NanoWizard II Staat voor de Eerste Ware Integratie van de Keer van de Optische en AtoomMicroscopie van de Kracht toe door JPK Instrumenten

Besproken Onderwerpen

Inleiding
Integratie van de AtoomMicroscoop van de Kracht en Omgekeerde Lichte Microscoop
CoverslipHolder en BioCell wordt Ontworpen om de Kwaliteit die van het Beeld Te Optimaliseren
Piezos in Instrumenten JPK
Het Testen van de Kaliberbepaling van Optische Beelden
Conclusie

Inleiding

De Atoom krachtmicroscopie (AFM) en de optische microscopie, in het bijzonder de fluorescentiemicroscopie, maken een krachtige combinatie in de studie van biologische steekproeven. AFM is niet onderworpen aan de resolutiegrens van Abbe, en kan beelden met een veel hogere resolutie produceren dan de lichte microscopie. Nochtans, aangezien het contrast in antwoord op de structurele eigenschappen van de steekproef wordt geproduceerd, kan het zijn uitdagend om specifieke structuren in een heterogeene steekproef, zoals een cel te ontdekken. Door de twee technieken te combineren, kan de hogere resolutie structurele informatie worden geproduceerd gebruikend AFM. De Verdere correlatie met fluorescently geëtiketteerde tellers kan informatie over de samenstelling, en bijgevolg de functie, van de geïdentificeerde structuren verstrekken.

Integratie van de AtoomMicroscoop van de Kracht en Omgekeerde Lichte Microscoop

Het ontwerp van NanoWizard® en NanoWizard®II AFM van JPK is dusdanig dat de atoomkrachtmicroscoop in een omgekeerde lichte microscoop, zonder zijn functionaliteit te beïnvloeden geïntegreerd is. Dit laat weergave AFM toe om met contrasttechnieken met inbegrip van confocal fasecontrast, DIC, laseraftasten en de microscopie worden gecombineerd TIRF. Een belangrijke factor in de doeltreffendheid van deze integratie is dat de instrumenten JPK uiteinde-scanners zijn. Namelijk tijdens weergave AFM wordt de steekproef toch gehouden, terwijl het uiteinde zich op roostermanier over de oppervlakte beweegt om het beeld te bouwen. In het geval van steekproef-aftastende instrumenten, beweegt de steekproef zich om imaged te zijn constant in het optische de microscopiebeeld terwijl het aftasten AFM lopend is, betekenis dat de ware gelijktijdige weergave niet werkelijk mogelijk is (figuur 1).

Figuur 1. De scanner van het Uiteinde versus steekproefscanner. De aanwinst van epifluorescent beelden tijdens AFM beeldaanwinst met een uiteindescanner (a) en een steekproefscanner (b). Aangezien de steekproef zich in (b) beweegt de fluorescente structuren kunnen niet meer imaged zijn zonder het smeren. De zelfde cel wordt getoond in beide beelden.

CoverslipHolder en BioCell wordt Ontworpen om de Kwaliteit die van het Beeld Te Optimaliseren

Terwijl deze eigenschappen van het hardwareontwerp het begin van het verstrekken van ware integratie zijn zijn er ook andere factoren die moeten worden gericht. De eerste is de gebruikte steekproefhouder. Aangezien AFM en de optische microscopie fundamenteel verschillende technieken zijn (één op fysieke interactie worden gebaseerd en andere die op de diffractie van licht) er zijn verschillende eisen ten aanzien van efficiënte steekproefsteunen. Voor de aanwinst van hoogte - is de kwaliteits optische beelden, in het bijzonder met hoge vergrotingslenzen (63x en 100x) het best om zeer dun dekking-glas met een dikte van rond 170 µm te gebruiken.

anderzijds, aangezien de weergave AFM voor fysieke instabiliteit zeer gevoelig is, moet de steun voor dergelijke weergave zeer stabiel zijn. Met deze twee fundamentele vereisten in mening, ontwierp JPK CoverslipHolder en BioCell™ (Figuur 2). Beide steekproefhouders worden ontworpen om te houden coverslips voor, gecombineerde AFM en de lichte microscopieweergave uncompromised. Als dusdanig, met innovatieve steekproefhouders en het fundamentele ontwerp van de hoge instrumenten JPK, gelijktijdig, - de kwaliteit AFM en de de lichte microscopiebeelden kunnen worden verworven. Nochtans, om echt worden geïntegreerd hebben wij nu de eigenschap DirectOverlay™ (octrooi aangevraagd), een softwareoplossing geïntroduceerd die kaliberbepaling van het optische beeld en integratie in de software SPM impliceert.

Figuur 2. Biocell™ wordt ontworpen om beeldkwaliteit tijdens experimenten te optimaliseren die AFM en de lichte microscopie combineren terwijl tezelfdertijd het toestaan van temperatuurcontrole. De elementen van Peltier staan snelle aanpassing van temperatuur toe.

Piezos in Instrumenten JPK

Aangezien de optische microscopie op het gebruik van lenzen gebaseerd is, zullen om het even welke aberraties in dergelijke lenzen leiden tot vervormingen in het definitieve beeld. Nochtans, aangezien piezos in de instrumenten JPK gelineariseerd zijn is het beeld AFM nauwkeurig aan 4Å in de x en yrichtingen. Als dusdanig, in de meeste gevallen bedekken het beeld AFM en het de lichte microscopiebeeld niet nauwkeurig, met scheerbeurt of rek in het optische beeld een gemeenschappelijk probleem.

Aangezien het beeld AFM gebruikend zeer nauwkeurige gelineariseerde piezos wordt geproduceerd kan het als „echt-ruimte“ worden behandeld. Bovendien, aangezien de cantilever voor weergave AFM wordt gebruikt kan naar vaste punten worden verplaatst, evenals over de oppervlakte rooster- wordenafgetast, kan het worden gebruikt om het optische beeld te kalibreren dat. In het kort, wordt de cantilever verplaatst naar een reeks van 25 punten in realspace, gebruikend piezos. Op elk punt wordt een optisch beeld verworven en later wordt de uiteindeplaats binnen het optische beeld automatisch bepaald. Een transformatiefunctie wordt dan berekend gebruikend beide reeksen van 25 punten, en deze transformatie wordt toegepast op het optische beeld aangezien het in de software SPM wordt ingevoerd. Op zulke wijze is het optische beeld gekalibreerd en ingevoerd in het milieu SPM, in een geautomatiseerd proces.

Het Testen van de Kaliberbepaling van Optische Beelden

om de kaliberbepaling van het optische beeld te testen, waren de 50 NM fluorescente parels imaged gebruikend zowel AFM als epifluorescence en zowel untransformed als de omgezette optische die beelden met AFM worden vergeleken. Men kan zien dat er een scheerbeurt in de rechtse kant van untransformed optisch beeld is (figuur 3). Zodra de kaliberbepalingsprocedure is toegepast, echter, is de bekleding tussen de fluorescente en topografische signalen nauwkeurig (figuur 4).

De Figuur 3.Overlay van (rode) topografie en untransformed fluorescentie (groene) beelden van 50nm parels. Het lagere paneel is een reeks digitaal gezoem van de duidelijke gebieden. Terwijl in eerste twee van de gezoemde gebieden de bekleding goed is, in paneel 3 is er een scheerbeurt van het optische beeld.

De Figuur 4.Overlay van (rode) topografie en untransformed fluorescentie (groene) beelden van 50nm parels. Het zelfde gebied dat in Figuur 3 imaged was wordt hier getoond. In alle gezoemde gebieden is de bekleding nu nauwkeurig.

De voordelen van zulk een softwareeigenschap zijn uitgebreid. Bijvoorbeeld, in de vergelijking van fluorescentie en beelden AFM kunnen er gemakkelijk geen geïdentificeerde vaste punten zijn binnen de twee beelden om zulk een transformatie te leiden offline, noch zelfs de randen te bedekken. Zoals gezien in figuur 5, de bekleding van het beeld AFM van een fibroblast REF52 (transfected stabiel met YFP-Paxillin) en het overeenkomstige fluorescentiebeeld van de brandpuntsadhesie, zijn er geen punten in beide beelden die gemakkelijk voor gebruik kunnen worden geïdentificeerd in nauwkeurig het in kaart brengen van één beeld aan andere.

Figuur 5.Overlay van fluorescentie en topografie van REF52 fibroblastcellen. In paneel is A de omgezette van fluorescentiebeeld en B topografie. In C wordt een bekleding van twee getoond.

In dit geval is de brandpuntsadhesie aan de basiskant de cel en het beeld AFM produceert een topograph van de apicale kant van de cel. Aldus is het gebruik van de cantilever als hulpmiddel om het optische beeld te kalibreren essentieel. In figuur 6 wordt het verschil tussen het omgezette en niet-omgezette optische beeld getoond. In dit geval is het overheersende artefact een rek langs één as.

De Figuur 6.Overlay van een beeld dat (rood) en het zelfde beeld in zijn ruw is gekalibreerd, uncalibrated (groene) vorm wordt voorgesteld. Men kan duidelijk zien dat beeld wordt uitgerekt in één richting uncalibrated.

Bovendien, kan zulk een eigenschap de gebruiker een aanzienlijke hoeveelheid tijd besparen. Terwijl AFM hoge ruimteresolutie heeft, is de tijdelijke resolutie van de techniek veel lager dan dat van de lichte microscopie, wegens de langere aanwinstentijden. Met een gekalibreerd optisch beeld in de achtergrond van de software SPM (figuur 7), wordt de behoefte om een overzichtsAFM beeld van de cel te verwerven alvorens op een gebied van belang zich te concentreren verwijderd. Dit kan voor het aftasten van gebieden van een levende cel bijzonder belangrijk zijn, waar de tijd belangrijk kan zijn. Duidelijk, kunnen de forcespectroscopy punten ook op het optische beeld worden geselecteerd, opnieuw verwijderend de behoefte om een beeld te verwerven AFM alvorens de kracht-spectroscopie experimenten te beginnen. Toen a functionalized wordt het uiteinde gebruikt dit kritiek kon blijken, alsof een aftasten wordt genomen alvorens het de kracht-spectroscopie gegeven het uiteinde kan worden gepassiveerd wordt verkregen, leidend tot valse negatieve resultaten.

Figuur 7.Import van optische beelden in software SPM. Een gekalibreerd optisch beeld kan in de software worden ingevoerd SPM en op de achtergrond worden getoond. Dit staat de selectie van aftastengebieden en de kracht-spectroscopie punten toe op het optische beeld worden gebaseerd, verwijderend de behoefte aan een overzichtsAFM beeld dat.

Conclusie

De wijzigingen in het atoomontwerp van de krachtmicroscoop dat tot het leidde is installatie op een omgekeerde lichte microscoop in vitro openden de mogelijkheid voor de gelijktijdige aanwinst van licht en beelden AFM, essentieel voor het efficiënte onderzoek van cellen en biologische systemen. Nochtans voor ware optische integratie met AFM, wordt meer vereist dan enkel colocalisation van de twee microscopen. Een uiteindescanner is essentieel dusdanig dat de steekproef nog tijdens weergave AFM is, zodat de optische beelden kunnen worden verworven. De houders van de Steekproef moeten voor beide vormen van de microscopie worden geoptimaliseerd, d.w.z. dunne coverslips voor de lichte microscopie en stabiliteit voor weergave AFM. Tot Slot moet een gekalibreerd optisch beeld in de AFM weergavesoftware beschikbaar zijn, om nauwkeurige bekledingen, met artefacten van aberraties in het optische verwijderde beeld toe te laten. NanoWizard®II AFM verstrekt elk van deze eigenschappen, die voor het eerst ware integratie van optica en AFM toestaan.

Bron: Instrumenten JPK

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve Instrumenten JPK

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:52

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit