NanoWizard II giver for første gang ægte integration af optiske og Atomic Force Microscopy ved JPK Instruments

:: AZoNanotechnology artikel

Emner Overdækket

Indledning
Integration af Atomic Force Microscope og Inverted Light Microscope
CoverslipHolder og BioCell Designet til at optimere billedkvalitet
Piezos i JPK Instruments
Test af Kalibrering af optiske billeder
Konklusion

Indledning

Atomic force mikroskopi (AFM) og optisk mikroskopi, bl.a. fluorescens mikroskopi, gøre en stærk kombination i studiet af biologiske prøver. AFM er ikke omfattet af Abbe beslutning grænse, og kan generere billeder med en meget højere opløsning end lys mikroskopi. Men som kontrast er genereret som reaktion på strukturelle egenskaber ved prøve, kan det være udfordrende at opdage bestemte strukturer i en heterogen prøve, som en celle. Ved at kombinere de to teknikker, kan højere opløsning strukturel information kan genereres ved hjælp af AFM. Efterfølgende korrelation med fluorescens-mærkede markører kan give oplysninger om sammensætning, og dermed funktionen af ​​de identificerede strukturer.

Integration af Atomic Force Microscope og Inverted Light Microscope

Designet af NanoWizard ® og NanoWizard ® II AFM fra JPK er sådan, at atomic force mikroskop er integreret i en omvendt lysmikroskop, uden at påvirke dets funktionalitet. Dette giver AFM imaging at blive kombineret med kontrast teknikker, herunder fasekontrast, DIC, laser scanning konfokal og TIRF mikroskopi. En vigtig faktor i effekten af denne integration er, at JPK instrumenter er tip-scannere. Det vil sige, i løbet af AFM imaging prøven holdes stille, mens spidsen bevæger sig i raster mode over overfladen for at bygge billedet. I tilfælde af prøve-scanning instrumenter, er den prøve, som skal afbildes hele tiden bevæger sig i optisk mikroskopi billedet, mens AFM scanning er i gang, hvilket betyder, at sand samtidige billeddannelse ikke er virkelig muligt (figur 1).

Figur 1. Tip scanner vs prøve scanner. Købet af epifluorescerende billeder under AFM billede overtagelse med en spids scanner (A) og en prøve scanner (B). Da prøven bevæger sig i (B) fluorescerende strukturer ikke længere kan afbildet uden udtværing. Det samme celle er vist på begge billeder.

CoverslipHolder og BioCell Designet til at optimere billedkvalitet

Selv om disse hardware-design funktioner er starten på at give ægte integration er der også andre faktorer, der skal behandles. Den første er prøven bruges indehaveren. Som AFM og optisk mikroskopi er fundamentalt forskellige teknikker (det ene er baseret på fysiske interaktion og den anden på diffraktion af lys), er der forskellige krav til effektiv prøve understøtter. Til erhvervelse af høj kvalitet optiske billeder, især med høj forstørrelse linser (63x og 100x), er det bedst at bruge meget tyndt cover-glas med en tykkelse på omkring 170 μm.

På den anden side, som AFM imaging er meget følsomt over for fysisk ustabilitet må støtte til sådanne billeddannelse være meget stabil. Med disse to grundlæggende krav i tankerne, JPK designede CoverslipHolder og BioCell ™ (Figur 2). Begge disse prøveholdere er designet til at holde dækglas for kompromisløs, kombineret AFM og lysmikroskopi billeddannelse. Som sådan, med innovative prøveholdere og den grundlæggende udformning af JPK instrumenter , kan samtidige, høj kvalitet AFM og lys mikroskopi billeder skal erhverves. Men vær lige integreres har vi nu indført DirectOverlay ™-funktionen (patentanmeldt), en software løsning, der involverer kalibrering af optiske billedet og integration i SPM-softwaren.

Figur 2. Den Biocell ™ er designet til at optimere billedkvaliteten under eksperimenter kombinere AFM og lys mikroskopi, mens på samme tid tillader temperaturkontrol. Peltier elementer mulighed for hurtig justering af temperaturen.

Piezos i JPK Instruments

Som optisk mikroskopi er baseret på brugen af ​​linser, vil eventuelle afvigelser i sådanne objektiver føre til forvridninger i det endelige billede. Men da piezos i JPK instrumenter er lineariseret AFM billedet er præcis til 4A i x-og y-retninger. Som sådan, AFM billede og lysmikroskopi billedet i de fleste tilfælde ikke nøjagtigt overlay, med shear eller stræk i den optiske billedet et fælles problem.

Da AFM billedet er genereret ved hjælp af meget præcise lineariseret piezos det kan betragtes som "real-space". Derudover, som det cantilever anvendes til AFM imaging kan flyttes til faste punkter, såvel som raster-scannes hen over overfladen, kan det bruges til at kalibrere optisk billede. Kort sagt er cantilever flyttet til et sæt af 25 point i realspace ved hjælp af piezos. Ved hvert punkt et optisk billede er erhvervet og efterfølgende spidsen placering inden for optisk billedstabilisering bestemmes automatisk. En omdanne funktion er herefter beregnet ved hjælp af begge sæt af 25 point, og denne transformere anvendes på den optiske billedet, som det er importeret til SPM-softwaren. På en sådan måde Optical Image er kalibreret og importeres til SPM miljø, i en automatiseret proces.

Test af Kalibrering af optiske billeder

For at teste kalibrering af optiske billedet, var 50 nm selvlysende perler filmede med både AFM og epifluorescence og både untransformed og forvandlet optiske billeder sammenlignet med AFM. Det ses, at der er en forskydning i højre side af untransformed optiske billede (figur 3). Når kalibreringen er blevet anvendt, dog overlay mellem fluorescerende og topografiske signaler er præcis (figur 4).

Figur 3. Overlejring af topografi (rød) og untransformed fluorescens (grøn) billeder af 50Nm perler. Den nederste panel er et sæt af digitale zoom i de markerede områder. Mens der i de første to af zoomet regioner overlay er god, i panel 3 Der er en forskydning af det optiske billede.

Figur 4. Overlejring af topografi (rød) og untransformed fluorescens (grøn) billeder af 50Nm perler. Det samme område, der blev afbildet i figur 3 er vist her. I alle zoomet regioner overlay er nu præcis.

Fordelene ved en sådan software funktion er omfattende. For eksempel var der i sammenligningen af ​​fluorescens og AFM billeder må ikke være let at identificere faste punkter i de to billeder til at foretage en sådan forvandling offline, og heller ikke til overlay kanterne. Som det fremgår af figur 5, overlejring af AFM billedet af en REF52 fibroblast (stabilt transficeret med YFP-paxillin) og de tilsvarende fluorescens billede af de centrale sammenvoksninger, der ikke er nogen punkter i begge billeder, der nemt kan identificeres til brug i præcist kortlægning et billede til den anden.