NanoWizard II Permite la Integración Verdadera De la Primera Vez de la Microscopia Óptica y Atómica de la Fuerza por los Instrumentos de JPK

Temas Revestidos

Introducción
Integración del Microscopio Atómico de la Fuerza y del Microscopio Pálido Invertido
CoverslipHolder y BioCell Diseñaron Optimizar Calidad de la Imagen
Piezos en Instrumentos de JPK
Prueba de la Calibración de Imágenes Ópticas
Conclusión

Introducción

La microscopia Atómica y (AFM) la microscopia óptica, particularmente microscopia de la fuerza de fluorescencia, hacen una combinación potente en el estudio de muestras biológicas. El AFM no está conforme al límite de la resolución del Abbe, y puede generar imágenes con mucho más de alta resolución una microscopia que pálida. Sin Embargo, como el contraste se genera en respuesta a las propiedades estructurales de la muestra, puede ser desafiador detectar las estructuras específicas en una muestra heterogénea, tal como una célula. Combinando las dos técnicas, una información estructural más de alta resolución se puede generar usando el AFM. La correlación Subsiguiente con las etiquetas de plástico fluorescente etiqueta puede proporcionar a la información sobre la composición, y por lo tanto a la función, de las estructuras determinadas.

Integración del Microscopio Atómico de la Fuerza y del Microscopio Pálido Invertido

El diseño del NanoWizard® y del NanoWizard®II AFM de JPK es tal que el microscopio atómico de la fuerza es integrado en un microscopio pálido invertido, sin afectar a sus funciones. Esto permite que la proyección de imagen del AFM sea combinada con técnicas del contraste incluyendo el contraste de la fase, DIC, exploración del laser confocal y microscopia de TIRF. Un factor importante en la eficacia de esta integración es que los instrumentos de JPK son punta-analizadores. Es decir, durante proyección de imagen del AFM la muestra todavía está sujetada, mientras que la punta se mueve en la moda del retículo sobre la superficie para construir la imagen. En el caso de los instrumentos de la muestra-exploración, la muestra a ser reflejada se está moviendo constante en el retrato óptico mientras que la exploración del AFM está en curso, significado de la microscopia que la proyección de imagen simultánea verdadera no es realmente posible (el cuadro 1).

Cuadro 1. analizador de la Punta comparado con el analizador de la muestra. La adquisición de imágenes epifluorescent durante la adquisición de la imagen del AFM con un analizador de la punta (a) y un analizador de la muestra (b). Mientras Que la muestra se está moviendo en (b) las estructuras fluorescentes pueden no más ser reflejadas sin manchar. La misma célula se muestra en ambas imágenes.

CoverslipHolder y BioCell Diseñaron Optimizar Calidad de la Imagen

Mientras Que estas características del diseño de dotación física son el comienzo de proporcionar a la integración verdadera hay también otros factores que necesitan ser dirigidos. El primer es el casquillo de la muestra usado. Pues el AFM y la microscopia óptica son técnicas fundamental diversas (una que es basada en la acción recíproca física y la otra en la difracción de la luz) hay diversos requisitos para los soportes efectivos de la muestra. Para la adquisición de las imágenes ópticas de alta calidad, determinado con los altos lentes de la magnificación (63x y 100x) es el mejor utilizar el tapa-cristal muy fino con un espesor del µm alrededor 170.

por otra parte, como la proyección de imagen del AFM es muy sensible a la inestabilidad física, el soporte para tal proyección de imagen debe ser muy estable. Con estos dos requisitos fundamentales en mente, JPK diseñó el CoverslipHolder y el BioCell™ (Cuadro 2). Ambos casquillos de la muestra se diseñan para sujetar las tiras para el AFM uncompromised, combinado y la proyección de imagen de la microscopia pálida. Como tal, con los casquillos innovadores de la muestra y el diseño fundamental de los instrumentos de JPK, el AFM simultáneo, de alta calidad y las imágenes de la microscopia pálida pueden ser detectados. Sin Embargo, para ser integrado verdad ahora hemos introducido la característica de DirectOverlay™ (patente pendiente), una solución de programación que implica la calibración de la imagen óptica y la integración en el software de SPM.

Cuadro 2. El Biocell™ se diseña para optimizar calidad de la imagen durante los experimentos que combinan el AFM y la microscopia pálida mientras que al mismo tiempo permite control de la temperatura. Los elementos de Peltier permiten el ajuste rápido de la temperatura.

Piezos en Instrumentos de JPK

Pues la microscopia óptica se basa en el uso de lentes, cualquier aberración en tales lentes llevará a las distorsiones en la imagen final. Sin Embargo, como los piezos en los instrumentos de JPK se linearizan la imagen del AFM es exacta a 4Å en las direcciones de x y de y. Como tal, en la mayoría de los casos la imagen del AFM y la imagen de la microscopia pálida no cubren exactamente, con resistencia o alargamiento en la imagen óptica un problema común.

Mientras Que la imagen del AFM se genera usando piezos linearizados muy exactos puede ser tratada como “real-espacio”. Además, como el voladizo usado para la proyección de imagen del AFM se puede mover a las puntas fijas, así como retículo-explorar sobre la superficie, puede ser utilizada para calibrar la imagen óptica. En fin, el voladizo se mueve a un conjunto de 25 puntas en realspace, usando los piezos. En cada punta se detecta una imagen óptica y la ubicación de la punta dentro de la imagen óptica se determina posteriormente automáticamente. Una función de la transformación entonces se calcula usando ambos conjuntos de 25 puntas, y ésta transforma se aplica a la imagen óptica mientras que se importa en el software de SPM. De tal manera la imagen óptica se calibra y se importa en el ambiente de SPM, en un proceso automatizado.

Prueba de la Calibración de Imágenes Ópticas

Para probar la calibración de la imagen óptica, 50 bordes fluorescentes del nanómetro eran reflejados usando el AFM y el epifluorescence y las imágenes ópticas untransformed y transformadas comparadas con el AFM. Puede ser visto que hay una resistencia en la cara derecha de la imagen óptica untransformed (cuadro 3). Una Vez Que se ha aplicado el procedimiento de la calibración, sin embargo, el papel entre las señales fluorescentes y topográficas es exacto (el cuadro 4).

Figure 3.Overlay de la topografía (roja) y de las imágenes (verdes) untransformed de la fluorescencia de los bordes 50nm. El panel más inferior es un conjunto de los zoomes digitales de las regiones marcadas. Mientras Que en los primeros dos de las regiones empinadura el papel es bueno, en el panel 3 hay una resistencia de la imagen óptica.

Figure 4.Overlay de la topografía (roja) y de las imágenes (verdes) untransformed de la fluorescencia de los bordes 50nm. La misma área que era reflejada en el Cuadro 3 se muestra aquí. En todas las regiones empinadura el papel es exacto ahora.

Las ventajas de tal característica del programa son extensas. Por ejemplo, en la comparación de la fluorescencia y de las imágenes del AFM puede no haber puntas fijas fácilmente determinadas dentro de las dos imágenes para conducto tal transformación fuera de línea, ni incluso para cubrir los bordes. Como se ve en el cuadro 5, el papel de la imagen del AFM de un fibroblasto REF52 (transfected estable con YFP-paxillin) y la imagen correspondiente de la fluorescencia de las adherencias focales, allí no son ninguna punta en ambas imágenes que se puedan determinar fácilmente para el uso en exactamente la correspondencia de una imagen a la otra.

Figure 5.Overlay de la fluorescencia y de la topografía de las células del fibroblasto REF52. En panel A es la imagen transformada de la fluorescencia y topografía de B. En C un papel de los dos se visualiza.

En este caso las adherencias focales son en la cara básica la célula y la imagen del AFM genera un topograph de la cara apical de la célula. Así el uso del voladizo como herramienta para calibrar la imagen óptica es esencial. En el cuadro 6 la diferencia entre la imagen óptica transformada y no-transformada se visualiza. En este caso el artefacto predominante es un alargamiento a lo largo de un eje.

Figure 6.Overlay de una imagen se ha calibrado que (rojo) y la misma imagen en su formulario sin procesar, sin calibrar (verde) se presente. Puede ser visto sin obstrucción que la imagen sin calibrar está estirada en una dirección.

Además, tal característica puede salvar al utilizador al considerable periodo de tiempo. Mientras Que el AFM tiene alta resolución espacial, la resolución temporal de la técnica es lejos más inferior que la de la microscopia pálida, debido a los tiempos más largos de la adquisición. Con una imagen óptica calibrada en la conexión a tierra trasera del software de SPM (se quita el cuadro 7), la necesidad de detectar una imagen del AFM de la reseña de la célula antes de centrarse en una región de interés. Esto puede ser determinado importante para la exploración de regiones de una célula viva, donde el tiempo puede ser importante. Obviamente, las puntas forcespectroscopy se pueden también seleccionar en la imagen óptica, quitando otra vez la necesidad de detectar una imagen del AFM antes de comenzar la fuerza-espectroscopia experimentan. Cuando se está utilizando una punta functionalized ésta podría probar crítico, como si se tome una exploración antes de que resulten los datos de la fuerza-espectroscopia se obtengan la punta se puedan apaciguar, llevando al falso negativo.

Figure 7.Import de imágenes ópticas en software de SPM. Una imagen óptica calibrada se puede importar en el software de SPM y visualizar en los antecedentes. Esto permite la selección de regiones de la exploración y de puntas de la fuerza-espectroscopia basadas en la imagen óptica, quitando la necesidad de una imagen del AFM de la reseña.

Conclusión

Los cambios en diseño atómico del microscopio de la fuerza que ése llevó a ella son instalación en un microscopio pálido invertido abrieron la posibilidad de la adquisición simultánea de la luz y de las imágenes del AFM, crucial para la investigación efectiva de células y de sistemas biológicos in vitro. Sin Embargo para la integración óptica verdadera con el AFM, más se requiere que apenas el colocalisation de los dos microscopios. Un analizador de la punta es esencial tales que la muestra todavía está durante proyección de imagen del AFM, para poder detectar imágenes ópticas. Los casquillos de la Muestra se deben optimizar para ambos formularios de la microscopia, es decir tiras finas para la microscopia pálida y la estabilidad para la proyección de imagen del AFM. Finalmente, una imagen óptica calibrada debe estar disponible en el software de la proyección de imagen del AFM, activar los papeles exactos, con los artefactos de aberraciones en la imagen óptica quitada. El NanoWizard®II AFM proporciona a todas estas características, permitiendo por primera vez la integración verdadera de la óptica y del AFM.

Fuente: Instrumentos de JPK

Para más información sobre esta fuente visite por favor los Instrumentos de JPK

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:26

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