NanoWizard II 允许光学和基本强制显微学的第一次真的综合化由 JPK 仪器

包括的事宜

简介
基本强制显微镜和被倒置的光学显微镜的综合化
CoverslipHolder 和 BioCell 设计优选图象质量
在 JPK 仪器的 Piezos
测试光学图象的定标
结论

简介

基本强制显微学 (AFM)和光学显微学,特别是荧光显微法,在生物范例的研究中做一个强大的组合。 AFM 不是受神父的决议界限支配,并且可能生成与高分辨率比光学显微学的图象。 然而,当对比被生成以回应范例的结构上的属性,它可以是富挑战性检测在一个异种范例的特定结构,例如细胞。 使用 AFM,通过结合二个技术,更加高分辨率的结构信息可以被生成。 与萤光被标记的标记的随后的相关性可能提供关于构成的信息和因而功能的被识别的结构。

基本强制显微镜和被倒置的光学显微镜的综合化

NanoWizard®NanoWizard®IIJPK 的 AFM 的设计是这样基本强制显微镜是集成到一个被倒置的光学显微镜,无需影响其功能。 这允许 AFM 想象与对比技术结合包括阶段对比, DIC,激光浏览共焦和 TIRF 显微学。 在此综合化效力的一个重要因素是 JPK 仪器是技巧扫描程序。 即,而这个技巧以在表面的光栅方式移动建立这个图象,在 AFM 想象期间这个范例仍然被暂挂。 一旦范例扫描仪器,是这个的范例印象的经常移动光学显微学照片,当 AFM 扫描进展中时,含义真的同时想象不是确实可能的 (图 1)。

图 1. 技巧扫描程序与范例扫描程序。 epifluorescent 图象的购买在 AFM 与技巧扫描程序 (a) 和范例扫描程序 (b) 的图象购买时。 当这个范例移动在 (b) 萤光结构可能不再是印象的,无需抹上。 同一个细胞在两个图象显示。

CoverslipHolder 和 BioCell 设计优选图象质量

当这些硬件设计功能是提供真的综合化时起始时间也有需要解决的其他系数。 第一是使用的范例持有人。 因为 AFM 和光学显微学是功能上不同的技术 (在实际交往基础上的一和其他光的衍射) 有有效范例技术支持的不同的需求。 对于优质光学图象的购买,特别地与高放大透镜 (63x 和 100x) 使用非常与大约 170 µm 的厚度的稀薄的盖子玻璃是最佳的。

另一方面,因为 AFM 想象对实际不稳定性是非常敏感的,技术支持这样想象一定是非常稳定的。 想着这两个根本需求, JPK 设计了 CoverslipHolderBioCell™ (图 2)。 这两个范例持有人被设计拿着没有暴露,联合的 AFM 和光学显微学想象的盖玻片。 同样地,与创新范例持有人和 JPK 仪器的根本设计,同时,优质 AFM 和光学显微学图象可以获取。 然而,是正确地集成我们现在引入 DirectOverlay™功能 (专利审理的),介入光学图象定标和综合化到 SPM 软件的软件解决方法。

图 2。 Biocell™被设计优选图象质量在结合 AFM 和光学显微学的实验期间,当同时允许温度控制时。 塞贝克要素允许温度的迅速调整。

在 JPK 仪器的 Piezos

因为光学显微学在使用透镜基础上,在这样透镜的所有变型将导致在最终图象的畸变。 然而,因为在 JPK 仪器的 piezos 线性化 AFM 图象是准确的对在 x 和 y 方向的 4Å。 同样地,在许多情况下 AFM 图象和光学显微学图象不准确地躺在,与剪或舒展在光学图象一个常见的问题。

当 AFM 图象被生成使用非常准确的线性化的 piezos 它可以对待 “实际空间”。 另外,当用于 AFM 想象的悬臂可以被移动向固定点,以及光栅浏览在表面,它可以用于校准光学图象。 简而言之,使用 piezos,悬臂被移动向一套在 realspace 的 25 点。 在每点一个光学图象获取,并且自动地随后确定在光学图象内的技巧地点。 使用两套 25 点,变换功能然后被计算,并且这变换适用于光学图象,当它被导入到 SPM 软件。 用这样方式光学图象被校准并且被导入到 SPM 环境,在一个自动化的进程中。

测试光学图象的定标

为了测试光学图象的定标, 50 个毫微米萤光小珠使用 AFM 和 epifluorescence 是印象的和 untransformed 和被变换的光学图象比较 AFM。 能被看见有在这个 untransformed 光学图象 (图 3) 的右边的剪。 一旦运用了定标程序,然而,在萤光和地形学信号之间的重叠是准确的 (图 4)。

地势 (红色) 和 50nm 小珠的 untransformed 荧光 (绿色) 图象 3.Overlay。 这个更低的面板是一套数字式迅速移动明显地区。 当在第一二迅速移动的地区中重叠是好时,在面板 3 有光学图象的剪。

地势 (红色) 和 50nm 小珠的 untransformed 荧光 (绿色) 图象 4.Overlay。 是印象的在表 3 的同一区显示得这里。 在所有迅速移动的地区重叠现在是准确的。

这样软件特点的福利是广泛的。 例如,在荧光和 AFM 图象比较可能没有在执行这样转换脱机,亦不甚而躺在边缘的二个图象内的容易地被识别的固定点。 如在图 5 中看到, REF52 成纤维细胞的 AFM 图象的重叠 (稳定地 transfected 与 YFP-paxillin) 和焦点黏附力的对应的荧光图象,那里是在可能容易地被识别用于准确映射对其他的一个图象的两个图象的没有点。

REF52 成纤维细胞细胞荧光和地势 5.Overlay。 在面板 A 是被变换的荧光图象和 B 地势。 用 C 重叠二被显示。

在这种情况下焦点黏附力是在这个基础端这个细胞,并且 AFM 图象生成细胞的顶端端的 topograph。 因而使用悬臂作为为校准光学图象的一个工具是重要的。 在表 6 这个被变换的和非被变换的光学图象之间的区别被显示。 在这种情况下主要人工制品是沿一个轴的舒展。

被校准了图象的 6.Overlay (红色) 和同一个图象以其原始,未校正的形式 (绿色) 存在。 能明显地被看见这个未校正的图象在一个方向被舒展。

另外,这样功能可能救这个用户相当数量的时刻。 当 AFM 有高空间分辨率时,这个技术的时间分辨率低于那光学显微学,由于更久的购买时代。 在 SPM 软件的回到陆运的一个被校准的光学图象 (需要在着重获取这个细胞的概览 AFM 图象区域前利益去除图 7)。 这可以是特别重要对一个活细胞的地区扫描,时间可能是重要的。 明显地, forcespectroscopy 点在光学图象可能也被选择,再取消需要在开始强制分光学前获取 AFM 图象试验。 当使用时一个 functionalized 技巧这可能证明重要,好象扫描被采取,在强制分光学数据得到这个技巧可能被钝化,导致错误地否定发生前。

光学图象 7.Import 到 SPM 软件。 一个被校准的光学图象在这个背景中可以被导入到 SPM 软件和被显示。 这允许选择在光学图象基础上和强制分光学点的扫描地区,取消需要对于概览 AFM 图象。

结论

那导致它在基本强制显微镜设计的改变是一个被倒置的光学显微镜的安装开辟了光和 AFM 图象的同时购买的可能性,关键为细胞和生物系统的有效调查体外。 然而对于与 AFM 的真的光学综合化,更多比二个显微镜的 colocalisation 是必需的。 技巧扫描程序是重要的这样在 AFM 想象期间,这个范例仍然是,因此光学图象可以获取。 必须为显微学的两份表单,即光学显微学和稳定性的稀薄的盖玻片优选范例持有人 AFM 想象的。 终于,一个被校准的光学图象一定取得到在 AFM 想象软件,启用准确重叠,有从变型的人工制品的在被去除的光学图象。 NanoWizard®II AFM 提供所有这些功能,第一次允许光学和 AFM 的真的综合化。

来源: JPK 仪器

关于此来源的更多信息请参观 JPK 仪器

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:46

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