa. Le Celle in tutti i altri tessuti dell'organismo egualmente sono circondate dalle strutture più fini del collageno attraverso la matrice extracellulare, in modo dal collageno ha un ruolo vitale egualmente nella proliferazione, nella migrazione e nella differenziazione delle cellule.

Il Collageno è una famiglia di intorno 20 proteine riferite, che formano le eliche triple attraverso tre catene del polipeptide che estraggono intorno ad a vicenda in una struttura del tipo di corda. Questi protofibrils nanometro di taglia triplo-incagliati possono legare insieme per formare i tipi differenti di strutture di più alto livello. Le fibre dure del collageno costituite dal collageno di Tipo 1 danno i tendini o i legamenti la loro concentrazione ad alta resistenza, ma altri tipi di collageni formano le più piccole, o più strutture ramificate nella matrice extracellulare. Il Collageno è compreso nella struttura o la funzione di molti tessuti, così là è molte malattie connesse con la disfunzione del collageno. Un difetto genetico ha chiamato la Sindrome di Alport che pregiudica il Tipo il collageno di IV, per esempio, disfunzione di cause dei glomeruli nei reni come pure nei problemi dell'orecchio e dell'occhio e generalmente piombo ad insufficienza renale.

La struttura delle fibrille del collageno di Tipo 1 è schizzata schematicamente nella Figura 1. Tre catene del polipeptide estraggono insieme per formare una struttura elicoidale rigida. Queste molecole del collageno poi allineano lungo l'asse ed il gruppo dell'elica come gruppo per formare le fibrille del collageno. Queste fibrille del collageno possono anche allineare lateralmente per formare i gruppi su un di ordine superiore della struttura e per comporre le fibre micron di taglia dure del collageno trovate in legamenti. Una caratteristica delle fibrille del collageno è la loro struttura legata. Il diametro della fibrilla cambia leggermente sulla lunghezza, con una ripetizione altamente riproducibile della D-Banda di approssimativamente 67nm.

Figura 1. Rappresentazione schematica della struttura della fibrilla del Collagene di Tipo I. Le molecole Elicoidali del collageno si formano da tre catene del polipeptide e queste si associano lateralmente per formare le fibrille del collageno con una struttura legata caratteristica.

Oltre alla sua funzione naturale nell'organismo, il collageno egualmente è stato utilizzato in tecnico e le applicazioni mediche come superficie fisiologica di modello per coltura cellulare, impiantano la biocompatibilità e la crescita diretta delle cellule.

Tessuto Naturalmente Formato del Collageno

Le strutture della fibrilla legate classico possono essere vedute chiaramente in collageno della coda di ratto, che dimostra l'alto livello di struttura e la regolarità possibile nelle fibre del collageno. Figura 2 immagini di altezza e di deflessione verticale di manifestazioni delle fibre del collageno della coda di ratto, per un'area di scansione di 2 x 2 micron. In questa immagine, molte delle fibre sono trovarsi parallela, sebbene alcuni siano attraversati nell'angolo in basso a sinistra. L'immagine di sezione trasversale sotto mostra una sezione lungo l'asse centrale della fibra. Gli indicatori rossi sono 1345 nanometro a parte, che corrispondono a 20 ripetizioni della D-Banda. Ciò dà un valore per questo campione di 67,3 nanometro per il periodo di ripetizione. I Cambiamenti nel periodo di ripetizione dovuto le varie mutazioni possono essere importanti da misurare esattamente.

Figura 2. immagini di deflessione verticale e di Altezza di un'area di scansione di 2 x 2 micron su un campione del collageno della coda di ratto. La sezione trasversale mostra 20 ripetizioni della D-Fascia segnata con le linee rosse, dare e un periodo medio di 67,3 nanometro.

Figura 3 mostra le più piccole (600 x 600 nanometro) scansioni dello stesso campione, ancora segnali di area di deflessione verticale e di altezza, mostrare la struttura di ordine superiore che è visibile. La terza immagine fa parte della scansione di altezza dopo che è stata passa-alto filtrata per rimuovere la curvatura di sfondo della fibra. Ciò mostra più chiaro le più piccole funzionalità e l'immagine di sezione trasversale mostra il gioco di piccole strutture sulla superficie. Il disgaggio di altezza per la sezione trasversale non è assoluto, poiché la curvatura della fibra di sfondo è stata rimossa. La dimensione laterale delle funzionalità è intorno 7 nanometro. Le funzionalità di Esempio sono segnate con le linee rosse con una separazione di 6,7 nanometro.

Figura 3. immagini di deflessione verticale e di Altezza delle 600 x 600 aree di nanometro di una fibrilla del collageno del ratto. Oltre alla fascia trasversale, c'è egualmente struttura visibile attraverso la fibra, secondo le indicazioni della sezione trasversale nella parte inferiore.

Fibrille Depositate del Collageno - Substrati per gli Studi delle Cellule di Osso

Le fibrille Isolate del collageno da un campione bovino del tendine (depositato a densità bassa su vetro APTES-rivestito) sono indicate nella Figura 4. Le immagini sono la cortesia di Prof. M. Horton, Osso e Centro Minerale dell'University College Di Londra ed il Centro di Londra per Nanotecnologia. L'immagine ottica (cima) mostra che il AFM a mensola e le più grandi fibrille del collageno sono egualmente visibili facendo uso di contrasto ottico di fase. Le due grandi immagini del AFM mostrano i segnali di deflessione verticale e di altezza per un'area di scansione di 100 x 100 micron. La Maggior Parte delle fibrille formano uniformemente la curva delle strutture. Una più piccola (5 x 5 micron) scansione egualmente è indicata come immagine di altezza 3D, dove la periodicità della fibrilla può essere veduta.

La Figura 4. fibrille Bovine del collageno del tendine su APTES-vetro, la cortesia di immagini di Prof. M. Horton, l'Osso ed il Centro Minerale UCL e Londra Concentrano per Nanotecnologia. Immagini Ottiche del AFM di altezza e di deformazione di area di scansione di contrasto di fase (cima), immagine di altezza 100 x 100 dei micron (centro) e 5 x 5 del micron 3D (fondo).

Strutture del Collageno all'interno dell'Osso Naturale

Malgrado apparentemente la stabilità dell'osso, in effetti l'osso nello scheletro di un essere umano vivente sta ricostruendo costantemente. Osteoblasts e gli osteoclasti sono celle che sono responsabili della formazione e del riassorbimento di osso e mantengono insieme un equilibrio dinamico nello scheletro degli adulti in buona salute. Il Collageno ha un ruolo vitale in questi trattamenti, poiché forma la struttura strutturale della proteina dell'osso ed egualmente ha un ruolo nella segnalazione fra i osteoblasts e gli osteoclasti.

Figura 5 mostra le immagini del AFM di una fetta di osso corticale in cui la struttura del collageno dell'osso è stata rivelata dagli osteoclasti che rimuovono il collageno ed i minerali. Le fibre Lateralmente associate del collageno con la chiara D-Fascia sono vedute nelle immagini di errore e della topografia. Una lacuna del osteocyte è veduta all'interno dell'osso (anellato). La cortesia di Immagini di Bozec e di Horton, UCL e Londra Concentrano per Nanotecnologia. Le immagini superiori del AFM mostrano un'area di 4 x 4 micron con un z-intervallo di 521 nanometro per l'immagine di altezza e uno zrange di 300 sistemi MV per l'immagine di deformazione. L'immagine più bassa mostra uno zoom 3-D della proiezione di altezza nella lacuna del osteocyte, nel pozzo di riassorbimento costituito da rimozione del collageno e nei minerali. Facendo Uso del AFM, la disposizione, la periodicità ed il diametro della fibrilla possono essere misurati statisticamente, dando la possibilità alle differenze sottili di studio fra i tessuti sani o malati.

Figura 5. struttura del collageno dell'Osso rivelatrice dagli osteoclasti che rimuovono collageno ed i minerali da una fetta di osso corticale. La cortesia di Immagini di Bozec e di Horton, UCL e Londra Concentrano per la tecnologia di Nan. area di scansione di 4 x 4 micron per entrambe le grandi immagini del AFM (521 altezza dell'z-intervallo di nanometro, immagine di deformazione dell'z-intervallo 300mV). zoom 3-D della proiezione di altezza nella lacuna del osteocyte.

Pellicola Depositata del Collageno per gli Innesti

I Vari metodi sono stati messi a punto per depositare il collageno sui materiali per formare le superfici biocompatibili, o per la crescita diretta delle cellule. Il collageno può essere adsorbito relativamente semplicemente alle superfici quale vetro, ma è più difficile da fissare stabile il collageno ai materiali sintetici quale il silicone. Questi generi di strutture composite possono essere usati per promuovere la ferita che guarisce e per migliorare la biocompatibilità dei materiali per gli innesti, specialmente innesti vascolari. Il collageno unito con legami atomici incrociati può essere trattato con le molecole quale l'eparina per diminuire l'attivazione di trombosi, o il fattore di crescita del fibroblasto per promuovere la semina endoteliale delle cellule.

Le immagini nella Figura 6 mostrano una generalità di 10 x 10 micron di un campione della pellicola collageno-rivestita del silicone (cortesia del campione di M.J.B. Wissink, Università di Twente, Dei Paesi Bassi). Il campione era imaged nell'ambito della soluzione salina (PBS) tamponata con i fosfati (immagini di ampiezza e di altezza per il modo di contatto intermittente in liquido). Le più grandi fibrille del collageno possono essere menzogne veduta in una matrice più regolare. Il collageno è molto molle in liquido, poiché contiene una proporzione elevata dell'acqua.

Figura 6. immagine Intermittente di modo di contatto in liquido (10 x 10 micron) di una pellicola collageno-rivestita del silicone. Campioni la cortesia di M.J.B. Wissink, Università di Twente, Paesi Bassi.

Sulle più piccole immagini, i dettagli della struttura della D-Fascia possono essere veduti. Le immagini di Altezza, di ampiezza e di fase dello stesso campione sono indicate nella Figura 7 per una più piccola area di scansione (2 x 2 micron). La D-Fascia può essere veduta in tutte e tre le immagini per le fibre del collageno, che stanno trovando diagonalmente attraverso l'immagine nella matrice di sfondo. Sebbene l'intero livello del collageno sia molto molle, la fascia di 67 nanometro può essere veduta chiaramente.

Figura 7. scansione intermittente di modo di contatto da 2 x 2 micron del silicone collagencoated in buffer (cortesia del campione di M.J.B. Wissink, Università di Twente, Dei Paesi Bassi).

Livelli Stati Allineati del Collageno e Crescita Diretta delle Cellule

Le molecole del Collageno possono essere montate ed adsorbite sui supporti della mica per ricoprire anche la superficie (~ 3 nanometro) in un livello piano sottile. Intorno cinque diverse molecole del collageno associano i microfibrils del modulo, con una dimensione laterale di intorno 3-5 nanometro. Uno strato monomolecolare di questi microfibrils può poi essere adsorbito alla superficie per formare una superficie nanostructured e biologicamente attiva. Questi microfibrils sono egualmente probabili essere una fase intermedia nella formazione di più grandi fibre del collageno vedute in tessuto naturale.

Il primo livello di organizzazione è di allineare le fibrille del collageno in modo che ci sia un orientamento globale nello strato superficiale, che può essere raggiunto con l'adsorbimento nelle circostanze di flusso idrodinamico. Nei Limiti di certo tempo dopo il deposito, l'orientamento può anche essere manipolato facendo uso del suggerimento del AFM. Figura 8 mostra un'immagine intermittente di altezza del modo di contatto di 750 x di 750 nanometro del collageno slegato in buffer (z-intervallo 5,5 nanometro). Il campione è la cortesia di A. Taubenberger, il gruppo dei Commputer di D.J. Müller Cellular, l'Università Tecnica Dresda. Le fibre tutte sono orientate nella stessa direzione e la D-Ripetizione di 67 nanometro può essere veduta sulle diverse fibre. In questo caso non c'è allineamento su grande scala della D-Ripetizione fra le fibrille adiacenti.

Figura 8. immagine Intermittente di modo di contatto di collageno slegato in buffer (750 x 750 nanometro, z-intervallo 5,5 nanometro). Campioni la cortesia di A. Taubenberger, i Commputer il gruppo, TU Dresda di D.J. Müller Cellular.

Un livello ulteriore di organizzazione può essere raggiunto se la fascia di Drepeat dei microfibrils del collageno egualmente è stata allineata, come in tessuto naturale. L'allineamento o il non-allineamento delle D-Ripetizioni è sensibile alla composizione ionica del buffer del deposito e l'allineamento è veduto nelle soluzioni che imitano gli ambienti citoplasmici o extracellulari delle celle eucariotiche. Nelle immagini di deflessione verticale e di altezza come appare Figura 9, le molecole sono state depositate in modo che ci fosse un allineamento globale delle bande di Drepeat delle fibrille adiacenti del collageno. Le immagini nella Figura 10 sono la cortesia di A. Taubenberger, i Commputer il gruppo, TU Dresda di D.J. Müller Cellular. In questo campione, il collageno completamente non riguarda la superficie e le lacune possono essere vedute dove la superficie di vetro è visibile sotto.

Figura 9. fibrille slegate State Allineate del collageno in liquido. La cortesia di Immagini di A. Taubenberger, D.J. Müller Cellular Lavora il gruppo a macchina, TU Dresda.

Queste superfici hanno alcuni dei beni nanostructural delle fibre naturali del collageno, stabiliti come rivestimento sottile. L'allineamento delle D-Ripetizioni egualmente produce una superficie bioactive. Le celle del Fibroblasto coltivate sul collageno in cui le fibrille sono orientate, ma non state allineate, non mostrano orientamento particolare della loro direzione della crescita o di forma. Quando il Drepeats egualmente è stato allineato, tuttavia, i fibroblasti mostrano la motilità altamente orientata lungo la direzione di asse ed hanno una forma prolungata in questa direzione. La tessitura della superficie causata dall'orientamento su grande scala delle fibrille da solo non era sufficiente per gestire la motilità delle cellule e questa suggerisce una funzione biologica per l'allineamento della D-Banda nella crescita guidante delle cellule.

Conclusioni

Il AFM è uno strumento potente per l'osservazione dei livelli di allineamento e di organizzazione in strutture del collageno. Le strutture Naturali del collageno, le fibrille isolate ed i biomateriali del romanzo possono tutti essere studiati nelle circostanze fisiologiche. Queste misure possono illuminare le domande biologiche fondamentali come pure verificano i nuovi compositi biocompatibili o specificamente bioactive.

Sorgente: Strumenti di JPK

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego gli Strumenti di JPK

Date Added: Jan 15, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:03

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