NanoWizard II Позволяет для Внедрения Первого Раза Истинного Оптически и Атомной Микроскопии Усилия Аппаратурами JPK

Покрытые Темы

Введение
Внедрение Атомного Микроскопа Усилия и Перевернутого Светлого Микроскопа
CoverslipHolder и BioCell Конструировали Оптимизировать Качество Изображения
Piezos в Аппаратурах JPK
Испытывать Тарировку Оптически Изображений
Заключение

Введение

Атомная микроскопия усилия (AFM) и оптически микроскопия, в частности микроскопия флуоресцирования, делают мощную комбинацию в изучении биологических образцов. AFM не подлеубежал предел разрешения Abbe, и может произвести изображения с гораздо высокее разрешением чем светлая микроскопия. Однако, по мере того как контраст произведен в ответ на структурные свойства образца, он может быть трудный обнаружить специфические структуры в несродном образце, как клетка. Путем совмещать 2 метода, данные по более высокого разрешения структурные можно произвести используя AFM. Последующая корреляция с дневно обозначенными отметками может обеспечить информацию о составе, и следовательно функцию, определенных структур.

Внедрение Атомного Микроскопа Усилия и Перевернутого Светлого Микроскопа

Конструкция NanoWizard® и NanoWizard®II AFM от JPK такое что атомный микроскоп усилия интегрирован в перевернутый светлый микроскоп, без влияния своей функциональности. Это позволяет воображению AFM быть совмещенным с методами контраста включая контраст участка, DIC, просматривать лазера confocal и микроскопия TIRF. Важный фактор в эффективности этого внедрения что аппаратуры JPK подсказк-блоки развертки. То есть, во время воображения AFM образец держится все еще, пока подсказка двигает в способ растра над поверхностью для того чтобы построить изображение. В случае аппаратур образц-скеннирования, образец, котор нужно быть imaged постоянн двигает в оптически изображение пока скеннирование AFM в прогрессе, смысль микроскопии что истинное одновременное воображение действительно не возможно (диаграмма 1).

Диаграмма 1. блок развертки Подсказки против блока развертки образца. Прием epifluorescent изображений во время приема изображения AFM с блоком развертки подсказки (A) и блоком развертки образца (B). По Мере Того Как образец двигает в (B) дневные структуры могут больше не не быть imaged без мазать. Такая же клетка показана в обоих изображениях.

CoverslipHolder и BioCell Конструировали Оптимизировать Качество Изображения

Пока эти характеристики аппаратного проекта старт предусмотрения истинного внедрения также другие факторы которым нужно быть адресованным. Первое используемый держатель образца. По Мере Того Как AFM и оптически микроскопия методы принципиально иной (одно будучи основыванным на физическом взаимодействии и другое на дифракции света) различные требования для эффективных поддержек образца. Для приема высокомарочных оптически изображений, в частности с высокими объективами увеличения (63x и 100x) самое лучшее использовать очень тонкое защитное прозрачное стекло с толщиной µm вокруг 170.

с другой стороны, по мере того как воображение AFM очень чувствительно к физической нестабильности, поддержка для такого воображения должна быть очень стабилизирована. С этими 2 основными требованиями в разуме, JPK конструировало CoverslipHolder и BioCell™ (Диаграмму 2). Оба из этих держателей образца конструированы для того чтобы держать coverslips для uncompromised, совмещенного AFM и воображения светлой микроскопии. Как таковой, с новаторскими держателями образца и основной конструкцией аппаратур JPK, одновременный, высокомарочный AFM и изображения светлой микроскопии можно приобрести. Однако, для того чтобы быть поистине интегрировано мы теперь вводили характеристику DirectOverlay™ (патент ожидающий решения), программное решение которое включает тарировку оптически изображения и внедрение в ПО SPM.

Диаграмма 2. Biocell™ конструировано для того чтобы оптимизировать качество изображения во время экспериментов совмещая AFM и светлую микроскопию пока в тоже время позволяющ контролю температуры. Элементы Peltier позволяют быстрой регулировке температуры.

Piezos в Аппаратурах JPK

По Мере Того Как оптически микроскопия основана на пользе объективов, все аберрации в таких объективах ведут к искажениям в окончательном изображении. Однако, по мере того как линеаризованы piezos в аппаратурах JPK изображение AFM точно к 4Å в направлениях x и y. Как таковой, в большинств случаи изображение AFM и изображение светлой микроскопии точно overlay, с ножницами или простиранием в оптически изображении общяя проблема.

По Мере Того Как изображение AFM произведено используя очень точные линеаризованные piezos его можно обработать как «реальн-космос». Дополнительно, по мере того как cantilever используемый для воображения AFM можно двинуть к фиксированным точкам, так же, как растр-просмотреть над поверхностью, его можно использовать для того чтобы откалибрировать оптически изображение. Вкратце, cantilever двинут к комплекту 25 пунктов в realspace, используя piezos. На каждый этап оптически изображение приобретено и затем положение подсказки в пределах оптически изображения автоматически определено. Функция преобразовывать после этого высчитана используя оба комплекта 25 пунктов, и это преобразовывает прикладной к оптически изображению по мере того как оно импортировано в ПО SPM. Таким образом оптически изображение откалибрировано и импортировано в окружающую среду SPM, в автоматизированном процессе.

Испытывать Тарировку Оптически Изображений

Для того чтобы испытать тарировку оптически изображения, 50 шариков nm дневных были imaged используя и AFM и epifluorescence и и untransformed и преобразованные оптически изображения сравненные с AFM. Его можно увидеть что ножницы в стороне righthand untransformed оптически изображения (диаграммы 3). Как Только процедура по тарировки прикладной, однако, верхний слой между дневными и топографическими сигналами точен (диаграмма 4).

Вычисляйте 3.Overlay топографии (красной) и untransformed изображений флуоресцирования (зеленых) шариков 50nm. Более низкая панель комплект цифрового сигналит маркированных зон. Пока в первые 2 из просигналенных зон верхний слой хорош, в панели 3 ножницы оптически изображения.

Вычисляйте 4.Overlay топографии (красной) и untransformed изображений флуоресцирования (зеленых) шариков 50nm. Такая же область которая была imaged в Диаграмме 3 показана здесь. В всех просигналенных зонах верхний слой теперь точен.

Преимущества такой программной особенности обширны. На пример, в сравнении флуоресцирования и изображений AFM не могут быть легко определенных фиксированных точек в пределах 2 изображений для того чтобы дирижировать такое преобразование offline, ни даже overlay края. Как замечено в диаграммы 5, верхний слой изображения AFM фиброцита REF52 (стабилизированно transfected с YFP-paxillin) и соответствуя изображение флуоресцирования фокусных прилипаний, там отсутствие пунктов в обоих изображениях которые можно легко определить для пользы в точно отображать одно изображение к другому.

Вычисляйте 5.Overlay флуоресцирования и топографии клеток фиброцита REF52. В панели A преобразованное изображение флуоресцирования и топография B. В C верхний слой 2 показан.

В этот случай фокусные прилипания на базальной стороне клетка и изображение AFM производит topograph верхушечной стороны клетки. Таким Образом польза cantilever как инструмент для калибрировать оптически изображение необходима. В диаграмме 6 показана разница между преобразованным и non-преобразованным оптически изображением. В этот случай большей частью артефакт простирание вдоль одной оси.

Вычисляйте 6.Overlay изображения которое было откалибрировано (красный цвет) и такое же изображение в своей сырцовой, uncalibrated форме (зеленом цвете). Его можно ясно увидеть что uncalibrated изображение протягивано в одном направлении.

Дополнительно, такая характеристика может сохранить пользователя значительный объем времени. Пока AFM имеет высокое пространственное разрешение, височное разрешение метода далеко более низко чем разрешенииз светлой микроскопии, должно к более длинним временам приема. С откалибрированным оптически изображением в задней земле ПО SPM (извлекается диаграмма 7), потребность приобрести изображение AFM обзора клетки перед фокусировать на зоне интереса. Это может быть в частности важно для скеннирования зон живущей клетки, где время может быть важно. Очевидно, forcespectroscopy пункты можно также выбрать на оптически изображении, снова извлекая потребность приобрести изображение AFM перед начинать усили-спектроскопию экспериментируют. Когда functionalized подсказка используется это смогло доказать критическое, если развертка принята прежде чем данные по усили-спектроскопии получены подсказке могут быть запассивированы, водящ к ложным отрицательным результатам.

Вычисляйте 7.Import оптически изображений в ПО SPM. Откалибрированное оптически изображение можно импортировать в ПО SPM и показать на заднем плане. Это позволяет выбору зон развертки и пунктов усили-спектроскопии основанных на оптически изображении, извлекая потребность для изображения AFM обзора.

Заключение

Изменения в атомной конструкции микроскопа усилия то вело к ему установка на перевернутый светлый микроскоп раскрыли возможность для одновременного приема света и изображений AFM, критического для эффективного исследования клеток и биологических систем в vitro. Однако для истинного оптически внедрения с AFM, больше необходимо чем как раз colocalisation 2 микроскопов. Блок развертки подсказки необходим такие что образец все еще во время воображения AFM, так, что оптически изображения можно приобрести. Держатели Образца необходимо оптимизировать для обеих форм микроскопии, т.е. тонких coverslips для светлой микроскопии и стабилности для воображения AFM. Окончательно, откалибрированное оптически изображение должно быть доступно в ПО воображения AFM, включить точные верхние слои, с артефактами от аберраций в оптически извлекли изображении, котор. NanoWizard®II AFM обеспечивает всю из этих характеристик, позволяющ для the first time истинного внедрения оптики и AFM.

Источник: Аппаратуры JPK

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Аппаратуры JPK

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:23

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit