NanoWizard II Lässt Erstes Mal-Wahre Integration der Optischen und AtomKraft-Mikroskopie durch JPK-Instrumente zu

Themen Umfaßt

Einleitung
Integration des AtomKraft-Mikroskops und des Umgekehrten Lichtmikroskops
CoverslipHolder und BioCell Konstruierten, Bild-Qualität Zu Optimieren
Piezos in JPK-Instrumenten
Prüfung der Kalibrierung der Optischen Bilder
Schlussfolgerung

Einleitung

Atomkraftmikroskopie (AFM) und optische Mikroskopie, insbesondere Fluoreszenzmikroskopie, machen eine starke Kombination in der Studie von biologischen Proben. FLUGHANDBUCH ist nicht abhängig von Auflösungsgrenze des Abbes und kann Bilder mit einer viel höheren Auflösung als Lichtmikroskopie erzeugen. Jedoch während Kontrast in Erwiderung auf die strukturellen Eigenschaften der Probe erzeugt wird, kann es schwierig sein, spezifische Zellen in einer heterogenen Probe, wie einer Zelle zu entdecken. Indem man die zwei Techniken, können strukturelle kombiniert Informationen der höheren, Auflösung unter Verwendung FLUGHANDBUCHS erzeugt werden. Nachfolgende Wechselbeziehung mit Leuchtstoff beschrifteten Markierungen kann Informationen über die Zusammensetzung und infolgedessen die Funktion, der gekennzeichneten Zellen zur Verfügung stellen.

Integration des AtomKraft-Mikroskops und des Umgekehrten Lichtmikroskops

Die Auslegung des NanoWizard® und NanoWizard®II FLUGHANDBUCHS von JPK ist so, dass das Atomkraftmikroskop in ein umgekehrtes Lichtmikroskop integriert ist, ohne seine Funktionalität zu beeinflussen. Dieses erlaubt, dass FLUGHANDBUCH-Darstellung mit Kontrasttechniken einschließlich Phasenkontrast, DIC kombiniert wird, Laserscannen confocal und TIRF-Mikroskopie. Ein wichtiger Faktor in der Wirksamkeit dieser Integration ist, dass die JPK-Instrumente Spitzescanner sind. Das heißt, während FLUGHANDBUCH-Darstellung wird die Probe noch angehalten, während die Spitze auf Rasterform über der Oberfläche sich bewegt, um das Bild aufzubauen. Im Falle Probescannen Instrumente bewegt sich die Probe, zum abgebildet zu sein ständig in die optische Mikroskopieabbildung, während FLUGHANDBUCH-Scannen im Gang ist, Bedeutung, dass wahre simultane Darstellung nicht wirklich möglich ist (Abbildung 1).

Abbildung 1. Spitzenscanner gegen Beispielscanner. Die Datenerfassung von epifluorescent Bildern während der FLUGHANDBUCH-Bilddatenerfassung mit einem Spitzenscanner (a) und einem Beispielscanner (b). Während die Probe in (b) sich bewegt, können die Leuchtstoffzellen abgebildet nicht mehr sein, ohne zu schmieren. Die gleiche Zelle wird in beiden Bildern gezeigt.

CoverslipHolder und BioCell Konstruierten, Bild-Qualität Zu Optimieren

Während diese KleinteilAusrüstungsbeschreibungen der Anfang der Lieferung der wahren Integration sind, gibt es auch andere Faktoren, die adressiert werden müssen. Das erste ist die verwendete Beispielhalterung. Da FLUGHANDBUCH und optische Mikroskopie grundlegend verschiedene Techniken sind (eine, die auf Interaktion basieren und die andere auf der Beugung der Leuchte) gibt es verschiedene Anforderungen für effektive Beispielhalterungen. Für die Datenerfassung von optischen Bildern der hohen Qualität, besonders mit hohen Vergrößerungsobjektiven (63x und 100x) ist es am besten, sehr dünnes Abdeckungglas mit einer Stärke von µm herum 170 zu verwenden.

andererseits da FLUGHANDBUCH-Darstellung für körperliche Instabilität sehr empfindlich ist, muss die Halterung für solche Darstellung sehr stabil sein. Mit diesen zwei grundlegenden Anforderungen im Verstand, konstruierte JPK das CoverslipHolder und das BioCell™ (Abbildung 2). Beide Beispielhalterungen werden konstruiert, um Deckgläser für uncompromised, kombiniertes FLUGHANDBUCH und Lichtmikroskopiedarstellung anzuhalten. Als solches mit innovativen Beispielhalterungen und der grundlegenden Auslegung der JPK-Instrumente, können simultanes, der hohen Qualität FLUGHANDBUCH und Lichtmikroskopiebilder erworben werden. Jedoch um wirklich integriert haben wir zu sein jetzt das DirectOverlay™-Merkmal (schwebend), eine Software-Lösung vorgestellt, die Kalibrierung des optischen Bildes und Integration in die SPM-Software miteinbezieht.

Abbildung 2. Das Biocell™ wird konstruiert, um Bildqualität während der Experimente zu optimieren, die FLUGHANDBUCH und Lichtmikroskopie beim gleichzeitig Erlauben des Temperaturreglers kombinieren. Peltier-Elemente erlauben schnelle Einstellung der Temperatur.

Piezos in JPK-Instrumenten

Da optische Mikroskopie auf dem Gebrauch der Objektive basiert, führen alle mögliche Abweichungen in solchen Objektiven zu Verzerrungen im abschließenden Bild. Jedoch da die piezos in den JPK-Instrumenten linearisiert werden, ist das FLUGHANDBUCH-Bild zu 4Å in den x- und o-Richtungen genau. Als solches in den meisten Fällen überlagern das FLUGHANDBUCH-Bild und das Lichtmikroskopiebild nicht genau, mit Schere oder Ausdehnung im optischen Bild ein geläufiges Problem.

Während das FLUGHANDBUCH-Bild unter Verwendung der sehr genauen linearisierten piezos erzeugt wird, kann es als „Realraum“ behandelt werden. Zusätzlich während der Kragbalken, der für FLUGHANDBUCH-Darstellung verwendet wird, auf Fixpunkte verschoben werden, sowie über der Oberfläche Raster-gescannt werden kann, kann es verwendet werden, um das optische Bild zu kalibrieren. Kurz Gesagt wird der Kragbalken auf ein Set von 25 Punkten im realspace, unter Verwendung der piezos verschoben. An jedem Punkt wird ein optisches Bild erworben und nachfolgend wird der Spitzeneinbauort innerhalb des optischen Bildes automatisch bestimmt. Eine Umwandlungsfunktion wird dann unter Verwendung beider Sets von 25 Punkten berechnet, und diese wandeln wird angewendet am optischen Bild um, während es in die SPM-Software importiert wird. Auf solch eine Art wird das optische Bild in die SPM-Umgebung, in einem automatisierten Prozess kalibriert und importiert.

Prüfung der Kalibrierung der Optischen Bilder

Um die Kalibrierung des optischen Bildes zu prüfen, waren 50 Leuchtstoffraupen nm unter Verwendung FLUGHANDBUCHS und des epifluorescence und die untransformed und umgewandelten optischen Bilder abgebildet, die mit dem FLUGHANDBUCH verglichen wurden. Es kann gesehen werden, dass es eine Schere in der rechten Seite des untransformed optischen Bildes gibt (Abbildung 3). Sobald das Kalibrierverfahren, jedoch angewendet worden ist, ist die Überlagerung zwischen den Leuchtstoff und topographischen Signalen genau (Abbildung 4).

Stellen Sie 3.Overlay der Topographie (rot) und der untransformed (grünen) Bilder der Fluoreszenz der Raupen 50nm dar. Die Unterschale ist ein Set von digitalem laut summt von den markierten Regionen. Während in den ersten zwei der laut gesummten Regionen die Überlagerung gut ist, in Panel 3 gibt es eine Schere des optischen Bildes.

Stellen Sie 4.Overlay der Topographie (rot) und der untransformed (grünen) Bilder der Fluoreszenz der Raupen 50nm dar. Der gleiche Bereich, der in Abbildung 3 abgebildet war, wird hier gezeigt. In allen laut gesummten Regionen ist die Überlagerung jetzt genau.

Der Nutzen solch einer Programmiereinrichtung ist umfangreich. Zum Beispiel im Vergleich der Fluoreszenz und DER FLUGHANDBUCH-Bilder gibt möglicherweise es nicht leicht gekennzeichnete Fixpunkte innerhalb der zwei Bilder, zum off-line Leiten solch eine Transformation, noch der Ränder sogar zu überlagern. Wie in Abbildung 5 gesehen, sind die Überlagerung des FLUGHANDBUCH-Bildes eines Fibroblasts REF52 (stabil transfected mit YFP-paxillin) und das entsprechende Fluoreszenzbild der fokalen Beitritte, dort keine Punkte in beiden Bildern, die für Gebrauch leicht gekennzeichnet werden können, wenn man genau ein Bild zum anderen abbildet.

Stellen Sie 5.Overlay der Fluoreszenz und der Topographie der Zellen des Fibroblasts REF52 dar. Im Panel ist A das umgewandelte Fluoreszenzbild und B-Topographie. In C wird eine Überlagerung der zwei angezeigt.

In diesem Fall sind die fokalen Beitritte an der basalen Seite die Zelle und das FLUGHANDBUCH-Bild erzeugt ein topograph der Spitzenseite der Zelle. So ist der Gebrauch des Kragbalkens als Hilfsmittel für die Kalibrierung des optischen Bildes wesentlich. In Abbildung 6 wird der Unterschied zwischen dem umgewandelten und nicht-umgewandelten optischen Bild angezeigt. In diesem Fall ist das vorherrschende Artefakt eine Ausdehnung entlang einem Schwerpunkt.

Stellen Sie 6.Overlay eines Bildes dar, das (Rot) und das gleiche Bild in seiner rohen kalibriert worden ist, nicht kalibrierten Form (Grün) wird dargestellt. Es kann offenbar gesehen werden, dass das nicht kalibrierte Bild in eine Richtung ausgedehnt wird.

Zusätzlich kann solch ein Merkmal den Benutzer ein beträchtliche Dauer retten. Während FLUGHANDBUCH hohe Ortsauflösung hat, ist die zeitliche Auflösung der Technik weit niedriger als die der Lichtmikroskopie, wegen der längeren Aufnahmezeit. Mit einem kalibrierten optischen Bild im hinteren Boden der SPM-Software (Abbildung 7), der Bedarf, ein Überblick FLUGHANDBUCH-Bild der Zelle, bevor man auf eine Region von Zinsen, zu erwerben sich konzentriert wird gelöscht. Dieses kann für das Scannen von Regionen einer lebenden Zelle besonders wichtig sein, in der Zeit möglicherweise wichtig ist. Offensichtlich können forcespectroscopy Punkte auf dem optischen Bild auch ausgewählt werden und den Bedarf wieder löschen, ein FLUGHANDBUCH-Bild, bevor man Kraftspektroskopie, zu erwerben beginnt experimentiert. Wenn eine functionalized Spitze verwendet wird, könnte diese kritisches prüfen, als ob ein Scan genommen wird, bevor die Kraftspektroskopie Daten möglicherweise werden erhalten der Spitze passiviert werden und zu falsches Negativ führen, resultieren.

Stellen Sie 7.Import von optischen Bildern in SPM-Software dar. Ein kalibriertes optisches Bild kann in die SPM-Software importiert werden und im Hintergrund angezeigt werden. Dieses erlaubt die Auswahl von den Scan-Regionen und von Kraftspektroskopie Punkten, die auf dem optischen Bild basieren und löscht den Bedarf an einem Überblick FLUGHANDBUCH-Bild.

Schlussfolgerung

Die Änderungen in der Atomkraftmikroskopauslegung, die die zu sie führte, ist Einbau auf einem umgekehrten Lichtmikroskop öffneten die Möglichkeit für die simultane Datenerfassung der Leuchte und DER FLUGHANDBUCH-Bilder, entscheidend für die effektive Untersuchung von Zellen und von biologischen Anlagen in vitro. Jedoch für wahre optische Integration mit FLUGHANDBUCH, wird mehr als gerade das colocalisation der zwei Mikroskope gefordert. Ein Umkippungsscanner ist so wesentlich, dass die Probe noch während FLUGHANDBUCH-Darstellung ist, damit optische Bilder erworben werden können. Beispielhalterungen müssen für beide Formulare von Mikroskopie, d.h. dünne Deckgläser für Lichtmikroskopie und Stabilität für FLUGHANDBUCH-Darstellung optimiert werden. Schließlich muss ein kalibriertes optisches Bild in der FLUGHANDBUCH-Darstellungssoftware erhältlich sein, genaue Überlagerungen zu aktivieren, mit Artefakten von den Abweichungen im optischen gelöschten Bild. Das NanoWizard®II FLUGHANDBUCH liefert alle diese Merkmale und zum ersten Mal erlaubt wahre Integration von Optik und von FLUGHANDBUCH.

Quelle: JPK-Instrumente

Zu mehr Information über diese Quelle besuchen Sie bitte JPK-Instrumente

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:59

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