NanoWizard II 允許光學和基本強制顯微學的第一次真的綜合化由 JPK 儀器

包括的事宜

簡介
基本強制顯微鏡和被倒置的光學顯微鏡的綜合化
CoverslipHolder 和 BioCell 設計優選圖像質量
在 JPK 儀器的 Piezos
測試光學圖像的定標
結論

簡介

基本強制顯微學 (AFM)和光學顯微學,特別是熒光顯微法,在生物範例的研究中做一個強大的組合。 AFM 不是受神父的決議界限支配,并且可能生成與高分辨率比光學顯微學的圖像。 然而,當對比被生成以回應範例的結構上的屬性,它可以是富挑戰性檢測在一個異種範例的特定結構,例如細胞。 使用 AFM,通過結合二個技術,更加高分辨率的結構信息可以被生成。 與螢光被標記的標記的隨後的相關性可能提供關於構成的信息和因而功能的被識別的結構。

基本強制顯微鏡和被倒置的光學顯微鏡的綜合化

NanoWizard®NanoWizard®IIJPK 的 AFM 的設計是這樣基本強制顯微鏡是集成到一個被倒置的光學顯微鏡,无需影響其功能。 這允許 AFM 想像與對比技術結合包括階段對比, DIC,激光瀏覽共焦和 TIRF 顯微學。 在此綜合化效力的一個重要因素是 JPK 儀器是技巧掃描程序。 即,而這個技巧以在表面的光柵方式移動建立這個圖像,在 AFM 想像期間這個範例仍然被暫掛。 一旦範例掃描儀器,是這個的範例印象的經常移動光學顯微學照片,當 AFM 掃描進展中時,含義真的同時想像不是確實可能的 (圖 1)。

圖 1. 技巧掃描程序與範例掃描程序。 epifluorescent 圖像的購買在 AFM 與技巧掃描程序 (a) 和範例掃描程序 (b) 的圖像購買時。 當這個範例移動在 (b) 螢光結構可能不再是印象的,无需抹上。 同一個細胞在兩個圖像顯示。

CoverslipHolder 和 BioCell 設計優選圖像質量

當這些硬件設計功能是提供真的綜合化時起始時間也有需要解決的其他系數。 第一是使用的範例持有人。 因為 AFM 和光學顯微學是功能上不同的技術 (在實際交往基礎上的一和其他光的衍射) 有有效範例技術支持的不同的需求。 對於優質光學圖像的購買,特別地與高放大透鏡 (63x 和 100x) 使用非常與大約 170 µm 的厚度的稀薄的蓋子玻璃是最佳的。

另一方面,因為 AFM 想像對實際不穩定性是非常敏感的,技術支持這樣想像一定是非常穩定的。 想著這兩個根本需求, JPK 設計了 CoverslipHolderBioCell™ (圖 2)。 這兩個範例持有人被設計拿著沒有暴露,聯合的 AFM 和光學顯微學想像的蓋玻片。 同樣地,與創新範例持有人和 JPK 儀器的根本設計,同時,優質 AFM 和光學顯微學圖像可以獲取。 然而,是正確地集成我們現在引入 DirectOverlay™功能 (專利審理的),介入光學圖像定標和綜合化到 SPM 軟件的軟件解決方法。

圖 2。 Biocell™被設計優選圖像質量在結合 AFM 和光學顯微學的實驗期間,當同時允許溫度控制時。 塞貝克要素允許溫度的迅速調整。

在 JPK 儀器的 Piezos

因為光學顯微學在使用透鏡基礎上,在這樣透鏡的所有變型將導致在最終圖像的畸變。 然而,因為在 JPK 儀器的 piezos 線性化 AFM 圖像是準確的對在 x 和 y 方向的 4Å。 同樣地,在許多情況下 AFM 圖像和光學顯微學圖像不準確地躺在,與剪或舒展在光學圖像一個常見的問題。

當 AFM 圖像被生成使用非常準確的線性化的 piezos 它可以對待 「實際空間」。 另外,當用於 AFM 想像的懸臂可以被移動向固定點,以及光柵瀏覽在表面,它可以用於校準光學圖像。 簡而言之,使用 piezos,懸臂被移動向一套在 realspace 的 25 點。 在每點一個光學圖像獲取,并且自動地隨後確定在光學圖像內的技巧地點。 使用兩套 25 點,變換功能然後被計算,并且這變換適用於光學圖像,當它被導入到 SPM 軟件。 用這樣方式光學圖像被校準并且被導入到 SPM 環境,在一個自動化的進程中。

測試光學圖像的定標

為了測試光學圖像的定標, 50 個毫微米螢光小珠使用 AFM 和 epifluorescence 是印象的和 untransformed 和被變換的光學圖像比較 AFM。 能被看見有在這個 untransformed 光學圖像 (圖 3) 的右邊的剪。 一旦運用了定標程序,然而,在螢光和地形學信號之間的重疊是準確的 (圖 4)。

地勢 (紅色) 和 50nm 小珠的 untransformed 熒光 (綠色) 圖像 3.Overlay。 這個更低的面板是一套數字式迅速移動明顯地區。 當在第一二迅速移動的地區中重疊是好時,在面板 3 有光學圖像的剪。

地勢 (紅色) 和 50nm 小珠的 untransformed 熒光 (綠色) 圖像 4.Overlay。 是印象的在表 3 的同一區顯示得這裡。 在所有迅速移動的地區重疊現在是準確的。

這樣軟件特點的福利是廣泛的。 例如,在熒光和 AFM 圖像比較可能没有在執行這樣轉換脫機,亦不甚而躺在邊緣的二個圖像內的容易地被識別的固定點。 如在圖 5 中看到, REF52 成纖維細胞的 AFM 圖像的重疊 (穩定地 transfected 與 YFP-paxillin) 和焦點黏附力的對應的熒光圖像,那裡是在可能容易地被識別用於準確映射對其他的一個圖像的兩個圖像的沒有點。

REF52 成纖維細胞細胞熒光和地勢 5.Overlay。 在面板 A 是被變換的熒光圖像和 B 地勢。 用 C 重疊二被顯示。

在這種情況下焦點黏附力是在這個基礎端這個細胞,并且 AFM 圖像生成細胞的頂端端的 topograph。 因而使用懸臂作為為校準光學圖像的一個工具是重要的。 在表 6 這個被變換的和非被變換的光學圖像之間的區別被顯示。 在這種情況下主要人工製品是沿一個軸的舒展。

被校準了圖像的 6.Overlay (紅色) 和同一個圖像以其原始,未校正的形式 (綠色) 存在。 能明顯地被看見這個未校正的圖像在一個方向被舒展。

另外,這樣功能可能救這個用戶相當數量的時刻。 當 AFM 有高空間分辨率時,這個技術的時間分辨率低於那光學顯微學,由於更久的購買時代。 在 SPM 軟件的回到陸運的一個被校準的光學圖像 (需要在著重獲取這個細胞的概覽 AFM 圖像區域前利益去除圖 7)。 這可以是特別重要對一個活細胞的地區掃描,時間可能是重要的。 明顯地, forcespectroscopy 點在光學圖像可能也被選擇,再取消需要在開始強制分光學前獲取 AFM 圖像試驗。 當使用時一個 functionalized 技巧這可能證明重要,好像掃描被採取,在強制分光學數據得到這個技巧可能被鈍化,導致錯誤地否定發生前。

光學圖像 7.Import 到 SPM 軟件。 一個被校準的光學圖像在這個背景中可以被導入到 SPM 軟件和被顯示。 這允許選擇在光學圖像基礎上和強制分光學點的掃描地區,取消需要對於概覽 AFM 圖像。

結論

那導致它在基本強制顯微鏡設計的改變是一個被倒置的光學顯微鏡的安裝開闢了光和 AFM 圖像的同時購買的可能性,關鍵為細胞和生物系統的有效調查體外。 然而對於與 AFM 的真的光學綜合化,更多比二個顯微鏡的 colocalisation 是必需的。 技巧掃描程序是重要的這樣在 AFM 想像期間,這個範例仍然是,因此光學圖像可以獲取。 必須為顯微學的兩份表單,即光學顯微學和穩定性的稀薄的蓋玻片優選範例持有人 AFM 想像的。 終於,一個被校準的光學圖像一定取得到在 AFM 想像軟件,啟用準確重疊,有從變型的人工製品的在被去除的光學圖像。 NanoWizard®II AFM 提供所有這些功能,第一次允許光學和 AFM 的真的綜合化。

來源: JPK 儀器

關於此來源的更多信息请請參觀 JPK 儀器

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:49

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