NanoWizard IIは、JPKインスツルメンツによって光と原子間力顕微鏡の初めての真の統合が可能

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トピックがカバー

はじめ
原子間力顕微鏡と倒立光学顕微鏡の統合
CoverslipHolderとバイオセルは、画質を最適化しますように設計
JPKインスツルメンツのピエゾ
光学画像のキャリブレーションのテスト
結論

はじめ

原子間力顕微鏡（AFM）および光学顕微鏡では、特定の蛍光顕微鏡で、生物学的試料の研究で強力な組み合わせを作る。 AFMは、アッベの分解能の制限の対象ではなく、光学顕微鏡よりはるかに高い解像度の画像を生成することができます。しかしながら、コントラストが試料の構造特性に応答して生成されるように、それは細胞のような異種サンプル中の特定の構造を、検出するために挑戦することができます。 2つの手法を組み合わせることで、より高い分解能構造情報は、AFMを用いて生成することができる。蛍光標識マーカーとその後の相関は、特定された構造物の組成に関する情報、およびその結果としての機能を、提供することができます。

原子間力顕微鏡と倒立光学顕微鏡の統合

の設計NanoWizard ®とNanoWizard ® II AFMからJPKは、原子間力顕微鏡は、その機能に影響を与えることなく、倒立光学顕微鏡に統合されるようになっている。これは、AFMイメージング、位相コントラスト、DIC、レーザースキャニング共焦点および全反射顕微鏡を含むコントラスト技術と組み合わせることができます。この統合の有効性に重要な要因は、ということですJPKの楽器は先端スキャナーです。先端がイメージを構築するために表面上のラスタ形式で移動する間、つまりは、AFMイメージング中にサンプルは、まだ開催されます。 AFMスキャンが進行中に、サンプルスキャンの楽器の場合には、撮像されるサンプルは、常に真の同時イメージングが（図1）実際には不可能であることを意味し、光学顕微鏡の画像に移動している。

図1。先端スキャナ対サンプルスキャナ。先端のスキャナー（A）とサンプルのスキャナー（B）とAFMの画像を取り込みながら落射蛍光画像の取得。サンプルは、（B）蛍光構造がにじむことなく撮像することはできなくなりますで動いているように。同じ細胞は両方の画像に表示されます。

CoverslipHolderとバイオセルは、画質を最適化しますように設計

これらのハードウェア設計の特徴は、対処する必要のある他の要因も存在する真の統合を提供開始されていますが。まず1つ目は、使用するサンプルホルダです。 AFMと光学顕微鏡のように効果的なサンプルをサポートするためのさまざまな要件が存在する根本的に異なる技術（いずれかが光の回折の物理的相互作用と他のに基づいている）です。特に高倍率のレンズ（63xおよび100倍）と高品質の光学像の取得を170μm付近の厚さで非常に薄いカバーガラスを使用することをお勧めです。

一方、AFMイメージングは​​、物理的な不安定性に非常に敏感なので、このようなイメージングのためのサポートは非​​常に安定している必要があります。念頭に置いてこれらの2つの基本的な要件と、 JPKは設計CoverslipHolderとバイオセル™ （図2）。これらのサンプルホルダーの両方が妥協のない、組み合わせAFMと光学顕微鏡イメージングのためにカバースリップを保持するように設計されています。このように、革新的なサンプルホルダとの基本的な設計とJPK機器 、同時、高品質のAFMと光学顕微鏡像を得ることができる。しかし、本当に私たちが今DirectOverlay™機能（特許出願中）、SPMのソフトウェアに光学像との統合のキャリブレーションを含むソフトウェアソリューションを導入して統合することに。

図2。バイオセル™は、温度制御を可能にすると同時に、原子間力顕微鏡と光学顕微鏡を組み合わせた実験時の画質を最適化するように設計されています。ペルチェ素子は、温度の急激な調整を可能にする。

JPKインスツルメンツのピエゾ

光学顕微鏡は、レンズの使用に基づいているので、そのようなレンズ内の任意の異常は、最終的な画像の歪みにつながる。のピエゾしかし、 JPKの楽器は線形化されているAFM像は、x方向とy方向の4Aに正確です。このように、ほとんどの場合、AFM像と光学顕微鏡像は、光学像の一般的な問題のせん断やストレッチで、正確にオーバーレイしないでください。

AFM像は非常に正確な線形化されたピエゾを使用して生成されると、それは、"実空間"として扱うことができます。さらに、AFMイメージングに使用カンチレバーを固定点に移動するだけでなく、表面上をラスタスキャンできるように、それは光学像を校正するために使用することができます。一言で言えば、カンチレバーは、ピエゾを使用して、realspaceで25点のセットに移動されます。各時点で、光学画像を取得し、続いて光学画像内の先端の位置が自動的に決定されます。変換関数は、25ポイントの両方のセットを使用して計算されます、そしてそれがSPMのソフトウェアにインポートされると、この変換は光学画像に適用されます。このような方法で、光学像は、自動化されたプロセスで、SPMの環境に校正され、インポートされます。

光学画像のキャリブレーションのテスト

光学画像のキャリブレーションをテストするために、50nmの蛍光ビーズをAFMおよび落射蛍光とAFMと比較して変換されていないと変換された光学イメージの両方の両方を用いて画像化した。それは、非形質転換光学像（図3）の右辺にせん断があることが分かる。キャリブレーションの手順が適用されると、しかし、蛍光灯と地形信号間のオーバーレイは（図4）正確です。

図3地形の重ね合わせ（赤）と50nmのビーズの未変換の蛍光（緑色）の画像。下のパネルは、マークの地域のデジタルズームのセットです。ズームされた地域の最初の二つでオーバーレイが良いですが、パネル3の光学像のせん断あります。

図4地形の重ね合わせ（赤）と50nmのビーズの未変換の蛍光（緑色）の画像。図3に結像されたものと同じエリアはここに示されています。すべてのズーム地域でオーバーレイは現在正確です。

そのようなソフトウェア機能の利点は広範囲です。例えば、蛍光とAFM像の比較で容易にそのような変換をオフラインで行うこと、またさらにエッジをオーバーレイするには、2つのイメージ内の固定点をそこに特定されていない可能性があります。図5、REF52線維芽細胞（安定YFP -パキシリンでトランスフェクション）と接着斑の対応する蛍光像のAFM像のオーバーレイに見られるように、簡単に正確に使用するために識別することができます両方のイメージのポイントがありません他の1つの画像をマッピング。

図5蛍光とREF52繊維芽細胞の地形の重ね合わせ。パネルで変換された蛍光画像とBの地形です。 C二つのオーバーレイが表示されます。

この場合、接着斑は、基底側細胞とAFM像は、細胞の頂端側のトポグラフを生成です。したがって、光学画像を校正するためのツールと​​してカンチレバーの使用が不可欠です。図6に変換され、非形質転換光学像との差が表示されます。この場合、支配的な人工物は、1つの軸に沿ってストレッチです。

図6は、。校正された画像の重ね合わせ（赤）と、その生の、キャリブレーションされていないフォーム（緑）で同じ画像が表示されます。これは明らかに未校正画像を1つの方向に延伸されていることがわかる。

さらに、そのような機能は、ユーザーにかなりの時間を節約することができます。 AFMは高空間分解能を持っているが、技術の時間分解能は、より長い取得時間のために光学顕微鏡に比べてはるかに低いです。 SPMのソフトウェア（図7）のバックグラウンドで校正された光学像で、関心領域に焦点を合わせる前に、セルの概要AFM像を取得する必要性が削除されます。これは時間が重要かもしれない生きている細胞、の領域のスキャンのために特に重要になります。明らかに、forcespectroscopyポイントも再び力分光法の実験を開始する前に、AFM像を取得する必要がなくなるため、光学画像上で選択することができます。フォーススペクトロスコピーのデータは、先端が偽陰性の結果につながる、不動態化されることがあります取得する前にスキャンが行われるかのように官能化された先端が使用されている場合、これは、重要かもしれない。

図7。SPMのソフトウェアへの光のイメージのインポート。校正済み光像は、SPMのソフトウェアにインポートし、バックグラウンドで表示することができます。これは概要AFM像の必要性を除去する、光学像に基づいて、スキャン領域とフォーススペクトロスコピーのポイントを選択することができます。

結論

倒立光学顕微鏡上でのインストールにつながった原子間力顕微鏡の設計の変化は、in vitroでの細胞や生物システムの効果的な調査のための重要な、光とAFM像の同時取得の可能性を開いた。しかし、AFMとの真の光の統合のために、より多くの、2つの顕微鏡のちょうどcolocalisationよりも必要です。先端のスキャナーでは、サンプルの光学画像を取得することができるように、AFM像中に残っていることなどが不可欠です。サンプルホルダーは、顕微鏡の両方の形式のために最適化されている必要があります、AFMイメージングのための光学顕微鏡と安定のために薄いカバースリップを、すなわち。最後に、校正済み光イメージが削除された光学像における収差の工芸品で、正確なオーバーレイを有効にするために、AFMイメージングソフトウェアで使用可能である必要があります。 NanoWizard ® II AFMは、光学系とAFMの初めての真の統合を可能にする、これらの機能のすべてを提供します。

ソース： JPKインスツルメンツ

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