NanoWizard II는 JPK 계기에 의하여 광학 및 원자 군대 현미경 검사법의 처음 확실한 통합을 허용합니다

커버되는 토픽

소개
원자 군대 현미경 및 거꾸로 한 가벼운 현미경의 통합
CoverslipHolder와 BioCell는 심상 질을 낙관하는 것을 디자인했습니다
JPK 계기에 있는 Piezos
광학적인 심상의 구경측정 시험
결론

소개

원자 군대 현미경 검사법 (AFM) 및 광학적인 현미경 검사법 의 특히 형광 현미경 검사법은, 생물학 견본의 연구 결과에 있는 강력한 조합을 만듭니다. AFM는 Abbe의 해결책 한계에 지배를 받지 않, 보다는 가벼운 현미경 검사법을 가진 심상을 매우 고해상으로 생성할 수 있습니다. 그러나, 대조는 견본의 구조상 속성에 응하여 생성되는 때, 도전적 세포와 같은 이질적인 견본에 있는 특정 구조물을 검출하기위하여일 수 있습니다. 2개의 기술을 결합해서, 고해상 구조상 정보는 AFM를 사용하여 생성될 수 있습니다. 형광성으로 레테르를 붙인 마커와의 연속적인 상호 관계는 구성에 관하여 정보, 그리고 그 결과로 확인한 구조물의 기능을, 제공할 수 있습니다.

원자 군대 현미경 및 거꾸로 한 가벼운 현미경의 통합

JPK에서 NanoWizard®NanoWizard®II AFM의 디자인은 그것의 기능에 영향을 미치기 없이 원자 군대 현미경이 거꾸로 한 가벼운 현미경으로 통합 이다 그 같은, 입니다. 이것은 AFM 화상 진찰이 단계 대조, DIC 의 confocal와 TIRF 현미경 검사법 레이저 검사를 포함하여 대조 기술과 결합되는 것을 허용합니다. 이 통합의 효험에 있는 중요한 요인은 JPK 계기가 끝 스캐너이다 입니다. 다시 말하면 AFM 화상 진찰 도중 견본은 심상을 건설하는 위하여 끝은 표면에 점방식 형식에서 움직이는 그러나, 아직도 붙들립니다. 견본 스캐닝 계기의 경우에, imaged 일 것이다 견본은 광학적인 현미경 검사법 그림, 의미에서 끊임없이 확실한 동시 화상 진찰이 실제적으로 가능하지 않다 AFM 스캐닝이 진행중인 동안 움직이고 있습니다 (숫자 1).

숫자 1. 끝 스캐너 대 견본 스캐너. 끝 스캐너 (a) 및 견본 스캐너 (b)를 가진 AFM 심상 취득 도중 epifluorescent 심상의 취득. 견본이에서 (b) 움직이는 때 형광성 구조물은 더 이상 바르기 없이 imaged 일 수 있지 않습니다. 동일 세포는 두 심상 전부에서 보입니다.

CoverslipHolder와 BioCell는 심상 질을 낙관하는 것을 디자인했습니다

이 기계설비 설계 특징이 확실한 통합 제공의 시작의 동안 또한 제시될 필요가 있는 그밖 요인이 있습니다. 첫번째 이용된 견본 홀더입니다. AFM와 광학적인 현미경 검사법이 근본적으로 다른 기술 (것 물리적인 상호 작용에 및 빛의 회절에 그 외 근거를 두는)이기 때문에 효과적인 견본 지원을 위한 다른 필수품이 있습니다. 높은 확대 렌즈를 가진 고품질 광학적인 심상의 취득을 위해, 특히 (63x와 100x) 약 170 µm의 간격을 가진 아주 얇은 덮개 유리를 이용하는 것이 최상 입니다.

다른 한편으로는, AFM 화상 진찰이 물리적인 불안정성에 아주 과민하기 때문에, 그 같은 화상 진찰을 위한 지원은 아주 안정되어 있어야 합니다. 마음에 있는 이러한 두 종류 기본적인 필수품으로, JPK는 CoverslipHolderBioCell™ (숫자 2)를 디자인했습니다. 이들 모두 견본 홀더는 비타협 적이고, 결합된 AFM 및 가벼운 현미경 검사법 화상 진찰을 위한 coverslips를 붙들기 위하여 디자인됩니다. 따라서, JPK 계기의 혁신적인 견본 홀더 그리고 기본적인 디자인과 더불어, 동시의, 고품질 AFM 및 가벼운 현미경 검사법 심상은 취득될 수 있습니다. 그러나, 확실하게 통합해 우리는 지금이기 위하여 DirectOverlay™ 특징 (특허 출원 중), SPM 소프트웨어로 광학적인 심상의 구경측정 및 통합을 관련시키는 소프트웨어 해결책을 소개했습니다.

숫자 2. Biocell™는 동시에 온도 조종을 허용하고 있는 동안 AFM와 가벼운 현미경 검사법을 결합하는 실험 도중 심상 질을 낙관하기 위하여 디자인됩니다. 펠티에 소자는 온도의 급속한 조정을 허용합니다.

JPK 계기에 있는 Piezos

광학적인 현미경 검사법이 렌즈의 사용에 근거를 두기 때문에, 그 같은 렌즈에 있는 어떤 착오든지 마지막 심상에 있는 찡그림으로 이끌어 낼 것입니다. 그러나, JPK 계기에 있는 piezos가 linearized 때문에 AFM 심상은 x와 y 방향에 있는 4Å에 정확합니다. 따라서, 대부분의 경우에 AFM 심상 및 가벼운 현미경 검사법 심상은 광학적인 심상에 있는 가위 또는 뻗기와 더불어 정확하게, 흔히 있는 문제 투영하지 않습니다.

AFM 심상은 아주 정확한 linearized piezos를 사용하여 생성되는 때 "실제 공간"로 취급될 수 있습니다. AFM 화상 진찰에 사용되는 외팔보는 고정점으로, 뿐 아니라 표면에 점방식 검사되는 수 있는 때 게다가, 광학적인 심상을 측정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 한마디로 말하면, 외팔보는 piezos를 사용하여 realspace에 있는 25 점의 세트로. 각 점에 광학적인 심상은 취득되고 연속적으로 광학적인 심상 내의 끝 위치는 자동적으로 결정됩니다. 변형시키 기능은 25 점의 두 세트 전부를 사용하여 그 때 산출되고, SPM 소프트웨어로 가져오는 때 이것은 광학적인 심상에 적용됩니다 변형시킵니다. 그런 쪽에서는 광학적인 심상은 자동화된 프로세스에서 SPM 환경으로, 측정되고 가져옵니다.

광학적인 심상의 구경측정 시험

광학적인 심상의 구경측정을 시험하기 위하여, 50 nm 형광성 구슬은 AFM와 epifluorescence 둘 다를 사용하여 imaged와 AFM와 비교된 untransformed 변형된 광학적인 심상 모두 이었습니다. untransformed 광학적인 심상 (숫자 3)의 오른쪽에 있는 가위가 있다는 것은 보일 수 있습니다. 일단 구경측정 절차가, 그러나 적용되면, 형광성과 지형도 작성 신호 사이 오바레이는 정확합니다 (숫자 4).

(빨간) 지세와 50nm 구슬의 untransformed 형광 (녹색) 심상의 3.Overlay를 계산하십시오. 더 낮은 위원회는 표시되어 있는 지구의 디지털의 세트 급상승합니다입니다. 급상승되는 지구의 첫번째 2에서 오바레이가 좋은 동안, 위원회 3에서 광학적인 심상의 가위가 있습니다.

(빨간) 지세와 50nm 구슬의 untransformed 형광 (녹색) 심상의 4.Overlay를 계산하십시오. 숫자 3에서 imaged 인 동일 지역은 여기에서 보입니다. 모든 급상승한 지구에서 오바레이는 지금 정확합니다.

그런 소프트웨어 특징의 이득은 광대합니다. 예를 들면, 형광과 AFM 심상의 비교에서 그런 전이를 오프라인으로 수행하고는, 도 아니다 가장자리를 투영하는 조차 2개의 심상 내의 쉽게 확인한 고정점이 있지 않을지도 모릅니다. 숫자 5에서 볼 수 있는 것처럼, (안정적으로 YFP-paxillin로 transfected) REF52 섬유아세포의 AFM 심상의 오바레이 및 초점 접착의 대응 형광 심상은, 거기 정확하게 그 외에 1개의 심상을 지도로 나타내기에 있는 사용을 위해 쉽게 확인될 수 있는 두 심상 전부에 있는 아무 점도 없습니다.

REF52 섬유아세포 세포의 형광 그리고 지세의 5.Overlay를 계산하십시오. 위원회에서 A는 변형된 형광 심상 및 B 지세입니다. C에서 2의 오바레이는 디스플레이됩니다.

이런 경우에 초점 접착은 기초 측에 세포이고 AFM 심상은 세포의 정점 측의 topograph를 생성합니다. 따라서 광학적인 심상 측정을 위한 공구로 외팔보의 사용은 필수적입니다. 숫자 6에서 변형시키고 비 변형된 광학적인 심상 사이 다름은 디스플레이됩니다. 이런 경우에 우위한 인공물은 1개의 축선에 따라서 뻗기입니다.

(공산분자)와 그것의 처리되지 않는 측정된 심상의 6.Overlay를, uncalibrated 양식 (녹색)에 있는 동일 심상 제출되는 계산하십시오. uncalibrated 심상이 1개의 방향에서 기지개한다는 것을 명확하게 보일 수 있습니다.

게다가, 그런 특징은 사용자를 저장할 수 있습니다 상당량의 시간. AFM에는 높은 공간적 해상도가 있는 동안, 기술의 시간 해상도는 가벼운 현미경 검사법의 그것 보다는 멀리 더 낮습니다, 더 긴 취득 시간 때문에. SPM 소프트웨어의 뒤 지상에 있는 측정된 광학적인 심상으로 (숫자 7)는, 관심사의 지구에 집중하기 전에 세포의 개관 AFM 심상을 취득하는 필요 제거됩니다. 이것은 시간이 중요할지도 모르다 생세포의 지구의 스캐닝을 위해 특히 중요할 수 있습니다. 분명히, forcespectroscopy 점은 또한 다시 군대 분광학을 시작하기 전에 AFM 심상을 취득하는 필요를 제거하는 광학적인 심상에 실험합니다, 선정될 수 있습니다. functionalized 끝이 사용될 때 이것은 검사가 취하다 처럼, 중요한 증명할 수 있어, 군대 분광학 데이터가 끝이라고 passivated 수 있을 장악되기 전에 유래할 틀린 네거티브에 지도할.

SPM 소프트웨어로 광학적인 심상의 7.Import를 계산하십시오. 측정한 광학적인 심상은 SPM 소프트웨어로 가져오고 배경에서 디스플레이될 수 있습니다. 이것은 개관 AFM 심상을 위한 필요를 제거하는 광학적인 심상에 근거를 둔 검사 지구와 군대 분광학 점의 선택을 허용합니다.

결론

그것이 그것에 지도한 원자 군대 현미경 디자인에 있는 변경은 거꾸로 한 가벼운 현미경에 임명 생체외에서 열었습니다 세포와 생물 체계의 효과적인 수사를 위해 결정 빛과 AFM 심상의 동시 취득을 위한 가능성을 입니다. 그러나 AFM와의 확실한 광학적인 통합을 위해, 2대의 현미경의 다만 colocalisation 보다는 더 많은 것은 요구됩니다. 끝 스캐너는 광학적인 심상이 취득될 수 있다 그래야 견본이 AFM 화상 진찰 도중 아직도 이다 필수적 그 같은입니다. 견본 홀더는 현미경 검사법의 두 양식 전부, AFM 화상 진찰을 위한 가벼운 현미경 검사법 그리고 안정성을 위한 i.e 얇은 coverslips를 위해 낙관되어야 합니다. 마지막으로, 측정한 광학적인 심상은 가능하게 하기 위하여 AFM 화상 진찰 소프트웨어에서 유효해야, 제거된 광학적인 심상에 있는 착오에서 인공물과 더불어 정확한 오바레이를, 합니다. NanoWizard®II AFM는 이 특징 전부를 제공해, 광학과 AFM의 확실한 통합을 처음으로 허용하.

근원: JPK 계기

이 근원에 추가 정보를 위해 JPK 계기를 방문하십시오

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:09

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit