Observando os níveis de Alinhamento e Organização em Estruturas de colágeno Usando Microscopia de Força Atômica por JPK Instruments

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Temas Abordados

Estrutura e Função de colágeno
Tecido colágeno formado naturalmente
Depositado fibrilas de colágeno - Substratos de Estudos de células ósseas
Estruturas de colágeno no osso Natural
Depositado Film colágeno para implantes
Alinhados Layers colágeno e Crescimento Celular Direção
Conclusões

Estrutura e Função de colágeno

O colágeno é a proteína mais abundante no corpo humano, representando cerca de 30% da quantidade total de proteína. Colágeno é um suporte estrutural para a maioria dos tecidos do corpo como da matriz extracelular, e é particularmente abundante no tecido conjuntivo. Pele, por exemplo, é cerca de 75% de colágeno, colágeno e, portanto, tem um papel vital em muitos processos, tais como a cicatrização de feridas. A produção de colágeno ou mineralização são a base para a formação de cartilagem, tendões ou ossos. Células em todos os outros tecidos do corpo também são cercados por finas estruturas de colágeno através da matriz extracelular, assim colágeno tem um papel vital também na proliferação celular, migração e diferenciação.

O colágeno é uma família de cerca de 20 proteínas relacionadas, que formam hélices triplas através de três cadeias polipeptídicas enrolamento em torno de si em uma estrutura de corda-like. Esses triple-stranded de tamanho nanométrico protofibrilas pode ligar para formar diferentes tipos de estruturas de nível superior. As fibras de colágeno dura formada por colágeno tipo 1 dar tendões ou ligamentos sua alta resistência à tração, mas outros tipos de colágeno forma menor, ou mais estruturas ramificadas na matriz extracelular. Colágeno está envolvida na estrutura ou função de muitos tecidos, por isso há muitas doenças associadas com mau funcionamento de colágeno. Um defeito genético chamado síndrome de Alport afetando colágeno tipo IV, por exemplo, causa mau funcionamento dos glomérulos nos rins, bem como problemas nos olhos e ouvidos, e geralmente leva à insuficiência renal.

A estrutura das fibrilas de colágeno tipo 1 é esboçado esquematicamente na Figura 1. Três cadeias polipeptídicas vento para formar uma estrutura rígida helicoidal. Estas moléculas de colágeno em seguida, alinhe ao longo do eixo da hélice e do grupo como um pacote para formar as fibrilas de colágeno. Estas fibrilas de colágeno também pode alinhar lateralmente para formar pacotes em uma ordem superior de estrutura e compõem a duras fibras micro-empresas de colágeno encontradas em ligamentos. Uma característica das fibrilas de colágeno é a sua estrutura em faixas. O diâmetro das mudanças fibrilas ligeiramente ao longo do comprimento, com uma alta reprodutibilidade repetir D-band de cerca de 67nm.

Figura 1. Diagrama esquemático da estrutura do tipo I fibrilas de colágeno. Moléculas de colágeno forma helicoidal de três cadeias polipeptídicas, e estas associar lateralmente para formar fibrilas de colágeno com uma estrutura característica em faixas.

Além de sua função natural do corpo, o colágeno também tem sido utilizado em aplicações técnicas e médicas como uma superfície modelo fisiológico para cultura de células, biocompatibilidade do implante e crescimento celular dirigido.

Tecido colágeno formado naturalmente

O clássico estruturas banded fibrilas pode ser visto claramente no colágeno de ratos de cauda, ​​o que demonstra o alto grau de estrutura e regularidade possível em fibras colágenas. A Figura 2 mostra a altura e as imagens de deflexão vertical das fibras de colágeno de ratos de cauda, ​​para um 2 2 micron x área de digitalização. Nesta imagem, muitas das fibras são paralelas ao outro, embora alguns são cruzados no canto inferior esquerdo. A imagem de seção transversal abaixo mostra uma seção ao longo do eixo central de fibras. Os marcadores vermelhos são 1.345 nm de distância, o que corresponde a 20 D-band repete. Isto dá um valor para esta amostra de 67,3 nm para o período de repetição. Mudanças no período de repetição devido a várias mutações pode ser importante para medir com precisão.

Figura 2. Altura e imagens de deflexão vertical de um 2 x 2 micron área de digitalização de uma amostra de colágeno de ratos de cauda. A secção transversal mostra 20 repetições do D-banding período marcado com linhas vermelhas, dando uma média de 67,3 nm.

A Figura 3 mostra menor scans (600 x 600 nm) da área de uma mesma amostra, mais uma vez altura e sinais de deflexão vertical, para mostrar a estrutura de ordem superior que é visível. A terceira imagem é parte da verificação de altura depois de ter sido high-pass filtrado para remover a curvatura do fundo da fibra. Isto mostra as características mais pequenos de forma mais clara, ea imagem de seção transversal mostra o espaçamento das pequenas estruturas na superfície. A escala de altura para a secção transversal não é absoluta, uma vez que a curvatura da fibra de fundo foi removido. O tamanho laterais das características é de cerca de 7 nm. Características exemplo são marcadas com linhas vermelhas com uma separação de 6,7 nm.

Figura 3. Altura e imagens de deflexão vertical de uma área de 600 x 600 nm de um rato de colágeno fibrilar. Além dos transversal de bandas, também há estrutura visível em toda a fibra, como mostra a secção transversal na parte inferior.

Depositado fibrilas de colágeno - Substratos de Estudos de células ósseas

Fibrilas de colágeno isolado de uma amostra de tendão bovino (depositados em baixa densidade em APTES revestido de vidro) são mostrados na Figura 4. As imagens são cortesia do Prof M. Horton, Bone Mineral e Centro de University College London e do London Centre for Nanotechnology. A imagem ótica (em cima) mostra o cantilever de AFM e as fibrilas de colágeno maior também são visíveis através de contraste de fase óptica. As duas grandes imagens AFM mostram sinais de altura e de deflexão vertical para um 100 100 micron x área de digitalização. A maioria das fibrilas de forma suave curva estruturas. Uma pequena (5 x 5 micron) de digitalização também é mostrado como uma imagem 3D de altura, onde a periodicidade fibrilas pode ser visto.

Figura 4. Fibrilas de colágeno no tendão bovino APTES de vidro, imagens de cortesia do Prof M. Horton, Bone Mineral e do Centro de UCL e London Centre for Nanotechnology. Óptico de contraste de fase (superior), 100 x 100 mícron de altura área de digitalização e de deflexão de imagens AFM (centro), e 5 x 5 micron altura da imagem 3D (baixo).

Estruturas de colágeno no osso Natural

Apesar da estabilidade, aparentemente, de osso, de fato o osso no esqueleto de um ser humano vivo está constantemente sendo remodelada. Osteoblastos e osteoclastos são células que são responsáveis ​​pela formação e reabsorção do osso, e, juntos, manter um equilíbrio dinâmico no esqueleto de adultos saudáveis. Colágeno tem um papel vital nestes processos, uma vez que forma a estrutura de proteínas estruturais do osso, e também tem um papel na sinalização entre os osteoblastos e osteoclastos.

A Figura 5 mostra imagens de AFM de uma fatia de osso cortical onde a estrutura do colágeno ósseo foi revelado pelos osteoclastos remoção de colágeno e minerais. Fibras de colágeno lateralmente associado com clara D-bandas são vistos na topografia e imagens de erro. Uma lacuna osteócito é visto dentro do osso (anéis). Cortesia de imagens de Bozec e Horton, UCL e London Centre for Nanotechnology. As imagens AFM mostram uma alta de 4 x 4, com área de micron um nm 521 z-range para a imagem de altura e um zrange 300 mV para a imagem de deflexão. A imagem inferior mostra um 3-D de zoom projeção altura na lacuna osteócito, o pit reabsorção formado pela remoção de colágeno e minerais. Utilizando o AFM, o arranjo fibrilar, periodicidade e diâmetro pode ser medido estatisticamente, dando a possibilidade de estudar diferenças sutis entre os tecidos saudáveis ​​ou doentes.

Figura 5. Estrutura do colágeno ósseo revelada por osteoclastos remoção de colágeno e minerais a partir de uma fatia de osso cortical. Cortesia de imagens de Bozec e Horton, UCL e do Centro de Londres para Nan tecnologia. 4 x 4 micron área de digitalização para os dois grandes imagens AFM (521 nm altura z-range, 300mV imagem deflexão z-range). 3-D de zoom projeção da altura na lacuna osteócito.

Depositado Film colágeno para implantes

Vários métodos foram desenvolvidos para depósito de colágeno em materiais para formar superfícies biocompatíveis, ou para o crescimento celular dirigido. O colágeno pode ser adsorvido relativamente direta em superfícies como o vidro, mas é mais difícil atribuir colágeno estavelmente para materiais sintéticos como silicone. Esses tipos de estruturas mistas podem ser usados ​​para promover a cicatrização de feridas e melhorar a biocompatibilidade de materiais para implantes, particularmente enxertos vasculares. O colágeno reticulado pode ser tratada com moléculas como a heparina para reduzir a ativação trombose, ou fator de crescimento fibroblástico para promover a semeadura de células endoteliais.

As imagens na Figura 6 mostram uma visão geral 10 x 10 mícrons de uma amostra de colágeno revestidos por película de silicone (cortesia amostra de MJB Wissink, Universidade de Twente, Holanda). A amostra foi fotografada em solução tampão fosfato salino (PBS) (altura e imagens amplitude para o modo de contato intermitente em líquido). As fibrilas de colágeno maior pode ser visto deitado em uma suave matriz. O colágeno é muito suave no estado líquido, pois contém uma alta proporção de água.

Figura 6. Imagem em modo intermitente contato no líquido (10 x 10 microns) de um filme de colágeno revestido silicone. Cedida pela amostra de MJB Wissink, Universidade de Twente, na Holanda.

Em imagens menores, os detalhes da estrutura D-bandas pode ser visto. Amplitude, altura e fase de imagens de uma mesma amostra são mostrados na Figura 7 para uma menor área de varredura (2 x 2 microns). A D-bandas pode ser visto em todas as três imagens para as fibras de colágeno, que estão mentindo na diagonal da imagem na matriz de fundo. Embora a camada de colágeno todo é muito suave, a 67 nm de bandas pode ser visto claramente.

Figura 7. 2 x 2 micron scan modo intermitente de contato de silicone collagencoated em tampão (cortesia amostra de MJB Wissink, Universidade de Twente, Holanda).

Alinhados Layers colágeno e Crescimento Celular Direção

Moléculas de colágeno podem ser montados e adsorvido em mica suporta para revestir a superfície uniformemente em uma camada (~ 3 nm) fino e liso. Cerca de cinco moléculas de colágeno individuais associar microfibrilas forma, com um tamanho de cerca de 3-5 laterais nm. A monocamada destas microfibrilas pode ser adsorvido à superfície para formar uma superfície nanoestruturada biologicamente ativos. Essas microfibrilas também são susceptíveis de ser uma etapa intermediária na formação das fibras de colágeno maior visto em tecido natural.

O primeiro nível de organização é alinhar as fibrilas de colágeno a fim de que há uma orientação geral na camada superficial, que pode ser conseguido através de adsorção sob condições de fluxo hidrodinâmico. Dentro de um certo tempo após a deposição, a orientação também pode ser manipulada usando a ponta do AFM. Figura 8 mostra um 750 x 750 nm contato intermitente altura da imagem modo de colágeno unfixed em tampão (z-range 5,5 nm). A amostra é cortesia de A. Taubenberger, DJ Müller Cellular Machines grupo, Universidade Técnica de Dresden. As fibras são todos orientados na mesma direção, e os 67 nm D-repeat pode ser visto nas fibras individuais. Neste caso não há alinhamento de grande escala do D-repeat entre fibrilas adjacentes.

Figura 8. Imagem em modo intermitente de contato de colágeno unfixed em tampão (750 x 750 nm, z-range 5,5 nm). Cedida pela amostra de A. Taubenberger, DJ Müller Cellular Machines grupo, TU Dresden.

Um nível maior de organização pode ser alcançado se o Drepeat bandas das microfibrilas de colágeno também está alinhada, como em tecido natural. O alinhamento ou não-alinhamento das repete D-é sensível à composição iônica do tampão de deposição, e alinhamento é visto em soluções simulando ambientes citoplasmática ou extracelular de células eucarióticas. Na altura e imagens de deflexão vertical mostrado na Figura 9, as moléculas têm sido depositados para que haja um alinhamento geral das bandas Drepeat de fibrilas de colágeno adjacentes. As imagens da Figura 10 são cortesia de A. Taubenberger, DJ Müller Cellular Machines grupo, TU Dresden. Nesta amostra, o colágeno não cobrir completamente a superfície e as lacunas podem ser vistas onde a superfície de vidro é visível abaixo.

Figura 9. Alinhados fibrilas de colágeno unfixed em líquido. Cortesia de imagens de A. Taubenberger, DJ Müller Cellular Machines grupo, TU Dresden.

Estas superfícies têm algumas das propriedades das fibras de colágeno nanoestrutural natural, previsto como uma fina camada. O alinhamento do D-repete também produz uma superfície bioativa. Células de fibroblastos cultivados sobre o colágeno, onde as fibras são orientadas, mas não alinhadas, não mostram nenhuma orientação particular de sua forma ou direção de crescimento. Quando o Drepeats também estão alinhados, no entanto, os fibroblastos mostrar motilidade altamente orientado ao longo da direção do eixo, e tem uma forma alongada nesta direção. A textura da superfície causado pelo grande escala orientação das fibrilas sozinho não foi suficiente para controlar a motilidade celular, e isso sugere uma função biológica para o alinhamento D-band para orientar o crescimento celular.

Conclusões

O AFM é uma ferramenta poderosa para a observação dos níveis do alinhamento e organização das estruturas de colágeno. Estruturas do colágeno natural, fibrilas isoladas e novos biomateriais podem ser estudadas em condições fisiológicas. Essas medições podem iluminar questões biológicas fundamentais, bem como testar novos compostos bioativos biocompatível ou especificamente.

Fonte: Instrumentos JPK

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