NanoWizard ΙΙ επιτρέπει για πρώτη φορά την πραγματική ένταξη της οπτικής και μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων από JPK Όργανα

:: AZoNanotechnology άρθρο

Θέματα που καλύπτονται

Εισαγωγή
Ενσωμάτωση της Μικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης και ανεστραμμένο μικροσκόπιο Φως
CoverslipHolder και BioCell Σχεδιασμένο για να βελτιστοποιήσει την ποιότητα εικόνας
Piezos σε JPK Όργανα
Δοκιμή της βαθμονόμησης των Οπτικών Εικόνων
Συμπέρασμα

Εισαγωγή

Μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM) και οπτική μικροσκοπία, ιδίως μικροσκόπιο φθορισμού, καθιστούν έναν ισχυρό συνδυασμό με τη μελέτη των βιολογικών δειγμάτων. AFM δεν υπόκειται σε όριο επίλυση Abbe, και μπορεί να δημιουργήσει εικόνες με πολύ υψηλότερη ανάλυση από ό, τι οπτικό μικροσκόπιο. Ωστόσο, καθώς η αντίθεση που παράγεται σε απάντηση στα διαρθρωτικά χαρακτηριστικά του δείγματος, μπορεί να αποτελέσει πρόκληση για την ανίχνευση ειδικών δομών σε ένα ετερογενές δείγμα, όπως ένα κελί. Με το συνδυασμό των δύο τεχνικών, υψηλότερη ανάλυση διαρθρωτικές πληροφορίες μπορεί να παραχθεί με AFM. Μεταγενέστερες συσχέτιση με fluorescently επονομαζόμενων δείκτες μπορούν να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τη σύνθεση, και, κατά συνέπεια, τη λειτουργία, των αναγνωρισμένων δομών.

Ενσωμάτωση της Μικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης και ανεστραμμένο μικροσκόπιο Φως

Ο σχεδιασμός του NanoWizard ® και NanoWizard ® II AFM από JPK είναι τέτοια ώστε το ατομικό μικροσκόπιο δύναμης είναι ενσωματωμένες σε ένα ανάστροφο μικροσκόπιο φως, χωρίς να επηρεάζεται η λειτουργικότητά του. Αυτό επιτρέπει AFM απεικόνισης πρέπει να συνδυάζεται με τεχνικές αντίθεση συμπεριλαμβανομένων αντίθεσης φάσης, DIC, σάρωση με λέιζερ συνεστιακή και TIRF μικροσκόπιο. Ένας σημαντικός παράγοντας για την αποτελεσματικότητα αυτής της ενοποίησης είναι ότι τα μέσα που JPK είναι tip-σαρωτές. Αυτό είναι, κατά τη διάρκεια της AFM απεικόνισης του δείγματος διατηρείται ακόμα, ενώ το άκρο κινείται στο χώρο της μόδας raster πάνω από την επιφάνεια για να χτίσει την εικόνα. Στην περίπτωση των δειγμάτων σάρωσης όργανα, το δείγμα να είναι imaged συνεχώς κινείται προς την οπτική εικόνα μικροσκόπιο σάρωσης AFM ενώ βρίσκεται σε εξέλιξη, πράγμα που σημαίνει ότι ισχύει και ταυτόχρονη απεικόνιση δεν είναι πραγματικά δυνατή (σχήμα 1).

Σχήμα 1. Συμβουλή σαρωτή σαρωτή δείγμα vs. Η εξαγορά της επιφθορισμού εικόνες κατά τη διάρκεια της λήψης εικόνας AFM με ένα σαρωτή άκρη (A) και ένα σαρωτή δείγματος (Β). Δεδομένου ότι το δείγμα κινείται στο (Β) η φθορίζουσα δομές δεν μπορούν πλέον να απεικονίζεται χωρίς μουντζούρες. Το ίδιο κελί εμφανίζεται και στις δύο εικόνες.

CoverslipHolder και BioCell Σχεδιασμένο για να βελτιστοποιήσει την ποιότητα εικόνας

Ενώ αυτά τα σχεδιαστικά χαρακτηριστικά του υλικού είναι η έναρξη της παροχής πραγματική ένταξη υπάρχουν και άλλοι παράγοντες που πρέπει να αντιμετωπιστούν. Ο πρώτος είναι ο κάτοχος του δείγματος που χρησιμοποιείται. Όπως AFM και οπτική μικροσκοπία είναι ριζικά διαφορετικές τεχνικές (ο ένας να είναι με βάση τη φυσική αλληλεπίδραση και η άλλη για τη διάθλαση του φωτός) υπάρχουν διαφορετικές απαιτήσεις για την αποτελεσματική υποστηρίζει δείγμα. Για την απόκτηση υψηλής ποιότητας οπτικών εικόνων, ιδίως με φακούς υψηλής μεγέθυνσης (63x και 100x) είναι καλύτερο να χρησιμοποιήσετε πολύ λεπτό κάλυμμα από γυαλί πάχους περίπου 170 μm.

Από την άλλη πλευρά, όπως AFM απεικόνισης είναι πολύ ευαίσθητα σε φυσική αστάθεια, η υποστήριξη για τέτοια απεικόνισης πρέπει να είναι πολύ σταθερό. Με αυτές τις δύο θεμελιώδεις απαιτήσεις στο μυαλό, JPK σχεδίασε το CoverslipHolder και το BioCell ™ (Σχήμα 2). Και οι δύο κάτοχοι του δείγματος έχουν σχεδιαστεί για να κρατήσει καλυπτρίδες για την χωρίς συμβιβασμούς σε συνδυασμό, ΑΦΜ και το φως απεικόνισης μικροσκόπιο. Ως εκ τούτου, με την πρωτοποριακή τους κατόχους του δείγματος και ο βασικός σχεδιασμός των μέσων JPK , ταυτόχρονα, υψηλής ποιότητας AFM και ελαφριά μικροσκόπηση εικόνες μπορούν να αποκτηθούν. Ωστόσο, για να είναι πραγματικά ολοκληρωμένη έχουμε εισαγάγει τώρα το DirectOverlay ™ χαρακτηριστικό (ευρεσιτεχνία), μια λύση λογισμικού που περιλαμβάνει τη βαθμονόμηση της οπτικής εικόνας και ενσωμάτωση του λογισμικού SPM.

Σχήμα 2. Η Biocell ™ έχει σχεδιαστεί για να βελτιστοποιήσει την ποιότητα της εικόνας κατά τη διάρκεια πειραμάτων που συνδυάζει AFM και το φως, ενώ μικροσκόπιο την ίδια στιγμή που επιτρέπει τον έλεγχο της θερμοκρασίας. Peltier στοιχεία που επιτρέπουν την ταχεία προσαρμογή της θερμοκρασίας.

Piezos σε JPK Όργανα

Όπως οπτική μικροσκοπία βασίζεται στη χρήση των φακών, κάθε εκτροπές σε τέτοιες φακούς θα οδηγήσει σε στρεβλώσεις στην τελική εικόνα. Ωστόσο, επειδή η piezos στις πράξεις JPK είναι γραμμικοποιημένη την εικόνα AFM είναι ακριβές να 4α στον x και y κατεύθυνση. Ως εκ τούτου, στις περισσότερες περιπτώσεις την εικόνα AFM και το φως της εικόνας μικροσκόπιο δεν με ακρίβεια επικάλυψη, με την κουρά ή τέντωμα στην οπτική εικόνα ένα κοινό πρόβλημα.

Καθώς η εικόνα AFM δημιουργείται χρησιμοποιώντας πολύ ακριβής γραμμικοποιημένη piezos μπορεί να αντιμετωπίζεται ως «πραγματικό χώρο". Επιπλέον, όπως του προβόλου που χρησιμοποιούνται για την AFM απεικόνισης μπορεί να μετακινηθεί σε σταθερά σημεία, καθώς και ράστερ-σαρωθεί πάνω από την επιφάνεια, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη βαθμονόμηση των οπτικών εικόνων. Με λίγα λόγια, το cantilever μετακινηθεί σε ένα σύνολο 25 μονάδες σε realspace, χρησιμοποιώντας το piezos. Σε κάθε σημείο μια οπτική εικόνα έχει αποκτηθεί και στη συνέχεια τη θέση άκρη στο εσωτερικό της οπτικής εικόνας καθορίζεται αυτόματα. Μια συνάρτηση μετατρέψει υπολογίζεται στη συνέχεια με τα δύο σύνολα 25 μονάδες, και αυτό μετασχηματισμός εφαρμόζεται με την οπτική εικόνα που εισάγεται στο λογισμικό SPM. Με αυτόν τον τρόπο η οπτική εικόνα είναι βαθμονομημένη και εισάγονται στο περιβάλλον SPM, σε μια αυτοματοποιημένη διαδικασία.

Δοκιμή της βαθμονόμησης των Οπτικών Εικόνων

Προκειμένου να ελεγχθεί η βαθμονόμηση της οπτικής εικόνας, 50 nm φθορισμού χάντρες απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας τόσο Α.Φ.Μ. και επιφθορισμού και τόσο το αμεταμόρφωτος και η μετατροπή οπτικών εικόνων σε σύγκριση με την AFM. Μπορεί να θεωρηθεί ότι υπάρχει διάτμησης στη δεξιά πλευρά του αμεταμόρφωτος οπτική εικόνα (εικόνα 3). Μόλις η διαδικασία βαθμονόμησης έχει εφαρμοστεί, ωστόσο, η επικάλυψη μεταξύ του φθορισμού και τοπογραφικά σήματα είναι ακριβές (εικόνα 4).

Σχήμα 3. Επικάλυψη της τοπογραφίας (κόκκινο) και αμεταμόρφωτος φθορισμού (πράσινο) εικόνες των 50nm χάντρες. Το κάτω πάνελ είναι ένα σύνολο από ψηφιακό zoom, των σημειώνονται περιοχές. Ενώ στις δύο πρώτες του μεγεθύνεται περιοχές της επικάλυψης είναι καλή, στον Πίνακα 3 είναι υπάρχει διάτμηση της οπτικής εικόνας.

Σχήμα 4. Υπέρθεση της τοπογραφίας (κόκκινο) και αμεταμόρφωτος φθορισμού (πράσινο) εικόνες των 50nm χάντρες. Η ίδια περιοχή που απεικονίστηκαν στο Σχήμα 3 παρουσιάζεται εδώ. Σε όλες τις περιοχές μεγέθυνση της επικάλυψης είναι πλέον ακριβής.

Τα οφέλη από ένα τέτοιο χαρακτηριστικό του λογισμικού είναι εκτενείς. Για παράδειγμα, κατά τη σύγκριση του φθορισμού και AFM εικόνες μπορεί να μην υπάρχει εντοπιστούν εύκολα σταθερά σημεία εντός των δύο εικόνες για να γίνει μια τέτοια μετατροπή offline, ούτε καν για να επικαλύψει τις άκρες. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5, η επικάλυψη της εικόνας AFM ενός ινοβλαστών REF52 (σταθερά επιμολυσμένα με YFP-paxillin) και το αντίστοιχο φθορισμού εικόνα του εστιακό συμφύσεις, δεν υπάρχουν σημεία και στις δύο εικόνες που μπορεί εύκολα να προσδιοριστεί για χρήση στην ακρίβεια χαρτογράφηση μία εικόνα στην άλλη.

Σχήμα 5. Επικάλυψη του φθορισμού και της τοπογραφίας της REF52 κύτταρα ινοβλαστών. Σε πίνακα Α είναι η εικόνα μετατρέπεται φθορισμού και τοπογραφία Β. Σε C μια επικάλυψη των δύο εμφανίζεται.

Στην περίπτωση αυτή το εστιακό συμφύσεις είναι στη βασική πλευρά του κυττάρου και την εικόνα AFM δημιουργεί ένα topograph της ακρορριζικής πλευρά του κελιού. Έτσι, η χρήση του προβόλου ως εργαλείο για τη βαθμονόμηση της οπτικής εικόνας είναι απαραίτητη. Στην εικόνα 6 η διαφορά μεταξύ του μεταμορφώνεται και μη μετατραπεί οπτική εικόνα εμφανίζεται στην οθόνη. Στην περίπτωση αυτή, η κυρίαρχη τεχνούργημα είναι ένα τέντωμα κατά μήκος ενός άξονα.

Σχήμα 6. Επικάλυψη του μια εικόνα που έχει βαθμονομηθεί (κόκκινο) και την ίδια εικόνα σε πρώτες uncalibrated, του μορφή (πράσινο) παρουσιάζεται. Δεν μπορεί σαφώς να δει ότι η uncalibrated εικόνα είναι τεντωμένο προς μία κατεύθυνση.

Επιπλέον, ένα τέτοιο χαρακτηριστικό μπορεί να σώσει τον χρήστη ένα σημαντικό χρονικό διάστημα. Ενώ AFM έχει υψηλή χωρική ανάλυση, η χρονική ανάλυση της τεχνικής είναι πολύ χαμηλότερη από εκείνη του φωτός μικροσκοπία, λόγω του μεγαλύτερου χρόνου απόκτησης. Με ένα βαθμονομημένο οπτική εικόνα στο πίσω μέρος του εδάφους του λογισμικού SPM (Σχήμα 7), την ανάγκη να αποκτήσει μια συνολική εικόνα AFM εικόνα του κυττάρου πριν με επίκεντρο μια περιοχή ενδιαφέροντος έχει αφαιρεθεί. Αυτό μπορεί να είναι ιδιαίτερα σημαντική για την σάρωση των περιφερειών ενός ζωντανού κυττάρου, όπου ο χρόνος μπορεί να είναι σημαντική. Προφανώς, τα σημεία forcespectroscopy μπορεί επίσης να επιλεγεί για την οπτική εικόνα, και πάλι αίροντας την ανάγκη να αποκτήσει μια εικόνα AFM πριν από την έναρξη ισχύος-φασματοσκοπίας πειράματα. Όταν ένα functionalized άκρη χρησιμοποιείται αυτό θα μπορούσε να αποδειχθεί κρίσιμης σημασίας, καθώς αν η σάρωση πραγματοποιείται πριν από την δύναμη-φασματοσκοπία δεδομένων επιτυγχάνεται η κορυφή μπορεί να είναι αδρανοποιημένα, που οδηγεί σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.

Σχήμα 7. Εισαγωγή των οπτικών εικόνων σε λογισμικό SPM. Ένα βαθμονομημένο οπτική εικόνα μπορεί να εισαχθεί στην λογισμικού SPM και εμφανίζεται στο παρασκήνιο. Αυτό επιτρέπει την επιλογή των περιφερειών σάρωσης και δύναμη-φασματοσκοπία πτυχές με βάση την οπτική εικόνα, καταργώντας την ανάγκη για τη συνολική εικόνα AFM.

Συμπέρασμα

Οι αλλαγές σε ατομικό σχεδιασμό μικροσκόπιο δύναμης που οδήγησε στην εγκατάσταση είναι σε μικροσκόπιο ανάστροφης φως έδωσε τη δυνατότητα για την ταυτόχρονη αγορά του φωτός και AFM εικόνες, ζωτικής σημασίας για την αποτελεσματική διερεύνηση των κυττάρων και βιολογικά συστήματα in vitro. Ωστόσο, για την αληθινή οπτική ενοποίηση με AFM, απαιτείται περισσότερο από ακριβώς το colocalisation των δύο μικροσκόπια. A scanner συμβουλή είναι απαραίτητη, όπως ότι το δείγμα είναι ακόμη κατά τη διάρκεια της AFM απεικόνισης, έτσι ώστε οπτικές εικόνες μπορούν να αποκτηθούν. Κατόχους δείγμα πρέπει να βελτιστοποιηθεί για τις δύο μορφές μικροσκοπία, δηλαδή λεπτό καλυπτρίδες για οπτικό μικροσκόπιο και τη σταθερότητα για την AFM απεικόνισης. Τέλος, μια βαθμονομημένη οπτική εικόνα πρέπει να είναι διαθέσιμα στο λογισμικό AFM απεικόνισης, για να καταστεί δυνατή η ακριβής επικαλύψεις, με αντικείμενα από εκτροπές του αφαιρεθεί οπτική εικόνα. Η NanoWizard ® II AFM παρέχει όλα αυτά τα χαρακτηριστικά, επιτρέποντας για πρώτη φορά την πραγματική ένταξη των οπτικών και AFM.

Πηγή: Μέσα JPK

Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με αυτήν την πηγή μπορείτε να επισκεφθείτε JPK Όργανα