NanoWizard II Tient Compte de l'Intégration Vraie De Première Fois de la Microscopie Optique et Atomique de Force par des Instruments de JPK

Sujets Couverts

Introduction
Intégration de Microscope Atomique de Force et de Photomicroscope Inversé
CoverslipHolder et BioCell Ont Conçu pour Optimiser la Qualité des Images
Piezos dans des Instruments de JPK
Test de l'Étalonnage des Images Optiques
Conclusion

Introduction

La microscopie Atomique de force (AFM) et la microscopie optique, en particulier microscopie à fluorescence, effectuent une puissante combinaison dans l'étude des échantillons biologiques. L'AFM n'est pas sujet à la limite de définition de l'Abbe, et peut produire des images avec beaucoup plus de haute résolution une photomicroscopie que. Cependant, pendant que le contraste est produit en réponse aux propriétés structurelles de l'échantillon, il peut être provocant pour trouver les structures particulières dans un échantillon hétérogène, tel qu'une cellule. En combinant les deux techniques, l'information structurelle plus de haute résolution peut être produite utilisant l'AFM. La corrélation Ultérieure avec les repères fluorescent étiquetés peut fournir des informations sur la composition, et par conséquent le fonctionnement, des structures recensées.

Intégration de Microscope Atomique de Force et de Photomicroscope Inversé

Le design du NanoWizard® et du NanoWizard®II AFM de JPK est tel que le microscope atomique de force est intégré dans un photomicroscope inversé, sans affecter sa fonctionnalité. Ceci permet à la représentation d'AFM d'être combinée avec des techniques de contraste comprenant le contraste de phase, DIC, balayage de laser confocal et microscopie de TIRF. Un facteur important dans l'efficacité de cette intégration est que les instruments de JPK sont des extrémité-balayeurs. C'est-à-dire, pendant la représentation d'AFM l'échantillon est encore retenu, alors que l'extrémité déménage de mode de trame au-dessus de la surface pour établir l'image. Dans le cas des instruments d'échantillon-lecture, l'échantillon à être imagé déménage continuellement l'illustration optique de microscopie tandis que la lecture d'AFM est en cours, signification que la véritable représentation simultanée n'est pas réellement possible (le schéma 1).

Le Schéma 1. balayeur d'Extrémité contre le balayeur témoin. La saisie des images epifluorescent pendant l'acquisition des images d'AFM avec un balayeur d'extrémité (a) et un balayeur témoin (b). Pendant Que l'échantillon déménage (b) les structures fluorescentes peuvent plus n'être imagées sans enduit. La même cellule est affichée dans les deux images.

CoverslipHolder et BioCell Ont Conçu pour Optimiser la Qualité des Images

Tandis Que ces caractéristiques techniques d'étude matériel informatique sont le début de fournir l'intégration vraie il y a également d'autres facteurs qui doivent être adressés. Le premier est le support témoin utilisé. Car l'AFM et la microscopie optique sont les techniques principalement différentes (une étant basée sur l'interaction matérielle et l'autre sur la diffraction de la lumière) il y a différentes conditions pour les supports pertinents témoin. Pour la saisie des images optiques de haute qualité, en particulier avec des objectifs élevés d'agrandissement (63x et 100x) il est le meilleur d'utiliser la panneau-glace très mince avec une épaisseur du µm environ 170.

d'autre part, car la représentation d'AFM est très sensible à l'instabilité matérielle, le soutien d'une telle représentation doit être très stable. Avec ces deux conditions principales à l'esprit, JPK a conçu le CoverslipHolder et le BioCell™ (le Schéma 2). Chacun des deux supports témoin sont conçus pour retenir des lamelles pour l'AFM uncompromised et combiné et la représentation de photomicroscopie. En soi, avec les supports novateurs témoin et le design principal des instruments de JPK, simultané, de la haute qualité AFM et des images de photomicroscopie peut être saisi. Cependant, pour être vraiment intégré nous avons maintenant introduit la caractéristique technique de DirectOverlay™ (brevet en instance), une solution logicielle qui comporte l'étalonnage de l'image optique et l'intégration dans le logiciel de SPM.

Le Schéma 2. Le Biocell™ est conçu pour optimiser la qualité des images pendant les expériences combinant l'AFM et la photomicroscopie tout en en même temps permettant le contrôle de température. Les éléments de Peltier permettent le réglage rapide de la température.

Piezos dans des Instruments de JPK

Car la microscopie optique est basée sur l'utilisation des objectifs, toutes les aberrations dans de tels objectifs mèneront aux déformations dans l'image finale. Cependant, car les piezos dans les instruments de JPK sont linéarisés l'image d'AFM est précise à 4Å dans les sens de x et de y. En soi, dans la plupart des cas l'image d'AFM et l'image de photomicroscopie ne recouvrent pas exactement, avec le cisaillement ou l'extension dans l'image optique un problème commun.

Pendant Que l'image d'AFM est produite utilisant des piezos linéarisés très précis elle peut être traitée en tant que « réel-espace ». Supplémentaire, pendant que l'encorbellement utilisé pour la représentation d'AFM peut être déménagé aux remarques fixes, ainsi que trame-être balayé au-dessus de la surface, elle peut être employée pour étalonner l'image optique. En Bref, l'encorbellement est déménagé à un ensemble de 25 remarques dans le realspace, utilisant les piezos. À chaque remarque une image optique est saisie et ultérieurement l'emplacement d'extrémité dans l'image optique est automatiquement déterminé. Un fonctionnement de transformation est alors prévu utilisant les deux ensembles de 25 remarques, et ceci transforment est appliqué à l'image optique pendant qu'il est importé dans le logiciel de SPM. D'une telle voie l'image optique est étalonnée et importée dans l'environnement de SPM, dans un traitement automatisé.

Test de l'Étalonnage des Images Optiques

Afin de tester l'étalonnage de l'image optique, 50 petits programmes fluorescents de nanomètre étaient imagés utilisant l'AFM et l'epifluorescence et les images optiques untransformed et transformées avec l'AFM. Il peut voir qu'il y a un cisaillement dans le côté de main droite de l'image optique untransformed (le schéma 3). Une Fois Que la procédure d'étalonnage a été appliquée, cependant, le transparent entre les signes fluorescents et topographiques est précis (le schéma 4).

Figure 3.Overlay de la topographie (rouge) et des images (vertes) untransformed de fluorescence des petits programmes 50nm. La Commission inférieure est un ensemble de zooms numériques des régions marquées. Tandis Que dans les deux premiers des régions changées de plan le transparent est bon, dans la Commission 3 il y a un cisaillement de l'image optique.

Figure 4.Overlay de la topographie (rouge) et des images (vertes) untransformed de fluorescence des petits programmes 50nm. La même zone qui était imagée sur le Schéma 3 est affichée ici. Dans toutes les régions changées de plan le transparent est maintenant précis.

Les avantages d'une telle caractéristique technique de logiciel sont vastes. Par exemple, dans la comparaison de la fluorescence et des images d'AFM il peut ne pas y avoir les remarques fixes facilement recensées dans les deux images pour conduire une telle transformation off-line, ni pour recouvrir même les arêtes. Comme vu sur le schéma 5, le transparent de l'image d'AFM d'un fibroblaste REF52 (stablement transfecté avec YFP-paxillin) et l'image correspondante de fluorescence des adhérences focales, là ne sont aucune remarque dans les deux images qui peuvent facilement être recensées pour l'usage pour tracer exactement une image à l'autre.

Figure 5.Overlay de la fluorescence et de la topographie des cellules du fibroblaste REF52. Dans la Commission A est l'image transformée de fluorescence et topographie de B. En C un transparent des deux est affiché.

Dans ce cas les adhérences focales sont au côté basique la cellule et l'image d'AFM produit d'un topograph du côté apical de la cellule. Ainsi l'utilisation de l'encorbellement comme outil pour étalonner l'image optique est essentielle. Sur le schéma 6 la différence entre l'image optique transformée et non-transformée est affichée. Dans ce cas l'artefact prédominant est une extension le long d'un axe.

Figure 6.Overlay d'une image qui a été étalonnée (rouge) et la même image sous sa forme crue et non-calibrée (vert) est présenté. Il peut de manière dégagée voir que l'image non-calibrée est étirée dans un sens.

Supplémentaire, une telle caractéristique technique peut sauvegarder l'utilisateur par laps de temps considérable. Tandis Que l'AFM a la résolution spatiale élevée, la définition temporelle de la technique est bien inférieure à celle de la photomicroscopie, en raison des temps plus longs de saisie. Avec une image optique étalonnée dans la masse arrière du logiciel de SPM (le schéma 7), la nécessité de saisir une image d'AFM de synthèse de la cellule avant de se concentrer sur une région d'intérêt est retiré. Ceci peut être particulièrement important pour la lecture des régions d'une cellule vivante, où le temps peut être important. Évidemment, des remarques forcespectroscopy peuvent également être sélectées sur l'image optique, enlevant de nouveau la nécessité de saisir une image d'AFM avant de commencer la force-spectroscopie expérimente. Quand une extrémité functionalized est utilisée ceci pourrait prouver critique, comme si une échographie est prise avant que les données de force-spectroscopie soient obtenues l'extrémité puissent être passivées, menant au faux négatif donnent droit.

Figure 7.Import des images optiques dans le logiciel de SPM. Une image optique étalonnée peut être importée dans le logiciel de SPM et être affichée à l'arrière-plan. Ceci permet la sélection des régions d'échographie et des remarques de force-spectroscopie basées sur l'image optique, enlevant le besoin d'image d'AFM de synthèse.

Conclusion

L'altération dans le design atomique de microscope de force que cela a mené à elle est installation sur un photomicroscope inversé a ouvert la possibilité pour la saisie simultanée de la lumière et des images d'AFM, essentielle pour l'enquête pertinente sur les cellules et les systèmes biologiques in vitro. Cependant pour la véritable intégration optique avec l'AFM, plus est exigé que juste le colocalisation des deux microscopes. Un balayeur d'extrémité est essentiel tels que l'échantillon est toujours pendant la représentation d'AFM, de sorte que des images optiques puissent être saisies. Des supports Témoin doivent être optimisés pour les deux formes de microscopie, c.-à-d. lamelles minces pour la photomicroscopie et la stabilité pour la représentation d'AFM. En Conclusion, une image optique étalonnée doit être disponible en logiciel de représentation d'AFM, pour activer les transparents précis, avec des artefacts des aberrations dans l'image optique retirée. Le NanoWizard®II AFM fournit toutes ces caractéristiques techniques, permettant pour la première fois l'intégration vraie du bloc optique et de l'AFM.

Source : Instruments de JPK

Pour plus d'informations sur cette source visitez s'il vous plaît les Instruments de JPK

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:56

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