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讨论主题
简介
集成的原子力显微镜和光学显微镜倒置
CoverslipHolder和BioCell设计，以优化图像质量
Piezos在JPK仪器
测试光学图像校准
结论
简介
原子力显微镜（AFM）和光学显微镜，荧光显微镜，尤其是在生物样品的研究，使一个强大的组合。原子力显微镜是不受阿贝的分辨率极限，并能产生更高的分辨率比光学显微镜图像。然而，作为对比的是样品的结构特性产生，它可以在一个异构的样本，如一个细胞，具有挑战性的检测特定结构。两种技术相结合，产生更高分辨率的结构信息，可以用原子力显微镜。随后与荧光标记的标记的相关性，可以提供信息的组成，功能，从而确定结构。
集成的原子力显微镜和光学显微镜倒置
从JPK NanoWizard ®和NanoWizard ® II原子力显微镜的设计，集成到一个倒置光显微镜，在不影响其功能的情况下，原子力显微镜。这使得原子力显微镜成像与对比度技术，包括相衬，迪爱生，激光扫描共聚焦，TIRF显微镜结合。在这种融合的疗效的重要因素是， JPK仪器是针尖扫描仪。这是在原子力显微镜成像，样品仍然举行，而针尖在表面移动光栅方式建立图像。在样品扫描仪器的情况下，成像的样品是不断移动的光学显微镜图片，而AFM扫描过程中，这意味着真正的同步成像是不是真的有可能（图1）。
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图1。提示扫描仪对样品的扫描仪。一个提示扫描仪（A）和样品台扫描仪（二）在原子力显微镜图像采集，收购啶图像。 （二）由于样品正朝着的荧光结构不再影像无拖尾。同一单元格中显示两个图像。
CoverslipHolder和BioCell设计，以优化图像质量
虽然这些硬件的设计特点是提供真正的融合，也有其他因素，需要加以解决的开始。首先是使用的样品架。由于原子力显微镜和光学显微镜是根本不同的技术（其中之一是根据光的衍射物理相互作用和其他）有不同的要求有效样本的支持。对于收购高品质的光学图像，尤其是高倍率镜头（63X和100X），它是最好使用的约170微米的厚度非常薄的玻璃盖。
另一方面，作为原子力显微镜成像是非常敏感的身体不稳定，这种成像的支持，必须非常稳定。心中有了这两个基本要求， JPK设计CoverslipHolder BioCell™ （图2）。这些样本的持有人都是被设计为不打折扣，结合原子力显微镜和光学显微镜成像盖玻片。因此，创新的样品架和设计的根本JPK仪器，同时，高品质的原子力显微镜和光学显微镜图像可以被收购。然而，要真正集成的，我们现在已经推出DirectOverlay™功能（正在申请专利的），一个软件解决方案，涉及到的光学图像和整合的SPM软件校准。
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图2。 Biocell™是设计在结合原子力显微镜和光学显微镜，而在同一时间允许的温度控制实验，以优化图像质量。佩尔蒂埃元素允许的温度迅速调整。
Piezos在JPK仪器
由于光学显微镜的基础上使用的镜头，这种镜片在任何畸变，将导致在最终图像扭曲。然而，在piezos JPK仪器线性原子力显微镜图像在X和Y方向的4A精确。因此，在大多数情况下的原子力显微镜图像和光学显微镜图像不准确的叠加，一个共同的问题的光学图像的剪切或舒展。
由于原子力显微镜图像生成使用非常精确的线性piezos的，它可以被视为“真正的空间”。此外，由于可用于原子力显微镜成像的悬臂移动到固定点，以及光栅扫描表面，它可以用来校正光学图像。总之，悬臂移动到一个25 realspace点的设置，使用piezos。在每个点上获得光学图像，随后内光学图像的一角位置自动确定。转换功能，然后使用两套25分计算，此变换应用于光学图像，因为它是进口到SPM软件。在这样一种方式的光学图像进行校准和进口到SPM环境，在一个自动化的过程。
测试光学图像校准
为了测试光学图像校准用原子力显微镜和epifluorescence和未转化和转化的光学图像与原子力显微镜相比，50纳米的荧光珠成像。由此可以看出，在未转换的光学图像（图3）的右侧，有一个剪。一旦校准过程中得到了应用，然而，荧光灯和地形信号之间的重叠是精确的（图4）。
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图3。覆盖的地形（红色）和未转换的荧光（绿色）50纳米珠的图像。下部面板上的显着区域的一组数码变焦。虽然前两个缩放地区覆盖好，在第3小组有一个光学图像的剪切。
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图4。覆盖的地形（红色）和未转换的荧光（绿色）50纳米珠的图像。同一地区，在图3成像显示在这里。在所有放大的区域覆盖现在是准确的。
这样的软件功能的好处是多方面的。例如，在荧光和原子力显微镜图像的比较有可能不容易确定固定点，在两个图像进行这样的改造脱机，甚至也没有覆盖的边缘。正如在图5可以看出，一个REF52成纤维细胞（YFP - Paxillin的稳定转染）和粘着斑相应的荧光图像的原子力显微镜图像的叠加，有没有点都可以很容易地识别图像中准确地使用一个图像映射到另一边。
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图5。REF52成纤维细胞的荧光和地形的覆盖。在面板，一个是转换的荧光图像和B地形。在C两个叠加显示。
在这种情况下，重点粘连在基底细胞和原子力显微镜图像生成一个根尖细胞的地形图。因此，使用的悬臂作为校正光学图像的工具是必不可少的。在图6中的转化和非转化的光学图像之间的差别显示出来。在这种情况下，占主导地位的人为的是一片沿一轴。
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图6。叠加一个已校准的图像（红色）和其原料，未校准的形式（绿色）在相同的图像。它可以清楚地看出，未校准的图像是在一个方向伸展。
此外，这种功能可以节省用户一个相当长的时间。虽然原子力显微镜具有高空间分辨率，时间分辨率的技术远远比光学显微镜，由于采集时间较长。随着校准的SPM软件（图7），集中在感兴趣的区域之前，需要获得细胞的AFM图像概述回地面的光学图像被删除。扫描一个活细胞，时间可能是重要的的区域，这可以是特别重要的。显然，forcespectroscopy点也可以选择上的光学图像，再取出需要获得前开始生效光谱实验的原子力显微镜图像。当官能提示正在使用，这可能被证明是至关重要的，如果扫描力光谱数据之前得到钝化，头可能会导致假阴性结果。
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图7。光学图像导入的SPM软件。校准的光学图像可以被导入到SPM软件，并在后台显示。这使得基于光学图像的扫描区域和力量光谱点的选择，删除概述AFM图像的需要。
结论
在原子力显微镜的设计，LED倒光镜，它的安装改建开光与原子力显微镜图像的同步采集，体外培养的细胞和生物系统的有效的调查至关重要的可能性。然而，真正的原子力显微镜的光学器件集成，更多的是需要的不仅仅是两个显微镜colocalisation。一个提示扫描仪是必不可少的样品仍然是在原子力显微镜成像，使光学图像可以获取。样品持有人必须为优化显微镜两种形式，即薄光镜和原子力显微镜成像稳定的盖玻片。最后，经过校准的光学图像，必须在原子力显微镜成像软件，准确的叠加，使文物在光学删除图像畸变。 NanoWizard ® II原子力显微镜提供所有这些功能，光学和原子力显微镜首次真正的融合。
资料来源：JPK仪器
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