NanoWizard II Permite a Integração Verdadeira da Primeira Vez da Microscopia Óptica e Atômica da Força por Instrumentos de JPK

Assuntos Cobertos

Introdução
Integração do Microscópio Atômico da Força e do Fotomicroscópio Invertido
CoverslipHolder e BioCell Projectaram Aperfeiçoar a Qualidade da Imagem
Piezos em Instrumentos de JPK
Testando a Calibração de Imagens Ópticas
Conclusão

Introdução

A microscopia Atômica da força (AFM) e a microscopia óptica, em particular microscopia de fluorescência, fazem uma combinação poderosa no estudo de amostras biológicas. O AFM não é sujeito ao limite de definição do Abbe, e pode gerar imagens com muito mais de alta resolução uma fotomicroscopia do que. Contudo, como o contraste é gerado em resposta às propriedades estruturais da amostra, pode ser desafiante detectar estruturas específicas em uma amostra heterogênea, tal como uma pilha. Combinando as duas técnicas, uma informação estrutural mais de alta resolução pode ser gerada usando o AFM. A correlação Subseqüente com os marcadores fluorescente etiquetados pode fornecer a informação sobre a composição, e conseqüentemente a função, das estruturas identificadas.

Integração do Microscópio Atômico da Força e do Fotomicroscópio Invertido

O projecto do NanoWizard® e do NanoWizard®II AFM de JPK é tal que o microscópio atômico da força está integrado em um fotomicroscópio invertido, sem afetar sua funcionalidade. Isto permite que a imagem lactente do AFM seja combinada com as técnicas do contraste que incluem o contraste da fase, DIC, varredura do laser confocal e microscopia de TIRF. Um factor importante na eficácia desta integração é que os instrumentos de JPK são ponta-varredores. Isto é, durante a imagem lactente do AFM a amostra está guardarada ainda, quando a ponta se mover na forma da quadriculação sobre a superfície para construir a imagem. No caso dos instrumentos da amostra-exploração, a amostra a ser imaged está movendo-se constantemente na imagem óptica quando a exploração do AFM for em andamento, significado da microscopia que a imagem lactente simultânea verdadeira não é realmente possível (figura 1).

Figura 1. varredor da Ponta contra o varredor da amostra. A aquisição de imagens epifluorescent durante a aquisição da imagem do AFM com um varredor da ponta (a) e um varredor da amostra (b). Enquanto a amostra se está movendo em (b) as estruturas fluorescentes podem já não ser imaged sem manchar-se. A mesma pilha é mostrada em ambas as imagens.

CoverslipHolder e BioCell Projectaram Aperfeiçoar a Qualidade da Imagem

Quando estas características de projecto do hardware forem o começo de fornecer a integração verdadeira há igualmente outros factores que precisam de ser endereçados. O primeiro é o suporte da amostra usado. Porque o AFM e a microscopia óptica são técnicas fundamental diferentes (uma que está sendo baseado na interacção física e a outro na difracção da luz) há umas exigências diferentes para apoios eficazes da amostra. Para a aquisição das imagens ópticas de alta qualidade, particularmente com as lentes altas da ampliação (63x e 100x) é o melhor usar o tampa-vidro muito fino com uma espessura do µm ao redor 170.

por outro lado, como a imagem lactente do AFM é muito sensível à instabilidade física, o apoio para tal imagem lactente deve ser muito estável. Com estas duas exigências fundamentais na mente, JPK projectou o CoverslipHolder e o BioCell™ (Figura 2). Both of these suportes da amostra são projectados guardarar lamelas para AFM uncompromised, combinado e imagem lactente da fotomicroscopia. Como tal, com os suportes inovativos da amostra e o projecto fundamental dos instrumentos de JPK, o AFM simultâneo, de alta qualidade e as imagens da fotomicroscopia podem ser adquiridos. Contudo, para ser integrado verdadeiramente nós temos introduzido agora a característica de DirectOverlay™ (patente pendente), uma solução de software que envolvesse a calibração da imagem óptica e a integração no software de SPM.

Figura 2. O Biocell™ é projectado aperfeiçoar a qualidade da imagem durante as experiências que combinam o AFM e a fotomicroscopia ao ao mesmo tempo permitir o controle de temperatura. Os elementos de Peltier permitem o ajuste rápido da temperatura.

Piezos em Instrumentos de JPK

Porque a microscopia óptica é baseada no uso das lentes, todas as aberrações em tais lentes conduzirão às distorções na imagem final. Contudo, como os piezos nos instrumentos de JPK são tornados linear a imagem do AFM é precisa a 4Å nos sentidos de x e de y. Como tal, na maioria dos casos a imagem do AFM e a imagem da fotomicroscopia não overlay exactamente, com tesoura ou estiramento na imagem óptica um problema comum.

Enquanto a imagem do AFM é gerada usando piezos tornados linear muito precisos pode ser tratada como o “real-espaço”. Adicionalmente, como o modilhão usado para a imagem lactente do AFM pode ser movido para pontos fixos, assim como quadriculação-ser feito a varredura sobre a superfície, pode ser usada para calibrar a imagem óptica. Em curto, o modilhão é movido para um grupo de 25 pontos no realspace, usando os piezos. Em cada ponto uma imagem óptica é adquirida e o lugar da ponta dentro da imagem óptica é determinado subseqüentemente automaticamente. Uma função da transformação é calculada então usando ambos os grupos de 25 pontos, e esta transforma está aplicada à imagem óptica enquanto é importado no software de SPM. Em tal maneira a imagem óptica é calibrada e importada no ambiente de SPM, em um processo automatizado.

Testando a Calibração de Imagens Ópticas

A fim testar a calibração da imagem óptica, 50 grânulos fluorescentes do nanômetro eram imaged usando o AFM e o epifluorescence e as imagens ópticas untransformed e transformadas comparadas com o AFM. Pode-se ver que há uma tesoura no lado do assistente da imagem óptica untransformed (figura 3). Uma Vez Que o procedimento da calibração foi aplicado, contudo, a folha de prova entre os sinais fluorescentes e topográficos é precisa (figura 4).

Figure 3.Overlay da topografia (vermelha) e de imagens (verdes) untransformed da fluorescência dos grânulos 50nm. O painel mais baixo é um grupo de digital zumbe das regiões marcadas. Quando nos primeiros duas das regiões zumbidas a folha de prova for boa, no painel 3 há uma tesoura da imagem óptica.

Figure 4.Overlay da topografia (vermelha) e de imagens (verdes) untransformed da fluorescência dos grânulos 50nm. A mesma área que era imaged em Figura 3 é mostrada aqui. Em todas as regiões zumbidas a folha de prova é agora precisa.

Os benefícios de tal característica de software são extensivos. Por exemplo, na comparação da fluorescência e das imagens do AFM não pode haver uns pontos fixos facilmente identificados dentro das duas imagens para conduzir off line tal transformação, nem para overlay mesmo as bordas. Como visto em figura 5, a folha de prova da imagem do AFM de um fibroblasto REF52 (transfected estàvel com YFP-paxillin) e a imagem correspondente da fluorescência das adesões focais, lá não são nenhum ponto em ambas as imagens que podem facilmente ser identificadas para o uso exactamente em traçar uma imagem à outro.

Figure 5.Overlay da fluorescência e da topografia de pilhas do fibroblasto REF52. No painel A é a imagem transformada da fluorescência e topografia de B. Em C uma folha de prova dos dois é indicada.

Neste caso as adesões focais são no lado básico a pilha e a imagem do AFM gera um topograph do lado apical da pilha. Assim o uso do modilhão como uma ferramenta para calibrar a imagem óptica é essencial. Em figura 6 a diferença entre a imagem óptica transformada e não-transformada é indicada. Neste caso o produto manufacturado predominante é um estiramento ao longo de uma linha central.

Figure 6.Overlay de uma imagem que seja calibrada (vermelho) e a mesma imagem em seu formulário cru, uncalibrated (verde) é apresentado. Pode-se claramente ver que a imagem uncalibrated está esticada em um sentido.

Adicionalmente, tal característica pode salvar o usuário um a quantidade de tempo considerável. Quando o AFM tiver a definição espacial alta, a definição temporal da técnica é distante mais baixa do que aquela da fotomicroscopia, devido aos tempos mais longos da aquisição. Com uma imagem óptica calibrada na terra traseira do software de SPM (figura 7), a necessidade de adquirir uma imagem do AFM da vista geral da pilha antes de centrar-se sobre uma região de interesse é removida. Isto pode ser particularmente importante para a exploração das regiões de uma pilha viva, onde o tempo possa ser importante. Obviamente, os pontos forcespectroscopy podem igualmente ser seleccionados na imagem óptica, removendo outra vez a necessidade de adquirir uma imagem do AFM antes de começar a força-espectroscopia experimentam. Quando uma ponta functionalized está sendo usada esta poderia provar crítico, como se uma varredura é tomada antes que os dados da força-espectroscopia estejam obtidos a ponta pudessem ser passivated, conduzindo ao negativo falso resultassem.

Figure 7.Import de imagens ópticas no software de SPM. Uma imagem óptica calibrada pode ser importada no software de SPM e ser indicada no fundo. Isto permite a selecção das regiões da varredura e dos pontos da força-espectroscopia baseados na imagem óptica, removendo a necessidade para uma imagem do AFM da vista geral.

Conclusão

As alterações no projecto que atômico do microscópio da força aquela lhe conduziu são a instalação em um fotomicroscópio invertido abriram a possibilidade para a aquisição simultânea da luz e das imagens do AFM, crucial para a investigação eficaz das pilhas e de sistemas biológicos in vitro. Contudo para a integração óptica verdadeira com AFM, mais é exigido do que apenas o colocalisation dos dois microscópios. Um varredor da ponta é essencial tais que a amostra é ainda durante a imagem lactente do AFM, de modo que as imagens ópticas possam ser adquiridas. Os suportes da Amostra devem ser aperfeiçoados para ambos os formulários da microscopia, isto é lamelas finas para a fotomicroscopia e a estabilidade para a imagem lactente do AFM. Finalmente, uma imagem óptica calibrada deve estar disponível no software da imagem lactente do AFM, para permitir as folhas de prova exactas, com produtos manufacturados das aberrações na imagem óptica removida. O NanoWizard®II AFM fornece todas estas características, permitindo pela primeira vez a integração verdadeira do sistema ótico e do AFM.

Source: Instrumentos de JPK

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Instrumentos de JPK

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:20

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