NanoWizard II は JPK の器械によって光学および原子力の顕微鏡検査の初めての本当の統合を可能にします

カバーされるトピック

導入
原子力の顕微鏡および逆にされた光学顕微鏡の統合
CoverslipHolder および BioCell は画像の品質を最適化するように設計しました
JPK の器械の Piezos
光学画像の口径測定のテスト
結論

導入

原子力の顕微鏡検査 (AFM)および光学顕微鏡検査の特に蛍光顕微鏡は、生物的サンプルの調査の強力な組合せを作ります。 AFM は聖職者の解像限界に応じてないし、光学顕微鏡検査より大いに高リゾリューションの画像を生成できます。 ただし、対照はサンプルの構造特性に応じて生成されると同時にセルのような異質サンプルの特定の構造を、検出するために、挑戦的である場合もあります。 2 つの技術の結合によって、高リゾリューションの構造的情報は AFM を使用して生成することができます。 従って蛍光に分類されたマーカーとのそれに続く相関関係は構成についての情報、および識別された構造の機能を、提供できます。

原子力の顕微鏡および逆にされた光学顕微鏡の統合

JPK からの NanoWizard® および NanoWizard®II AFM のデザインは機能性に影響を与えないで原子力の顕微鏡が逆にされた光学顕微鏡に統合されていることそのような物、です。 これは AFM イメージ投射が段階の対照、 DIC の共焦点および TIRF の顕微鏡検査レーザーのスキャンを含む対照の技術と結合されるようにします。 この統合の効力の重要な要因は JPK の器械が先端スキャンナーであることです。 すなわち、 AFM イメージ投射の間にサンプルは画像を構築するために先端は表面上のラスターの方法で移動するが、まだ保持されます。 サンプルスキャンの器械の場合には、視覚化されているサンプルは光学顕微鏡検査映像、意味で絶えず本当の同時イメージ投射が実際に可能ではないこと AFM のスキャンが進行中の間、移動しています (図 1)。

図 1. 先端のスキャンナー対サンプルスキャンナー。 先端のスキャンナー (a) およびサンプルスキャンナー (b) との AFM の画像の獲得の間の epifluorescent 画像の獲得。 サンプルがで (b) 移動していると同時に蛍光構造はもはや塗りつけないで視覚化されます。 同じセルは両方の画像で示されています。

CoverslipHolder および BioCell は画像の品質を最適化するように設計しました

これらのハードウェアデザイン機能が本当の統合の提供の開始の間、またアドレス指定される必要がある他の要因があります。 第 1 は使用されるサンプルホールダーです。 AFM および光学顕微鏡検査が根本的に違いがある技術 (1 物理的な相互作用におよびライトの回折に他基づいている) であるので有効なサンプルサポートのための異なった条件があります。 高い拡大レンズとの良質の光学画像の獲得のために、特に (63x および 100x) およそ 170 µm の厚さの非常に薄いカバーガラスを使用することが最善です。

一方では、 AFM イメージ投射が物理的な不安定な状態に非常に敏感であるので、そのようなイメージ投射のためのサポートは非常に安定しなければなりません。 心のこれら二つの基本的な条件によって、 JPK は CoverslipHolder および BioCell™ (図 2) を設計しました。 両方のサンプルホールダーは欠陥のない、結合された AFM および光学顕微鏡検査イメージ投射のための coverslips を保持するように設計されています。 したがって、 JPK の器械の革新的なサンプルホールダーそして基本的なデザインと、同時の、良質 AFM および光学顕微鏡検査の画像は得ることができます。 ただし、偽りなく統合されて私達はであるために今 DirectOverlay™機能 (特許審議中)、 SPM のソフトウェアに光学画像の口径測定および統合を含むソフトウェア・ソリューションをもたらしてしまいました。

図 2。 Biocell™は同時に温度調整を許可している間 AFM および光学顕微鏡検査を結合する実験の間に画像の品質を最適化するように設計されています。 ペルティアー要素は温度の急速な調節を可能にします。

JPK の器械の Piezos

光学顕微鏡検査がレンズの使用に基づいているので、そのようなレンズのどの異常でも最終的な画像のゆがみの原因となります。 ただし、 JPK の器械の piezos が一直線に並べられるので AFM の画像は x および y の方向の 4Å に精密です。 したがって、ほとんどの場合 AFM の画像および光学顕微鏡検査の画像は光学画像のせん断か伸張と正確に、よくある問題上にありません。

AFM の画像は非常に精密な一直線に並べられた piezos を使用して生成されると同時に 「実質スペース」として扱うことができます。 さらに AFM イメージ投射に使用する片持梁は固定小数点に移動され、また表面にラスタースキャンすることができると同時に光学画像に目盛りを付けるのに使用することができます。 つまり、片持梁は piezos を使用して一組の realspace の 25 ポイントに、移動されます。 各ポイントで光学画像は得られ、続いて光学画像内の先端の位置は自動的に定められます。 変形機能は 25 ポイントの両方のセットを使用してそれから計算され、 SPM のソフトウェアにインポートされると同時にこれは光学画像に適用されます変形します。 そのような方法では光学画像は自動化されたプロセスの SPM の環境に、目盛りが付き、インポートされます。

光学画像の口径測定のテスト

光学画像の口径測定をテストするため、 50 の nm の蛍光ビードは AFM および epifluorescence 両方を使用して視覚化されているおよび AFM と比較された untransformed、変形させた光学画像。 それは untransformed 光学画像 (図 3) の右側にせん断があること見ることができます。 口径測定プロシージャが、しかし適用されたら、蛍光および地勢シグナル間のオーバーレイは精密です (図 4)。

地形 (赤い) および 50nm ビードの untransformed 蛍光性の (緑の) 画像の 3.Overlay を計算して下さい。 より低いパネルはマーク付き領域の一組のデジタル急上昇しますです。 急上昇させた領域の最初の 2 でオーバーレイがよい間、パネル 3 に光学画像のせん断があります。

地形 (赤い) および 50nm ビードの untransformed 蛍光性の (緑の) 画像の 4.Overlay を計算して下さい。 図 3 で視覚化されていた同じ領域はここに示されています。 すべての急上昇させた領域でオーバーレイは今精密です。

そのようなソフトウェア機能の利点は広範です。 例えば、蛍光性および AFM の画像の比較でそのような変形をオフラインで行なう、端を上にある 2 つの画像内に容易に識別された固定小数点がないかもしれません。 図 5 に見られるように、 REF52 繊維芽細胞の AFM の画像のオーバーレイ (固定して YFP-paxillin と transfected) および焦点付着の対応する蛍光性の画像は、そこに正確に他への 1 つの画像をマップすることの使用のために容易に識別することができる両方の画像のポイントではないです。

REF52 繊維芽細胞のセルの蛍光性そして地形の 5.Overlay を計算して下さい。 パネルで A は変形させた蛍光性の画像および B の地形です。 C で 2 のオーバーレイは表示されます。

この場合焦点付着は基底の側面にセルであり、 AFM の画像はセルの頂点の側面の topograph を生成します。 従って光学画像に目盛りを付けるためのツールとして片持梁の使用は必要です。 図 6 で変形させ、非変形させた光学画像間の相違は表示されます。 この場合優勢な人工物は 1 つの軸線に沿う伸張です。

(赤) および未加工目盛りが付いていた画像の 6.Overlay を、 uncalibrated 形式 (緑) の同じ画像示される計算して下さい。 それは uncalibrated 画像が 1 方向で伸びることはっきり見ることができます。

さらに、そのような機能はユーザーを保存することができます相当な量の時間。 AFM に高い空間分解能がある間、技術の一時的な解像度は光学顕微鏡検査のそれよりずっと低いです、より長い獲得の時が原因で。 SPM のソフトウェアの背部地面の目盛りを付けられた光学画像を使って (図 7) は、興味の領域に焦点を合わせる前にセルの概要 AFM の画像を得る必要性除去されます。 これは時間が重要かもしれない生体細胞の領域のスキャンのために特に重要である場合もあります。 明らかに、 forcespectroscopy ポイントはまた再度力分光学を開始する前に AFM の画像を得る必要性を取除く光学画像で実験します、選ぶことができます。 functionalized 先端が使用されているときこれはスキャンが取られるように重大証明できま力分光学データが先端不動態化されるかもしれない得られる前に生じる偽陰性に導きます。

SPM のソフトウェアに光学画像の 7.Import を計算して下さい。 目盛りを付けられた光学画像は SPM のソフトウェアにインポートされ、背景で表示することができます。 これは概要 AFM の画像のための必要性を取除く光学画像に基づいてスキャン領域および力分光学ポイントの選択を可能にします。

結論

それがそれに導いた原子力の顕微鏡デザインの変化は逆にされた光学顕微鏡のインストール生体外で開きましたセルおよび生物系の有効な調査のために重大なライトおよび AFM の画像の同時獲得のための可能性をです。 ただし AFM との本当の光学統合に、 2 台の顕微鏡のちょうど colocalisation より多くは必要となります。 先端のスキャンナーは光学画像が得ることができるようにサンプルが AFM イメージ投射の間にまだあること必要そのような物です。 サンプルホールダーは顕微鏡検査の両方の形式、 AFM イメージ投射の光学の顕微鏡検査そして安定性のためのすなわち薄い coverslips のために最適化されなければなりません。 最後に、目盛りを付けられた光学画像は可能にするために AFM イメージ投射ソフトウェアで使用できなければ、除去される光学画像の異常からの人工物が付いている正確なオーバーレイを、なりません。 NanoWizard®II AFM はこれらの機能すべてを提供しま、光学および AFM の本当の統合をはじめて許可します。

ソース: JPK の器械

このソースのより多くの情報のために JPK の器械を訪問して下さい

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:06

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