NanoWizard II Tiene Conto Integrazione Vera Di Prima Volta di Microscopia Ottica ed Atomica della Forza dagli Strumenti di JPK

Argomenti Coperti

Introduzione
Integrazione del Microscopio Atomico della Forza e del Microscopio Ottico Invertito
CoverslipHolder e BioCell Hanno Progettato Per Ottimizzare la Qualità di Immagine
Piezos in Strumenti di JPK
Verificare la Calibratura delle Immagini Ottiche
Conclusione

Introduzione

La microscopia Atomica della forza (AFM) e la microscopia ottica, in particolare microscopia di fluorescenza, fanno una combinazione potente nello studio dei campioni biologici. Il AFM non è conforme al limite di risoluzione delle Abbe e può generare le immagini con molto più di alta risoluzione una microscopia leggera. Tuttavia, mentre il contrasto è generato in risposta ai beni strutturali del campione, può essere provocatorio individuare le strutture specifiche in un campione eterogeneo, quale una cella. Combinando le due tecniche, le informazioni strutturali più di alta risoluzione possono essere generate facendo uso del AFM. La correlazione Successiva con gli indicatori fluorescente contrassegnati può svolgere le informazioni sulla composizione e conseguentemente la funzione, delle strutture identificate.

Integrazione del Microscopio Atomico della Forza e del Microscopio Ottico Invertito

La progettazione del NanoWizard® e del NanoWizard®II AFM da JPK è tale che il microscopio atomico della forza è integrato in un microscopio ottico invertito, senza pregiudicare la sua funzionalità. Ciò permette che la rappresentazione del AFM si combini con le tecniche di contrasto compreso contrasto di fase, DIC, scansione del laser confocale e microscopia di TIRF. Un fattore importante nell'efficacia di questa integrazione è che gli strumenti di JPK sono suggerimento-scanner. Cioè durante la rappresentazione del AFM il campione è tenuto ancora, mentre il suggerimento si muove di modo del quadro televisivo sopra la superficie per sviluppare l'immagine. Nel caso degli strumenti di campione-scansione, il campione da essere imaged sta muovendosi costantemente nella maschera ottica mentre lo scansione del AFM è in corso, significato di microscopia che la vera rappresentazione simultanea non è realmente possibile (figura 1).

Figura 1. scanner del Suggerimento contro lo scanner del campione. L'acquisizione delle immagini epifluorescent durante l'acquisizione di immagine del AFM con uno scanner del suggerimento (A) e uno scanner del campione (B). Come il campione sta muovendosi dentro (B) le strutture fluorescenti possono più non essere imaged senza spalmare. La stessa cella è indicata in entrambe le immagini.

CoverslipHolder e BioCell Hanno Progettato Per Ottimizzare la Qualità di Immagine

Mentre queste caratteristiche del progetto del hardware sono l'inizio di fornitura dell'integrazione vera ci sono egualmente altri fattori che devono essere indirizzati. Il primo è il supporto del campione usato. Poichè il AFM e la microscopia ottica sono tecniche fondamentalmente differenti (una che sono basati sull'interazione fisica e l'altra sulla diffrazione di indicatore luminoso) ci sono requisiti differenti di efficace campionano i supporti. Per l'acquisizione delle immagini ottiche di alta qualità, specialmente con le alte lenti di ingrandimento (63x e 100x) è meglio da usare il coperchio-vetro molto sottile con uno spessore di µm intorno 170.

d'altra parte, poichè la rappresentazione del AFM è molto sensibile ad instabilità fisica, il contributo a tale rappresentazione deve essere molto stabile. Con questi due requisiti fondamentali in mente, JPK ha progettato il CoverslipHolder e il BioCell™ (Figura 2). Entrambi supporti del campione sono destinati per tenere le lamelle per il AFM uncompromised e combinato e la rappresentazione di microscopia leggera. Come tale, con i supporti innovatori del campione e la progettazione fondamentale degli strumenti di JPK, simultaneo, dell'alta qualità AFM e delle immagini di microscopia leggera può acquistarsi. Tuttavia, per essere vero integrato ora abbiamo introdotto la funzionalità di DirectOverlay™ (brevetto in registrazione), una soluzione di software che comprende la calibratura dell'immagine ottica e l'integrazione nel software di SPM.

Figura 2. Il Biocell™ è destinato per ottimizzare la qualità di immagine durante gli esperimenti che combinano il AFM e la microscopia leggera mentre allo stesso tempo permette il controllo della temperatura. Gli elementi di Peltier permettono l'adeguamento rapido della temperatura.

Piezos in Strumenti di JPK

Poichè la microscopia ottica è basata sull'uso delle lenti, tutte le aberrazioni in tali lenti piombo alle deformazioni nell'immagine definitiva. Tuttavia, poichè i piezos negli strumenti di JPK sono linearizzati l'immagine del AFM è precisa a 4Å nelle direzioni di y e di x. Come tale, nella maggior parte dei casi l'immagine del AFM e l'immagine di microscopia leggera non ricoprono esattamente, con la tosatura o l'allungamento nell'immagine ottica un problema comune.

Mentre l'immagine del AFM è generata facendo uso dei piezos linearizzati molto precisi può essere trattata come “lo reale-spazio„. Ulteriormente, mentre la trave a mensola utilizzata per la rappresentazione del AFM può essere mossa verso i punti fissi come pure quadro-essere scandita sopra la superficie, può essere usata per calibrare l'immagine ottica. In Breve, la trave a mensola è mossa verso un insieme di 25 punti nel realspace, facendo uso dei piezos. Ad ogni punto un'immagine ottica si acquista e successivamente la posizione del suggerimento all'interno dell'immagine ottica è determinata automaticamente. Una funzione della trasformazione poi è calcolata facendo uso di entrambi gli insiemi di 25 punti e questa trasforma si applica all'immagine ottica mentre è incluso nel software di SPM. In tale maniera l'immagine ottica è calibrata ed inclusa nell'ambiente di SPM, in un trattamento automatizzato.

Verificare la Calibratura delle Immagini Ottiche

Per verificare la calibratura dell'immagine ottica, 50 perle fluorescenti di nanometro erano imaged facendo uso sia del AFM che del epifluorescence e sia le immagini ottiche untransformed che trasformate rispetto al AFM. Può essere veduto che c'è una tosatura nel lato destro dell'immagine ottica untransformed (figura 3). Una Volta Che la procedura di calibratura si è applicata, tuttavia, il foglio di prova fra i segnali fluorescenti e topografici è preciso (figura 4).

Calcoli 3.Overlay della topografia (rossa) e delle immagini (verdi) untransformed della fluorescenza delle perle 50nm. Il pannello inferiore è un insieme di digitale zuma di profonde regioni. Mentre nei primi due delle regioni zumate il foglio di prova è buono, in comitato 3 c'è una tosatura dell'immagine ottica.

Calcoli 4.Overlay della topografia (rossa) e delle immagini (verdi) untransformed della fluorescenza delle perle 50nm. La stessa area che era imaged nella Figura 3 è indicata qui. In tutte le regioni zumate il foglio di prova ora è preciso.

I vantaggi di un tal pacchetto software sono estesi. Per esempio, nel confronto della fluorescenza e delle immagini del AFM ci non possono essere punti fissi facilmente identificati all'interno delle due immagini per condurre una tal trasformazione fuori linea, né neppure per ricoprire le barriere. Come si vede in figura 5, il foglio di prova dell'immagine del AFM di un fibroblasto REF52 (transfected stabile con YFP-paxillin) e l'immagine corrispondente della fluorescenza delle aderenze focali, là non sono punti in entrambe le immagini che possono essere identificate facilmente per uso esattamente nella mappatura dell'un'immagine all'altra.

Calcoli 5.Overlay della fluorescenza e della topografia delle celle del fibroblasto REF52. In comitato A è l'immagine trasformata della fluorescenza e la topografia di B. In C un foglio di prova dei due video.

In questo caso le aderenze focali sono sul lato basale la cella e l'immagine del AFM genera un topograph del lato apicale della cella. Così l'uso della trave a mensola come strumento per la calibratura dell'immagine ottica è essenziale. Nella figura 6 la differenza fra l'immagine ottica trasformata e non trasformata video. In questo caso il artefatto predominante è un allungamento lungo un asse.

Calcoli 6.Overlay di un'immagine che è stata calibrata (rosso) e la stessa immagine nel suo modulo crudo e uncalibrated (verde) è presentato. Può essere veduto chiaramente che l'immagine uncalibrated è allungata in una direzione.

Ulteriormente, una tal funzionalità può salvare l'utente un il considerevole lasso di tempo. Mentre il AFM ha alta risoluzione spaziale, la risoluzione temporale della tecnica è ben più bassa di quella di microscopia leggera, dovuto i tempi maggiori di acquisizione. Con un'immagine ottica calibrata nella terra arretrata del software di SPM (figura 7), la necessità di acquistare un'immagine del AFM di generalità della cella prima della focalizzazione su una regione di interesse è rimossa. Ciò può essere particolarmente importante per lo scansione delle regioni di cella vivente, in cui il tempo può essere importante. Ovviamente, i punti forcespectroscopy possono anche essere selezionati sull'immagine ottica, rimuovente ancora la necessità di acquistare un'immagine del AFM prima di iniziare la forza-spettroscopia sperimenta. Quando un suggerimento functionalized sta usando questo potrebbe provare critico, come se una scansione fosse catturata prima che i dati della forza-spettroscopia fossero ottenuti il suggerimento potessero essere passivati, piombo al falso negativo risultassero.

Calcoli 7.Import delle immagini ottiche nel software di SPM. Un'immagine ottica calibrata può essere inclusa nel software di SPM ed essere video nei precedenti. Ciò permette la selezione delle regioni di scansione e dei punti della forza-spettroscopia basati sull'immagine ottica, rimuovente l'esigenza di un'immagine del AFM di generalità.

Conclusione

Le alterazioni nella progettazione che atomica del microscopio della forza quella piombo a è impianto su un microscopio ottico invertito hanno aperto la possibilità per l'acquisizione simultanea di indicatore luminoso e delle immagini del AFM, cruciale per l'efficace indagine sulle celle e sui sistemi biologici in vitro. Tuttavia per vera integrazione ottica con il AFM, più è richiesto che appena il colocalisation dei due microscopi. Uno scanner del suggerimento è essenziale tali che il campione è ancora durante la rappresentazione del AFM, di modo che le immagini ottiche possono acquistarsi. I supporti del Campione devono essere ottimizzati per entrambi i moduli di microscopia, cioè lamelle sottili per microscopia leggera e la stabilità per la rappresentazione del AFM. Per Concludere, un'immagine ottica calibrata deve essere disponibile nel software della rappresentazione del AFM, permettere ai fogli di prova accurati, con i artefatti dalle aberrazioni nell'immagine ottica rimossa. Il NanoWizard®II AFM fornisce tutte queste funzionalità, permettendo per la prima volta l'integrazione vera dell'ottica e del AFM.

Sorgente: Strumenti di JPK

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego gli Strumenti di JPK

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:03

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