Usando la Microscopia Atómica de la Fuerza Para Determinar las Propiedades Elásticos de Muestras Biológicas por los Instrumentos de JPK

Temas Revestidos

Introducción
Los Hertz Modelan
Ediciones Que Se Considerarán
Propiedades de la Muestra
Rango Apto
Selección de la Antena
Ejemplo de un Experimento del Sangrado De Márgenes
Preparación de la Antena
Ejecución de Experimentos del Sangrado De Márgenes
De Proceso De Datos
Prueba del Sistema
Conclusión

Introducción

Usando fuerza atómica el microscopio (AFM) para el nanoindentation ha emergido mientras que una herramienta útil para determinar las propiedades elásticos tiene gusto del módulo de elástico para las muestras biológicas (cuadro 1). Los Voladizos sirven como nanoindenters suaves permitiendo la prueba local de muestras pequeñas y no homogéneas como las células o los tejidos. Para calcular el parámetro de los diversos modelos del interés se utilizan, pero la mayor parte de se basan en el modelo de Hertz y se extienden para corresponder con las condiciones experimentales referentes al espesor de los penetradores la dimensión de una variable o de la muestra.

Cuadro 1. Reseña del módulo De Young para diversos materiales biológicos

El análisis de Nanomechanical de células está llegando a ser cada vez más importante en diversos campos como cáncer y biología de desarrollo. Las Diferencias en la rigidez de células normales y malignas fueron encontradas y también el cambio en potencial metastático con la disminución de rigidez celular puede ser marcado. La Determinación de la tensión de la corteza de célula de los progenitores de la capa de germen de los zebrafish reveló diferencias en la rigidez de las células ecto, meso y endodermales del progenitor. Otro ejemplo del campo de la biología de desarrollo es la prueba mecánica de los substratos del incremento. Esta aplicación reveló el papel importante de la elasticidad de la matriz para el pliego de condiciones del linaje de la célula. No sólo las células pero también los componentes de su ambiente extracelular, como las fibrillas del colágeno se han probado para sus propiedades mecánicas [17]. El potencial de esta metodología es ampliamente utilizado en biológico y también otras disciplinas describir las propiedades elásticos de diversos matrices y materiales.

Este parte describe la aplicación y la adquisición de los experimentos de la elasticidad usando técnica del AFM. Una reseña del modelo más de uso general, el modelo de Hertz se da y las limitaciones de las suposiciones y el resultar para el uso con las muestras biológicas se discuten detalladamente.

Los Hertz Modelan

El modelo de Hertz aproxima la muestra como macizo elástico isotrópico y lineal que ocupa un medio espacio infinitamente que extiende. Además se asume que el penetrador no es deformable y que no hay acciones recíprocas adicionales entre el penetrador y la muestra. Si se cumplen estas condiciones el módulo De Young (e) de la muestra se puede ajustar o calcular usando el modelo Hertziano. Varios parámetros que describen las propiedades de la antena de la muestra y del sangrado de márgenes tienen que ser especificados.

Cuadro 2. Parte Superior - Esbozo del experimento del sangrado de márgenes. El voladizo es movido hacia la muestra por una distancia z (altura (medida)). El voladizo está doblando en la dirección opuesta (x) mientras que la muestra es mellada por el ä. Finalmente el ä es calculado restando la desviación voladiza de la altura (medida). Parte Inferior - Diagrama Esquemático de la corrección de la altura para que el (x) que dobla voladizo derive la punta-muestra-separación (curva del sangrado de márgenes de la fuerza).

Los datos obtenidos por las mediciones del sangrado de márgenes (modo de la espectroscopia de la fuerza) son generalmente gráficos de la fuerza contra la dislocación piezoeléctrica, bastante que la separación de la muestra de la punta. Para aplicar el modelo de Hertz, las curvas necesitan ser convertidas como se explica en el cuadro 2.

El modelo de Hertz asume el sangrado de márgenes para ser neglectable con respecto al espesor de la muestra, así la profundidad del sangrado de márgenes tiene que ser optimizada. El modelo de Hertz es válido para los pequeños sangrados de márgenes (diga hasta 5-10% de la altura de la célula, quizá 200-500 nanómetro) donde el substrato no influencia los cálculos. Puede haber limitaciones adicionales con profundidad del sangrado de márgenes si el modelo de la dimensión de una variable de la punta es una aproximación. El modelo parabólico se utiliza A Menudo si el penetrador es una esfera porque es más fácil ajustar y la aproximación es razonable para los pequeños sangrados de márgenes. El software del IP de JPK ofrece el herraje automático para todas las dimensiones de una variable del penetrador mostradas aquí, tan allí es no más cualquier necesidad de hacer esta aproximación.

Ediciones Que Se Considerarán

El modelo de Hertz hace varias suposiciones que no se resuelvan verdad si se examinan las células u otras muestras biológicas.

En esta sección se discuten estas desviaciones y cómo hacer las mediciones más seguras.

Propiedades de la Muestra

El modelo de Hertz asume comportamiento así como la homogeneidad elásticos absolutos de la muestra. Pero la mayoría de los materiales biológicos son ni homogéneos ni absolutamente elásticos. La energía entregada por el penetrador no es dada totalmente detrás por una célula (pues sería hecha por un material de elástico absoluto) pero se disipa debido al comportamiento viscoso y plástico que también aparece mientras que la histéresis entre el extender y la pieza del retractar de la fuerza curva (Fig. 3). La variabilidad del comportamiento viscoso llega a ser visible si se prueban diversas velocidades del sangrado de márgenes. Cuanto más alta es la velocidad de carga, más pequeño es el sangrado de márgenes y más alto es la rigidez evidente. Escala de tiempo que describe este comportamiento es el tiempo de relajación y es diferente para cada material viscoso/viscoelástico. Usando velocidades cerca del tiempo de relajación dará lugar a fuerzas más inferiores, porque el material de la célula tiene tiempo para moverse lejos de la antena de melladura. Velocidades Más Altas dan lugar a una resistencia más alta del material de la muestra y la acción recíproca total es más elástico (la fuerza es en fase con el sangrado de márgenes, no la velocidad). En general es el mejor tirante constante en este parámetro para tener las mismas condiciones iniciales para cada experimento. Pero no debe ser olvidado que cada tipo del material o de la célula tiene su propio tiempo de relajación puesto que pueden variar grandemente en su composición (talla del núcleo, de la composición del citoesqueleto Etc.).

Cuadro 3. curva de la distancia de la Fuerza adquirida una célula viva de CHO (velocidad 5 µm/s de la exploración). Rastree (rojo) y retrace de la curva la histéresis (rojo oscuro) de la demostración sin obstrucción debido al comportamiento viscoso y plástico de la célula.

La Inhomogeneidad de la muestra también puede dar lugar a artefactos como la variación del módulo De Young dependiendo de profundidad del sangrado de márgenes, es decir dependiendo de la capa o del componente el penetrador está clavando real. Las Células tienen diversos componentes (como glycocalix, extensiones de la membrana, núcleo, o los organelos) que puedan reflejar diversa rigidez. La punta de contacto también está sufriendo de estas variaciones y acciones recíprocas de la antena y la superficie o las moléculas de la muestra que estén revistiendo la superficie. Tales curvas muestran a menudo una punta de contacto muy baja donde E se calcula para ser más suave que la muestra están realmente. La rigidez “real” de la muestra se mide así solamente cuando la antena alcanza la superficie apropiada que está después de la parte baja de la curva. Entonces el ajuste no corresponde con la punta de contacto de la Fuerza-sangrado de márgenes-Curva (cuadro 4). Pero esto no es asombrosamente puesto que el modelo de Hertz asume la homogeneidad de la muestra y de ningunas acciones recíprocas entre la muestra y la antena. Finalmente, es siempre importante enfocar de parte de la curva que representa la estructura que usted quiere investigar.

Cuadro 4. Fuerza comparado con las curvas del sangrado de márgenes derivadas de una célula, ajustada con el modelo de Hertz. Lo mismo curvan primero fueron ajustadas a un sangrado de márgenes de 200 nanómetro (parte superior), y en segundo lugar sobre el rango entero del sangrado de márgenes de 400 nanómetro (parte inferior). La antena activó Obviamente con dos diversas capas puesto que la punta de contacto ajustada de la primera curva es diferente de la punta de contacto de la segunda curva. El módulo de E de la primera curva, describiendo la rigidez de la superficie de la célula, es cerca de 16 el kPa, el que está de la segunda curva, que se puede asumir para ser módulo del te E del citoplasma, el kPa cerca de 35.

Rango Apto

También importante es encontrar el rango del ajuste que debe ser utilizado para rendir los resultados óptimos y reproductivos para los cálculos de la elasticidad. Según Lo descrito en la sección encima de E fluctúa fuertemente en los sangrados de márgenes muy inferiores alrededor de la punta de contacto pero los alcances un platillo con el aumento del sangrado de márgenes finalmente a aumentar otra vez, principal como resultado de la rigidez del substrato (la diapositiva de cristal Etc., véase el cuadro 5, parte inferior). Así la altura de la estructura mellada debe fuertemente ser considerada. El modelo de Hertz es solamente válido para los pequeños sangrados de márgenes (diga hasta 5-10% de la altura de la célula, quizá 200-500 nanómetro) donde el substrato no influencia los cálculos y donde la geometría del sangrado de márgenes corresponde con la geometría del penetrador. Según Lo descrito en la sección de Hertz arriba, la mejor manera de encontrar el rango óptimo es registrar una curva de la distancia de la fuerza con el sangrado de márgenes relativamente alto y ajustar E para cada punta de la curva correspondiente del sangrado de márgenes de la fuerza. El Trazado E sobre el sangrado de márgenes revela el sangrado de márgenes cuando E comienza a tender hacia un valor constante que se deba utilizar para determinar el módulo De Young (cuadro 5, central).

Pero puede suceso que no hay platillo obvio, especialmente al mellar muestras no homogéneas. Si una célula por ejemplo se prueba a la derecha encima del núcleo usando un penetrador relativamente pequeño (e.g una pirámide), el núcleo puede deslizarse lejos bajo de antena y el resultado es una disminución del módulo medido justo después de que el núcleo fue activado por la antena (cuadro 5, parte superior).

Cuadro 5. E comparado con curvas del sangrado de márgenes de una célula de CHO sondada con un penetrador piramidal en diversas regiones: derecho encima del núcleo (parte superior), de la región al lado del núcleo (central) y acerque al borde de la célula (parte inferior). La Prueba a la derecha encima del núcleo (parte superior) aquí denotó solamente transitorio la rigidez del núcleo. El núcleo entonces fue activado Obviamente de distancia dando por resultado la disminución de E. Probing un sangrado de márgenes revelador (central) relativamente homogéneo de la región incluso del citoplasma que comenzaba aproximadamente 250 nanómetro. El Sangrado De Márgenes del borde de la célula (parte inferior) lleva a un segundo, aumento relacionado del substrato de E que comienza en los sangrados de márgenes relativamente inferiores.

Las tres curvas del cuadro 5 derivan de la misma célula y fueron tomadas con la misma antena bajo exactamente mismas condiciones. Aunque hay “en segundo lugar” aumento no obvio en E y así indirecta no obvia o típica de un efecto del substrato de cristal para ambos E superior comparado con curvas del sangrado de márgenes, el aumento de la rigidez evidente del centro de célula al borde indica una influencia del substrato. Pero éste no es asombrosamente puesto que la altura de la célula en el núcleo fue medida para ser el µm alrededor 5, en el cerco del núcleo ser el µm alrededor 1,3 y en el borde alrededor de 0,5 µm. Finalmente estos resultados muestran que el efecto del substrato es no sólo visible por un aumento de E dentro de E comparado con curvas del sangrado de márgenes pero también aumentando valores de E en regiones más finas de las células.

Selección de la Antena

Qué voladizo debe ser utilizado depende de la rigidez de la muestra. En general uno puede tener presente que la rigidez del voladizo debe estar alrededor del rango de la rigidez de la muestra. Para las células de las cuales son muy suaves y delicados los voladizos más suaves disponibles con constantes del muelle alrededor 10-30 mN/m deben ser utilizados. Para muestras más derechas como constantes más altos del muelle de los geles de la agarosa (30-100 mN/m o más) sea apropiado.

Otra punta a considerar es la opción de la dimensión de una variable del penetrador. Para las muestras biológicas suaves se recomienda para utilizar antenas esféricas puesto que la fuerza se aplica a un área más amplia de la muestra que sea el caso si se utiliza una punta piramidal o cónica sostenida, que da lugar a una presión más inferior. Esta penetración de la manera de la muestra se previene. Pero ésta no es la única razón para preferir penetradores esféricos. Las Células o los tejidos son muy no homogéneos, consistiendo en diversos componentes (núcleo, componentes citoesqueléticos, organelos…). Para rendir una impresión general para tales penetradores relativamente grandes no homogéneos de los materiales como 20 bordes del µm sea útil.

Para rendir más de alta resolución, e.g a las células de la prueba o a diversas piezas de la célula, o aumentar la presión para mellar bordes más derechos de los materiales de diámetros más pequeños puede ser utilizado (el µm 1-10, dependiendo de la resolución deseada). Las Esferas no son siempre la mejor solución. Si la muestra está de dimensiones muy pequeñas o si es diferente se van las áreas a ser probadas en más de alta resolución (más arriba de un micrón) las puntas piramidales del nitruro de silicio pueden ser una opción. Una desventaja de tal las puntas más o menos sostenidas es por supuesto esa ellas puede penetrar la muestra y llevar así a los cálculos inexactos del módulo De Young (generalmente una disminución de rigidez).

Pero por otra parte son obstaculizados menos por las estructuras como extensiones celulares o los residuos que extienden del glycocalix que son las esferas. Los penetradores Esféricos asierran al hilo a menudo tales extensiones, y el resultado es una punta de contacto muy baja que es extremadamente difícil de determinar (que es también la razón por la que debe ser ajustada). Un problema más general que ocurre con las células es curvas torcidas de la fuerza, visualizadas sobre todo pues un “reborde” en la región del contacto (Fig. 6). Estas distorsiones pueden derivar de contacto con las pequeñas estructuras como las fibras de tensión o las extensiones membranosas, que entonces se deslizan lejos de la antena, llevando a una segunda punta de contacto.

El Cuadro 6. Distorted extiende la curva adquirida una célula de CHO usando un penetrador esférico de 2 µm.

Ejemplo de un Experimento del Sangrado De Márgenes

En este ejemplo el flujo de trabajo para derivar el módulo De Young de las células de vida de CHO se describe. El CellHesion® 200, montado en un microscopio óptico de Zeiss (AxioObserver), fue utilizado para preparar la antena esférica que iba a ser utilizada así como realizar experimentos del sangrado de márgenes El CellHesion® 200 es un nuevo dispositivo basado AFM, desarrollado exclusivamente para cubrir las necesidades de probar la adherencia celular y a mecánicos. Un PetriDishHeater™ fue utilizado como casquillo de la muestra puesto que las células fueron crecidas en placas de Petri de WPI. Las células fueron guardadas bajo condiciones fisiológicas durante el experimento entero (37°C, media protegido HEPES).

Preparación de la Antena

Los penetradores Esféricos se pueden o comprar de proveedores especiales como antenas de la partícula de Novascan (0.6-25 esferas de cristal del µm asociadas a los voladizos), o pueden ser hechos en casa pegando esferas en los voladizos. Para tal voladizo tipless del propósito esté bien adaptado. El Cuidado debe ser tomado si los voladizos con puntas se utilizan, especialmente si se asocian las pequeñas esferas. Esto está porque la esfera asociará a la cara de la punta, bastante que en el extremo, de modo que la punta todavía tenga un impacto en el experimento, especialmente si el diámetro elegido de la esfera es menos que la altura de punta. Los voladizos del Silicio tienen puntas del µm hasta alrededor 15. Así los voladizos tipless serían mejores voladizos del nitruro de la opción o por lo menos de silicio que tienen puntas más cortas (µm hasta 5).

Por este ejemplo un voladizo tipless (la Flecha TL1, NanoWorld, k = 0,03 N/m) con una esfera asociada del sílice (µm del diámetro 11) fue utilizada como la antena del sangrado de márgenes (Fig. 7). Los bordes del sílice fueron asociados al voladizo con un epóxido bipartito, pero a otros adhesivos biocompatibles como el adhesivo óptico está también bien adaptado. Esto puede ser hecha fácilmente preparando una diapositiva del microscopio donde las esferas se depositan en un porción y epóxido en una Partición adyacente. Si los bordes se suspenden en líquido, una caída se pone en la diapositiva y se seca. Un par de pinzas limpias se puede también utilizar para transferir bordes secos sobre la diapositiva, o para extender la solución del borde. Entonces una pequeña cantidad del epóxido se extiende muy fino cerca de los bordes usando una punta de la lámina o de la pipeta.

Cuadro 7. voladizo de Tipless con una esfera de 11 micrones asociada

El voladizo se debe primero sumergir en el epóxido. Una aproximación se hace en una región limpia de cristal para encontrar la superficie. Entonces la punta voladiza se coloca sobre el borde de la corrección de epoxy usando los tornillos de ubicación y una medición de la espectroscopia de la fuerza se funciona con para sumergir la punta en el pegamento. Un setpoint de alrededor 0,5 a 1 V debe ser suficiente. Si hay demasiado pegamento en la punta puede fluir sobre el borde y embutirlo. Para prevenir esto, una o más mediciones adicionales de la espectroscopia se deben realizar en un área de cristal limpia. Esto quitará exceso de pegamento. Finalmente, asociar una esfera, otra curva de la fuerza se ejecuta con la punta colocada sobre una esfera.

Ejecución de Experimentos del Sangrado De Márgenes

La antena de la microesfera fue montada y alineó como de costumbre en la carga del AFM. La placa de Petri de WPI que contenía las células adherentes de CHO fue montada al calefactor de la placa de Petri y la temperatura fue fijada a 37°C. El voladizo entonces fue calibrado, es decir el resuelto constante del muelle para poder especificar exactamente la fuerza que se aplicará a la muestra. Usando el NanoWizard® o el CellHesion200® el gerente de la calibración del software de JPK SPM lleva al utilizador con el proceso de la calibración, calculando la sensibilidad ajustando una curva de la fuerza (tomada en un substrato duro) dentro de la pieza lineal del contacto y determinando el muelle constante con el método térmico del ruido. Una Vez Que la calibración es completa, la fuerza setpoint deseada se puede incorporar en Neutonios (generalmente pico- o los nano-Neutonios). Ahora el experimento podía ser comenzado.

Las curvas de la distancia de la Fuerza fueron tomadas directamente encima del núcleo de diversas células. Los setpoints Relativamente altos fueron utilizados (el nN hasta 4) puesto que las propiedades mecánicas de estas células eran desconocidas. La extensión/se retracta velocidad fue fijada a 5 µm/s y el bucle cerrado fue utilizado.

de proceso de datos

El software del IP de JPK da la posibilidad para derivar el módulo De Young de las curvas de la fuerza que se ejecutan con varios pasos de progresión (Fig. 8). Todas Las operaciones tienen que ser aplicadas a la curva del extender desde ella (normalmente o por lo menos en líquido) no contienen ninguna acción recíproca como adherencia que haga una determinación de la punta de contacto imposible. El primer paso de progresión del tramitación es quitar cualquier desplazamiento o inclinar de la curva y encontrar la punta de contacto. Por Lo Tanto las opciones “Restan la línea de fondo” y “la punta de contacto del Hallazgo” debe ser seleccionada. No es esencial determinar exactamente la punta de contacto o la línea de fondo compensó aquí puesto que son parámetros variables del ajuste y no tienen ninguna influencia en los resultados del ajuste. Cualquier inclinación se debe quitar de la línea de fondo puesto que ésta no es parte del ajuste de Hertz. El paso de progresión siguiente es “altura Correcta para el voladizo que dobla”, una característica que calcule la profundidad del sangrado de márgenes tomando la diferencia entre el movimiento piezoeléctrico y la desviación vertical voladiza en unidades de la longitud. Ahora las curvas un listo para ser ajustado con el modelo de Hertz para derivar el módulo De Young. Otros valores, tales como la “punta de contacto ajustada” y el parámetro “RMS residual” de la calidad del ajuste también se visualizan.

Cuadro 8. Operaciones para derivar el módulo De Young de una curva de la fuerza. El primer paso de progresión es quitar cualquier desplazamiento o inclinar de la línea de fondo y encontrar la punta de contacto. Para optimizar la determinación de la punta de contacto la curva puede ser alisada. El paso de progresión siguiente y crucial es restar doblar voladizo del movimiento piezoeléctrico para rendir el sangrado de márgenes, es decir un nuevo canal llamado separación de la muestra de la punta se crea. Finalmente el modelo de Hertz puede ser aplicado. La geometría del penetrador debe ser especificada así como la relación de transformación de Poisson (que se puede dejar en 0,5 para las muestras biológicas) y el rango de datos que se ajustará.

Si muchas curvas fueron registradas hay la posibilidad para utilizar el procesamiento por lotes donde todas las operaciones descritas se pueden aplicar a un tratamiento por lotes de curvas (dentro de una carpeta).

Antes de procesamiento por lotes, es útil examinar algunas curvas más detalladamente para encontrar el rango óptimo del ajuste que se puede entonces aplicar a todas las curvas. Por Lo Tanto el rango del ajuste debe ser aumentado por etapas hasta que el módulo de E tiende hacia un valor constante. En el cuadro 9 el módulo De Young derivado de una célula de CHO se traza en dependencia del sangrado de márgenes. Aquí comienzo de E para tomar valores constantes aproximadamente 700-800 nanómetro de profundidad del sangrado de márgenes. Si examina un arsenal de curvas, usando el procesamiento por lotes, este valor se debe utilizar para el rango del ajuste. Por supuesto la calidad del ajuste debe ser controlada siempre mirando directamente las curvas o comparando el RMS residual que también se anota en el fichero de los resultados se genera que al usar el procesamiento por lotes.

Cuadro 9. E comparado con curva del sangrado de márgenes de una célula de CHO. Aproximadamente 700 Nivel E del sangrado de márgenes del nanómetro a un rango constante (PA alrededor 450).

Prueba del Sistema

El módulo De Young es de uso frecuente describir propiedades mecánicas de células y de otras muestras. En muchos casos la intención de hacer tales experimentos es comparar los resultados con otros datos, presentados por otros investigadores. El Peinarse a través de la literatura una encuentra siempre discrepancias entre los valores de E de experimentos similares pero realizados usando diversos dispositivos. Para evaluar cómo el sistema trabaja pero también ganar una sensación para la técnica y la manipulación de ella es a menudo útiles para comenzar con una muestra donde la elasticidad se ha descrito ya con un sistema similar. Los Geles de polímeros como agarosa o alcohol de polivinilo son las muestras welldescribed que son de uso frecuente describir principios de las mediciones de la elasticidad.

Para probar el sistema en el cual la célula experimenta fueron realizados 2,5% que el gel de la agarosa fue mellado usando una antena esférica de 11 µm. Puesto Que los geles de la agarosa en esta concentración son más derechos que las células, antenas más derechas tienen que ser utilizadas, e.g con constantes del muelle de 0.5-5 N/m. En este ejemplo un voladizo de NSC del mikromasch (4 N/m) fue utilizado. La E correspondiente comparado con curva del sangrado de márgenes se muestra en el cuadro 10 que visualiza una E final del kPa alrededor 36. Este valor está de acuerdo bien con la literatura (cuadro 1).

Cuadro 10. E comparado con la curva del sangrado de márgenes calculada para una curva de la distancia de la fuerza tomada en un gel de la agarosa del 2,5% usando una antena esférica de 11 µm con un constante del muelle de 4 N/m. La E final es el kPa alrededor 36

Conclusión

A pesar de algunas limitaciones el modelo de Hertz es un método útil y de uso general expresar las propiedades mecánicas de muestras biológicas como las células. Hay algunas ediciones que se deben tener presente tal como el rango del ajuste o la composición de la muestra. Las muestras Biológicas visualizan a menudo comportamiento viscoelástico y son no homogéneas, es decir consisten en diversos “materiales” con diversas propiedades elásticos. Para conocerlo exactamente que el componente es descrito exactamente por los resultados es el más importante llegar a ser conocido con la muestra y ajustar adecuadamente los parámetros.

En Vista De Que todas estas ediciones ayudarán a rendir resultados razonables y reproductivos.

Los JPK NanoWizard®II o los CellHesion®200 conjuntamente con casquillos dedicados de la muestra, como el PetriDishHeater™ o el BioCell™, proporcionan a los medios de obtener datos de la elasticidad (entre numeroso otros tipos de datos) para las muestras biológicas. El software del IP de JPK ayuda Además al utilizador con todos los pasos de progresión a preparar las curvas detectadas para Hertz que tramitan y proporciona a una calculadora fácil de utilizar para el módulo De Young.

Fuente: Instrumentos de JPK

Para más información sobre esta fuente visite por favor los Instrumentos de JPK

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:26

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