NanoWizard II Låter för Första Time Riktiga Integration av Optiskt, och Atom- StyrkaMicroscopy vid JPK Instrumenterar

Täckte Ämnen

Inledning
Integration av det Atom- StyrkaMikroskopet och det Inverterade Ljusa Mikroskopet
CoverslipHolder och BioCell Planlade Att Optimera Avbildar Kvalitets-
Piezos i JPK Instrumenterar
att Testa Kalibreringen av Optiskt Avbildar
Avslutning

Inledning

Atom- styrkamicroscopy (AFM) och optisk microscopy, i synnerhet fluorescencemicroscopy, gör en kraftig kombination i studien av biologiskt tar prov. AFM är inte att betvinga till Abbe'sens upplösning begränsar och kan frambringa avbildar med en mycket högre upplösning än lätt microscopy. Emellertid som kontrast frambrings som svar på den strukturella rekvisitan av ta prov, kan den vara utmana att avkänna närmare detalj strukturerar i ett heterogent tar prov, liksom en cell. Genom att kombinera de två teknikerna, kan strukturell information om högre, upplösning frambringas genom att använda AFM. Den Följande korrelationen med fluorescerande märkta markörer kan ge information om sammansättningen, och därför strukturerar fungera, av identifierad.

Integration av det Atom- StyrkaMikroskopet och det Inverterade Ljusa Mikroskopet

Designen av NanoWizard®en och NanoWizard®IIen AFM från JPK är sådan, att det atom- styrkamikroskopet integreras in i ett inverterat ljust mikroskop, utan att påverka dess funktionsduglighet. Detta låter AFM som avbildar för att kombineras med kontrasttekniker arrangerar gradvis däribland, kontrast, DIC, att avläsa för laser som är confocal och TIRF-microscopy. Ett viktigt dela upp i faktorer i effektiviteten av denna integration är att JPKEN instrumenterar är spets-bildläsare. Det är, under AFM som avbildar ta prov, rymms fortfarande, fördriver spetsflyttningarna i raster danar över ytbehandla för att bygga avbilda. I fallet av ta provscanningen instrumenterar, ta prov som ska avbildas, är constantly inflyttningen som den optiska microscopyen föreställer stundAFM-scanningen är pågående, menande som riktigt samtidigt avbilda inte är egentligen möjligheten (figurera 1).

Figurera 1. Tippa bildläsaren vs tar prov bildläsaren. Förvärvet av epifluorescent avbildar under AFM avbildar förvärvet med en spetsbildläsare (A) och en ta provbildläsare (B). Som ta prov är, inflyttning (B) som det fluorescerande strukturerar, kan ej längre avbildas, utan sudd. Den samma cellen visas i båda avbildar.

CoverslipHolder och BioCell Planlade Att Optimera Avbildar Kvalitets-

Fördriva dessa särdrag för maskinvarudesignen är starten av att ge riktig integration där är annan dela upp i faktorer också det behov att tilltalas. Första är den använda ta provhållaren. Som AFM och optisk microscopy är grundläggande olika tekniker (en som baseras på läkarundersökningväxelverkan, och annan på diffractionen av ljust) finns det olika krav för effektivt tar prov service. För det högkvalitativ optiska förvärvet av avbildar, bestämt med kickförstoringslinser (63x och 100x) som den är bäst att använda mycket tunt täcka-exponeringsglas med en tjocklek av µm omkring 170.

Å andra sidan som att avbilda för AFM är mycket känsligt till läkarundersökningostadighet, måste servicen för sådan avbilda vara mycket stabil. Med dessa två grundkrav i åtanke, planlade JPK CoverslipHolderen och BioCell™en (Figurera 2). Båda av dessa tar prov hållare planläggs att rymma coverslips för uncompromised kombinerad AFM och ljust avbilda för microscopy. Som sådan, med innovativt ta prov hållare, och grunddesignen av JPKEN instrumenterar, samtidig högkvalitativ AFM, och ljus microscopy avbildar kan fås. Emellertid för att vara riktigt integrerat har vi nu introducerat det DirectOverlay™ särdrag (patenterat oavgjort), en programvarulösning som gäller kalibreringen av det optiskt avbildar och integration in i SPM-programvaran.

Figurera 2. Biocell™en planläggs för att optimera avbildar kvalitets- under experiment som kombinerar AFM, och ljusa microscopystunder som låter temperatur, kontrollerar samtidigt. Peltier beståndsdelar låter forjustering av temperaturen.

Piezos i JPK Instrumenterar

Som optisk microscopy baseras på bruket av linser, avbildar några avvikelser i sådan linser ska bly- till distorsioner i finalen. Emellertid som piezosna i JPKEN instrumenterar, linearizeds AFMEN avbildar är preciserar till 4Å i x- och y-riktningarna. Som sådan, ofta avbildar AFMEN, och den ljusa microscopyen avbildar överdrar inte exakt, med sax, eller elasticiteten i det optiskt avbildar ett allmänningproblem.

Som AFMEN avbildar är frambragt använda mycket preciserar linearized piezos som den kan behandlas som ”verklig-utrymme”. Dessutom som cantileveren som används för att avbilda för AFM, kan vara rörd till fixat, pekar, såväl som raster-avläst över ytbehandla, det kan vara van vid kalibrerar det optiskt avbildar. I kort stavelse är cantileveren rörd till en uppsättning av 25 pekar i realspace, genom att använda piezosna. På varje peka ett optiskt avbildar fås, och därpå avbildar spetsläget inom det optiskt är automatiskt beslutsamt. En omformning fungerar beräknas därefter genom att använda båda uppsättningar av 25 pekar, och denna omformar appliceras till det optiskt avbildar, som den importeras in i SPM-programvaran. I sådan långt avbildar de optiska kalibreras, och importerat in i SPM-miljön, i ett automatiserat bearbeta.

att Testa Kalibreringen av Optiskt Avbildar

För att testa kalibreringen av det optiskt avbilda, avbildades 50 som fluorescerande nm pryder med pärlor, genom att använda både AFM, och epifluorescencen och både det untransformed och omformade optiskt avbildar jämfört med AFMEN. Det kan ses att det finns en sax i högersidan av det untransformed optiskt avbildar (figurera 3). (Figurera 4), När kalibreringstillvägagångssättet har applicerats, emellertid, signalerar överdra mellan det fluorescerande och topographic är preciserar.

Figurera 3.Overlay av (röd) topografi, och untransformed fluorescence (gräsplan) avbildar av 50nm pryder med pärlor. Den lägre panelen är en uppsättning av digitalt zoom av de markerade regionerna. Stunden i de första tvåna av de zoom regionerna överdra är bra, i panel 3 där är en sax av det optiskt avbildar.

Figurera 4.Overlay av (röd) topografi, och untransformed fluorescence (gräsplan) avbildar av 50nm pryder med pärlor. Det samma området, som avbildades in, Figurerar 3 visas här. Sammanlagt preciserar zoom regioner som överdra är nu.

Gynnar av ett sådan programvarusärdrag är omfattande. För anföra som exempel, i jämförelsen av fluorescence och AFM avbildar där kan inte lätt identifieras fixat pekar inom tvåna avbildar för att föra en sådan omformning offline, nor även att överdra kantar. Som sett in figurera 5, avbildar överdra av AFMEN av en fibroblast REF52 (fast transfected med YFP-paxillin), och den motsvarande fluorescencen avbildar av de fokal- adhesionsna, där är ingen pekar i båda avbildar som kan lätt identifieras för bruk, i exakt att kartlägga en, avbildar till annat.

Figurera 5.Overlay av fluorescence och topografi av celler för fibroblasten REF52. I panel är A den omformade fluorescencen avbildar och B-topografi. I C visas en överdra av tvåna.

I detta fall är de fokal- adhesionsna på den grundläggande sidan cellen, och AFMEN avbildar frambringar en topograph av den apical sidan av cellen. Således avbildar bruket av cantileveren som en bearbeta för kalibrering det optiskt är nödvändigt. I figurera 6 skillnaden mellan omformat och non-omformat optiskt avbilda visas. I detta fall är den dominera artefacten en elasticitet längs en axel.

Figurera 6.Overlay av en avbilda, som har kalibrerats (rött), och samma avbildar i dess rått som är uncalibrated bildar (gräsplan) framläggas. Det kan klart ses att de uncalibrated avbildar sträcks i en riktning.

Dessutom kan ett sådan särdrag räddningen användaren per betydlig tidsperiod. Stunden AFM har rumslig upplösning för kick, den temporal upplösningen av tekniken är långt lägre än det av ljus microscopy, tack vare de längre förvärvtiderna. Med ett kalibrerat optiskt avbilda i baksidaen som malas av SPM-programvaran (figurera 7), behovet att få en överblick AFM avbildar av cellen, innan du fokuserar på en region av, intresserar tas bort. Detta kan vara bestämt viktigt för scanningen av regioner av en bosatt cell, var tid kan vara viktig. Självfallet forcespectroscopy pekar kan också vara utvalt på det optiskt avbildar och igen att ta bort behovet att få en AFM avbildar, för den starta styrka-spektroskopin experimenterar. När en functionalized spets används, kunde denna bevisa kritiskt, som, om en bildläsning tas, för styrka-spektroskopin datan erhålls spetsen kan passivateds och att leda till den falska negationen resulterar.

Figurera 7.Import av optiskt avbildar in i SPM-programvara. Ett kalibrerat optiskt avbildar kan importeras in i SPM-programvaran och visas i bakgrunden. Detta låter valet av bildläsningsregioner, och styrka-spektroskopin pekar baserat på det optiskt avbildar och att ta bort behovet för en överblick AFM avbildar.

Avslutning

Förändringarna i det atom- styrkamikroskopet planlägger som ledde till den är installation på ett inverterat ljust mikroskop öppnade möjligheten för det samtidiga förvärvet av ljust, och AFM avbildar, avgörande för den effektiva utredningen av celler och biologiska system in vitro. Emellertid för riktig optisk integration med AFM, krävs mer än precis colocalisationen av de två mikroskopen. En spetsbildläsare är nödvändigt sådan att ta prov är stilla under AFM som avbildar, så att optiskt avbildar kan fås. Ta Prov hållare måste optimeras för båda bildar av microscopy, dvs. tunna coverslips för ljus microscopy och stabilitet för att avbilda för AFM. Slutligen avbildar ett kalibrerat optiskt måste vara tillgängligt i AFMEN som avbildar programvara, för att möjliggöra exakt, överdrar, med artefacts från avvikelser i det optiskt avbildar borttaget. NanoWizard®IIen AFM ger alla dessa särdrag och att låta för den riktiga integrationen för första tid av optik och AFM.

Källa: JPK Instrumenterar

För mer information på denna källa behaga besök JPK Instrumenterar

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:30

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit