Facendo Uso di Microscopia Atomica della Forza Per Determinare i Beni Elastici dei Campioni Biologici dagli Strumenti di JPK

Argomenti Coperti

Introduzione
Hertz Modella
Emissioni Da Considerare
Beni del Campione
Intervallo Adatto
Selezione della Sonda
Esempio di un Esperimento della Dentellatura
Preparato della Sonda
Esecuzione degli Esperimenti della Dentellatura
Trattamento Dell'informazione
Verificare il Sistema
Conclusione

Introduzione

Facendo Uso di forza atomica il microscopio (AFM) per il nanoindentation è emerso mentre uno strumento utile per determinare i beni elastici gradisce il modulo elastico per i campioni biologici (figura 1). Le Travi A Mensola serviscono da nanoindenters morbidi permettendo la prova locale dei campioni piccoli e non omogenei come le celle o i tessuti. Per calcolare il parametro di vari modelli di interesse sono usati, ma la maggior parte di loro sono basate sul modello di Hertz e sono estese per abbinare i termini sperimentali riguardo alla forma o allo spessore dei penetratori del campione.

Figura 1. Generalità del modulo Di Young per i materiali biologici differenti

L'analisi di Nanomechanical delle celle sta diventando sempre più importante nei campi differenti come cancro e biologia dello sviluppo. Le Differenze nella rigidezza del normale e delle celle maligne sono state trovate ed anche il cambiamento nel potenziale metastatico con fare diminuire la rigidezza cellulare può essere tracciato. La Determinazione della tensione della corteccia delle cellule dei progenitori dello strato germinativo di zebrafish ha rivelato le differenze nella rigidezza delle celle ecto, mese ed endodermiche del progenitore. Un Altro esempio dal campo di biologia dello sviluppo è la prova meccanica dei substrati della crescita. Questa applicazione ha rivelato il ruolo importante di elasticità della matrice per specifica di stirpe delle cellule. Non solo le celle ma anche le componenti del loro ambiente extracellulare, come le fibrille del collageno sono state provate a loro beni meccanici [17]. Il potenziale di questa metodologia è ampiamente usato in biologico ed anche altre discipline descrivere i beni elastici delle matrici e dei materiali differenti.

Questo rapporto descrive l'applicazione e l'acquisizione degli esperimenti di elasticità facendo uso della tecnica del AFM. Una generalità del modello più comunemente usato, il modello di Hertz è fatta e le limitazioni di risultato e di presupposti per l'uso con i campioni biologici è discussa dettagliatamente.

Hertz Modella

Il modello di Hertz si approssima al campione come solido elastico isotropo e lineare che occupa uno spazio mezzo infinitamente d'estensione. Ancora è presupposto che il penetratore non sia deformabile e che non ci sono interazioni supplementari fra il penetratore ed il campione. Se queste circostanze sono riempite il modulo Di Young (E) del campione può essere misura o calcolato facendo uso del modello Hertziano. Parecchi parametri che descrivono i beni della sonda della dentellatura e del campione devono essere specificati.

Figura 2. Schizzo Superiore dell'esperimento della dentellatura. La trave a mensola è avanzata verso il campione da una distanza la z (altezza (misurata)). La trave a mensola sta piegando nella direzione opposta (x) mentre il campione è rientrato da ä. Definitivo il ä è calcolato sottraendo la deformazione a mensola dall'altezza (misurata). Fondo - Disegno Schematico della correzione dell'altezza affinchè il (x) di piegamento a mensola derivino la suggerimento-campione-separazione (curva della dentellatura della forza).

I dati ottenuti tramite le misure della dentellatura (modo di spettroscopia della forza) sono solitamente tracciati di forza contro spostamento piezo-elettrico, piuttosto che la separazione del campione del suggerimento. Per applicare Hertz modelli, le curve devono essere convertiti come spiegato in figura 2.

Il modello di Hertz presuppone la dentellatura per essere neglectable rispetto allo spessore del campione, così la profondità della dentellatura deve essere ottimizzata. Il modello di Hertz è valido per le piccole dentellature (dica fino a 5-10% dell'altezza della cella, forse 200-500 nanometro) dove il substrato non influenza i calcoli. Ci possono essere limitazioni supplementari nella profondità della dentellatura se il modello di forma del suggerimento è un'approssimazione. Il modello parabolico è usato Spesso se il penetratore è una sfera perché è più facile da adattarsi e l'approssimazione è ragionevole per le piccole dentellature. Il software del IP di JPK offre l'installazione automatica per tutte le forme del penetratore indicate qui, così là non è più tutta la necessità di fare questa approssimazione.

Emissioni Da Considerare

Il modello di Hertz fa parecchi presupposti che vero non sono incontrati se le celle o altri campioni biologici sono esaminati.

In questa sezione queste deviazioni sono discusse e come effettuare le misure più affidabili.

Beni del Campione

Il modello di Hertz presuppone il comportamento come pure l'omogeneità elastici assoluti del campione. Ma la maggior parte dei materiali biologici sono nè omogenei nè assolutamente elastici. L'energia consegnata dal penetratore completamente non è restituita da una cella (poichè sarebbe fatta da un materiale elastico assoluto) ma dissipa a causa di comportamento viscoso e di plastica che egualmente compare mentre l'isteresi fra l'estensione e la parte di ritiro della forza curva (Fig. 3). La variabilità del comportamento viscoso diventa visibile se le velocità differenti della dentellatura sono provate. Più alto il tasso di carico, più piccola la dentellatura e più alta la rigidezza evidente. La cronologia genealogica che descrive questo comportamento è il tempo di rilassamento ed è differente per ogni materiale viscoso/viscoelastico. Facendo Uso delle velocità vicino al tempo di rilassamento provocherà le forze più basse, perché il materiale delle cellule ha tempo di muoversi a partire dalla sonda di rientro. Le Più Alte velocità provocano un'più alta resistenza del materiale del campione e l'interazione globale è più elastica (forza ha luogo nella fase con la dentellatura, non la velocità). In Generale è meglio da restare coerente in questo parametro per avere gli stessi termini iniziali per ogni esperimento. Ma non dovrebbe essere dimenticato che ogni tipo delle cellule o del materiale ha suo proprio tempo di rilassamento poiché possono variare notevolmente in loro composizione (dimensione del nucleo, della composizione del citoscheletro Ecc.).

Figura 3. curva di distanza della Forza catturata su una cella vivente di CHO (velocità 5 µm/s di scansione). Rintracci (rosso) e ritracci della curva l'isteresi (rosso scuro) di manifestazione chiaramente a causa del comportamento viscoso e di plastica della cella.

L'Eterogeneità del campione anche può provocare i artefatti come la variazione del modulo Di Young secondo profondità della dentellatura, cioè secondo il livello o la componente il penetratore realmente sta introducendo. Le Celle hanno varie componenti (come glycocalix, le estensioni della membrana, il nucleo, o gli organelli) che possono riflettere la rigidezza differente. Il punto di contatto egualmente sta soffrendo da queste variazioni ed interazioni della sonda e la superficie o le molecole del campione che stanno riguardando la superficie. Tali curve mostrano spesso un punto di contatto molto basso in cui la E è calcolata per essere più morbida del campione realmente è. La rigidezza “reale„ del campione è misurata così soltanto quando la sonda raggiunge la superficie adeguata che è dopo la parte bassa della curva. Poi la misura non abbina il punto di contatto della Forza-dentellatura-Curva (figura 4). Ma questo non è sorprendente poiché il modello di Hertz presuppone l'omogeneità del campione e di nessun interazioni fra il campione e la sonda. Per Concludere, è sempre importante da mettere a fuoco da parte della curva che rappresenta la struttura che volete studiare.

Figura 4. Forza contro le curve della dentellatura derivate da una cella, misura con il modello di Hertz. Lo stessi curvano in primo luogo misura ad una dentellatura di 200 il nanometro (cima) ed in secondo luogo sopra l'intero intervallo della dentellatura di 400 il nanometro (fondo). La sonda ha spinto Ovviamente tramite due livelli differenti poiché il punto di contatto misura della prima curva è differente dal punto di contatto della seconda curva. Il modulo di E della prima curva, descrivente la rigidezza della superficie delle cellule, è circa 16 kPa, quello della seconda curva, che può essere presupposta per essere modulo del te E del citoplasma, kPa circa 35.

Intervallo Adatto

Egualmente importante è trovare l'intervallo di misura che deve essere usato per dare i risultati ottimali e riproducibili per i calcoli di elasticità. Come descritto nella sezione sopra la E oscilla forte alle dentellature molto basse intorno al punto di contatto ma estensioni un plateau con l'aumento della dentellatura definitivo da aumentare ancora, pricipalmente come conseguenza della rigidezza del substrato (la lastra di vetro Ecc., vede figura 5, fondo). Così l'altezza della struttura rientrata deve forte essere considerata. Il modello di Hertz è soltanto valido per le piccole dentellature (dica fino a 5-10% dell'altezza della cella, forse 200-500 nanometro) dove il substrato non influenza i calcoli e dove la geometria della dentellatura abbina la geometria del penetratore. Come descritto nella sezione di Hertz qui sopra, il migliore modo trovare l'intervallo ottimale è di registrare una curva di distanza della forza con la dentellatura relativamente alta e di misura la E per ogni punto della curva corrispondente della dentellatura della forza. Il Tracciato E sopra la dentellatura rivela la dentellatura quando la E comincia tendere verso un valore costante che dovrebbe essere usato per determinare il modulo Di Young (figure 5, medie).

Ma può accadere che non ci sia plateau ovvio, particolarmente quando rientrano i campioni non omogenei. Se una cella per esempio è destra provata sopra il nucleo facendo uso di penetratore relativamente piccolo (per esempio una piramide), il nucleo può franare a partire nell'ambito della sonda ed il risultato è una diminuzione del modulo misurato right after il nucleo è stato spinto dalla sonda (figura 5, cima).

Figura 5. E contro le curve della dentellatura di una cella di CHO sondata con un penetratore piramidale alle regioni differenti: radrizzi sopra il nucleo (cima), la regione accanto al nucleo (medio) ed avvicini alla barriera della cella (fondo). La destra Difficile sopra il nucleo (cima) qui ha denotato soltanto transitoriamente la rigidezza del nucleo. Il nucleo poi è stato spinto Ovviamente via con conseguente diminuzione di E. Probing una dentellatura rivelatrice (media) relativamente omogenea di regione anche del citoplasma che comincia a circa 250 nanometro. La Dentellatura della barriera delle cellule (fondo) piombo ad un secondo, aumento dipendente del substrato della E che comincia alle dentellature relativamente basse.

Tutte E tre le curve di figura 5 derivano dalla stessa cella e sono state catturate con la stessa sonda esattamente nelle stesse circostanze. Anche se c'è “in secondo luogo„ aumento non ovvio nella E e così nel suggerimento non ovvio o tipico di un effetto del substrato di vetro per gli entrambi E superiore contro le curve della dentellatura, l'aumento della rigidezza evidente dal centro delle cellule alla barriera indica un'influenza del substrato. Ma questo non è sorprendente poiché l'altezza della cella al nucleo è stata misurata per essere µm intorno 5, a circondare del nucleo essere µm intorno 1,3 ed alla barriera intorno a 0,5 µm. Definitivo questi risultati indicano che l'effetto del substrato è non solo visibile tramite un aumento della E all'interno della E contro le curve della dentellatura ma anche aumentando i valori di E alle regioni più sottili delle celle.

Selezione della Sonda

Quale trave a mensola dovrebbe essere utilizzata dipende dalla rigidezza del campione. In generale uno può tenere presente che la rigidezza della trave a mensola dovrebbe essere intorno all'intervallo della rigidezza del campione. Per le celle di cui sono molto molli e delicate le travi a mensola più molli disponibili con le costanti della sorgente intorno 10-30 mN/m dovrebbero essere usati. Per i campioni più rigidi come le più alte costanti della sorgente dei gel di agarosio (30-100 mN/m o più) sia appropriato.

Un Altro punto da considerare è la scelta della forma del penetratore. Per i campioni biologici molli è raccomandato per usare le sonde sferiche poiché la forza si applica ad un'più ampia area del campione che sia il caso se un suggerimento piramidale o conico marcato è usato, che provoca una pressione più bassa. Questa infiltrazione di modo del campione è impedita. Ma questa non è la sola ragione di preferire i penetratori sferici. Le Celle o i tessuti sono molto non omogenei, consistendo delle componenti differenti (nucleo, componenti citoscheletriche, organelli…). Per rendere un'impressione generale per tali penetratori non omogenei dei materiali relativamente grandi come 20 perle del µm sia utile.

Per rendere più di alta risoluzione, per esempio agli unicellulari della prova o alle parti differenti delle cellule, o aumentare la pressione rientrare le perle più rigide dei materiali di più piccoli diametri può essere usato (µm 1-10, secondo la risoluzione desiderata). Le Sfere non sono sempre la migliore soluzione. Se il campione è di dimensioni molto piccole o se differente le aree devono essere provate in più di alta risoluzione (più superiore un micron) i suggerimenti piramidali del nitruro di silicio possono essere un'alternativa. Uno svantaggio del tale suggerimenti più o meno marcati è naturalmente quel essi può penetrare il campione e piombo così ai calcoli inesatti del modulo Di Young (generalmente una diminuzione di rigidezza).

Ma d'altra parte più di meno sono ostacolati dalle strutture come le estensioni cellulari o dai residui che si estendono dal glycocalix che le sfere sono. I penetratori Sferici ritengono spesso tali estensioni ed il risultato è un punto di contatto molto basso che è estremamente difficile da determinare (che è egualmente la ragione per la quale dovrebbe essere misura). Un problema più generale che si presenta con le celle è curve distorte della forza, principalmente video poichè “una spalla„ nella regione del contatto (Fig. 6). Queste deformazioni possono derivare dal contatto con le piccole strutture come le fibre di sforzo o le estensioni membranose, che poi franano a partire dalla sonda, piombo ad un secondo punto di contatto.

La Figura 6. Distorted estende la curva catturata su una cella di CHO facendo uso di un penetratore sferico di 2 µm.

Esempio di un Esperimento della Dentellatura

In questo esempio il flusso di lavoro per derivare il modulo Di Young delle celle viventi di CHO è descritto. Il CellHesion® 200, montato su un microscopio ottico di Zeiss (AxioObserver), è stato usato per preparare la sonda sferica che stava andando essere usata come pure eseguire gli esperimenti della dentellatura Il CellHesion® 200 è una nuova unità basata AFM, esclusivamente sviluppata per soddisfare le esigenze di esame l'aderenza cellulare e dei meccanici. Un PetriDishHeater™ è stato usato come supporto del campione poiché le celle si sono sviluppate sulle capsule di Petri di WPI. Le celle sono state tenute nelle circostanze fisiologiche durante l'intero esperimento (37°C, media bufferizzato HEPES).

Preparato della Sonda

I penetratori Sferici possono o essere approvvigionati dai fornitori speciali come le sonde della particella da Novascan (0.6-25 sfere di vetro del µm fissate alle travi a mensola), o possono essere casalinghi incollando le sfere sulle travi a mensola. Per tale trave a mensola tipless di scopo sia ben adattato. La Cura deve essere catturata se le travi a mensola con i suggerimenti sono utilizzate, particolarmente se le piccole sfere sono fissate. Ciò è perché la sfera fisserà al lato del suggerimento, piuttosto che sull'estremità, di modo che il suggerimento ancora avrà un impatto sull'esperimento, particolarmente se il diametro scelto della sfera è di meno che l'altezza di suggerimento. Le travi a mensola del Silicio hanno suggerimenti di µm fino a intorno 15. Così le travi a mensola tipless sarebbero migliore scelta o almeno travi a mensola del nitruro di silicio che hanno più brevi suggerimenti (µm fino a 5).

Per questo esempio una trave a mensola tipless (Freccia TL1, NanoWorld, K = 0,03 N/m) con una sfera fissata della silice (µm del diametro 11) è stata usata come la sonda della dentellatura (Fig. 7). Le perle della silice sono state fissate alla trave a mensola con un epossidico in due parti, ma ad altri collanti biocompatibili come il collante ottico è egualmente ben adattato. Ciò può essere fatta facilmente mediante la preparazione della diapositiva del microscopio in cui le sfere sono depositate su un parte ed epossidico su una parte adiacente. Se le perle sono sospese in liquido, una goccia è messa sulla diapositiva ed è asciugata. Un paio delle pinzette pulite può anche essere utilizzato per trasferire le perle asciutte sulla diapositiva, o per spargere la soluzione della perla. Poi una piccola quantità dell'epossidico è spanta molto sottilmente vicino alle perle facendo uso di un suggerimento della pipetta o dell'aletta.

Figura 7. trave a mensola di Tipless con una sfera da 11 micron fissata

La trave a mensola deve in primo luogo essere immersa nell'epossidico. Un approccio è fatto su una regione pulita di vetro per trovare la superficie. Poi il suggerimento a mensola è posizionato sopra la barriera della toppa a resina epossidica facendo uso delle viti di posizionamento e una misura della spettroscopia della forza è funzionata per immergere il suggerimento nella colla. Un del punto vincente di circa 0,5 - 1 V dovrebbe essere sufficiente. Se c'è troppa colla sul suggerimento può circolare sulla perla ed incassarlo. Per impedire questo, una o più misure supplementari della spettroscopia dovrebbero essere realizzate su un'area di vetro pulita. Ciò rimuoverà la colla in eccesso. Per Concludere, fissare una sfera, un'altra curva della forza è fatta funzionare con il suggerimento posizionato sopra una sfera.

Esecuzione degli Esperimenti della Dentellatura

La sonda di microsfera è stata montata ed allineato come di consueto sulla testa del AFM. La capsula di Petri di WPI che contiene le celle aderenti di CHO è stata montata al radiatore della capsula di Petri e la temperatura è stata fissata a 37°C. La trave a mensola poi è stata calibrata, cioè il risoluto costante della sorgente per potere specificare esattamente la forza da applicarsi al campione. Facendo Uso del NanoWizard® o del CellHesion200® il gestore di calibratura del software di JPK SPM piombo l'utente con il trattamento di calibratura, calcolatore la sensibilità misura una curva della forza (catturata su un substrato duro) all'interno della parte lineare del contatto e determinando la sorgente costante con il metodo termico di disturbo. Una Volta Che la calibratura è completa, la forza del punto vincente desiderata può essere inserita nei Newton (solitamente pico- o nano-Newton). Ora l'esperimento ha potuto essere iniziato.

Le curve di distanza della Forza sono state catturate direttamente sopra il nucleo delle celle differenti. I setpoints Relativamente alti sono stati usati (nN fino a 4) poiché i beni meccanici di queste celle erano sconosciuti. L'estensione/ritira la velocità è stata impostata a 5 µm/s ed il ciclo chiuso è stato usato.

dell'elaborazione dei dati

Il software del IP di JPK dà la possibilità per derivare il modulo Di Young dalle curve della forza che passano parecchi punti (Fig. 8). Tutte Le operazioni devono applicarsi alla curva dell'estensione da (normalmente o almeno in liquido) non contiene interazioni come aderenza che rendano una determinazione del punto di contatto impossibile. Il primo punto del trattamento è di rimuovere tutta la stampa offset o di inclinare dalla curva e trovare il punto di contatto. Di Conseguenza le opzioni “Sottraggono il riferimento„ e “il punto di contatto del Ritrovamento„ deve essere selezionato. Non è essenziale per determinare esattamente il punto di contatto o il riferimento ha stampato in offset qui poiché sono parametri variabili di misura e non hanno alcun'influenza sui risultati di misura. Tutta L'inclinazione dovrebbe essere rimossa dal riferimento poiché questo non fa parte di Hertz si è adattato. Il punto seguente è “altezza Corretta per la trave a mensola che piega„, una funzionalità che calcola la profondità della dentellatura catturando la differenza fra il movimento piezo-elettrico e la deflessione verticale a mensola nelle unità della lunghezza. Ora le curve un pronto ad essere misura con il modello di Hertz per derivare il modulo Di Young. Altri valori, quali “il punto di contatto„ misura ed il parametro “RMS residuo„ di qualità di misura egualmente video.

Figura 8. Operazioni per derivare il modulo Di Young da una curva della forza. Il primo punto è di rimuovere tutta la stampa offset o di inclinare dal riferimento e trovare il punto di contatto. Per ottimizzare la determinazione del punto di contatto la curva può essere lisciata. Il seguente ed il punto cruciale sono di sottrarre il piegamento a mensola dal movimento piezo-elettrico per rendere la dentellatura, cioè un nuovo canale chiamato la separazione del campione del suggerimento è creato. Definitivo il modello di Hertz può essere applicato. La geometria del penetratore deve essere specificata come pure il rapporto di Poisson (che può essere lasciato a 0,5 per i campioni biologici) e l'intervallo di dati da misura.

Se molte curve fossero registrate c'è la possibilità per usare l'elaborazione batch dove tutte le operazioni descritte possono applicarsi ad una serie di curve (all'interno di una cartella).

Prima di elaborazione batch, è utile esaminare più dettagliatamente alcune curve per trovare l'intervallo ottimale di misura che può poi applicarsi a tutte le curve. Di Conseguenza l'intervallo di misura dovrebbe essere aumentato per gradi finché il modulo di E tende verso un valore costante. Nella figura 9 il modulo Di Young derivato da una cella di CHO è tracciato nella dipendenza dalla dentellatura. Qui inizio di E catturare i valori costanti a circa 700-800 nanometro di profondità della dentellatura. Se esaminando una schiera delle curve, facendo uso dell'elaborazione batch, questo valore dovrebbe essere usato per l'intervallo di misura. Naturalmente la qualità della misura dovrebbe essere controllata sempre esaminando direttamente le curve o confrontando il RMS residuo che egualmente è annotato nel file di risultati che è generato quando usando l'elaborazione batch.

Figura 9. E contro la curva della dentellatura di una cella di CHO. A circa 700 Certificato di scuola media superiore della dentellatura di nanometro ad un intervallo costante (PA intorno 450).

Verificare il Sistema

Il modulo Di Young è usato spesso descrivere i beni meccanici delle celle e di altri campioni. In molti casi l'intenzione di fare tali esperimenti è di paragonare i risultati ad altri dati, redatti da altri ricercatori. Pettinandosi attraverso la letteratura una trova sempre le discrepanze fra i valori di E di simili esperimenti ma eseguiti facendo uso delle unità differenti. Per valutare come il sistema funziona ma anche guadagnare una sensibilità per la tecnica e la manipolazione è spesso utili da cominciare con un campione in cui l'elasticità già è stata descritta con un simile sistema. I Gel dei polimeri come l'agarosi o l'alcool polivinilico sono campioni welldescribed che sono usati spesso descrivere i principi di misure di elasticità.

Per verificare il sistema su cui la cella sperimenta sono stati eseguiti i 2,5% che il gel di agarosio è stato rientrato facendo uso di una sonda sferica di 11 µm. Poiché i gel di agarosio in questa concentrazione sono più rigidi delle celle, le sonde più rigide devono essere usate, per esempio con le costanti della sorgente di 0.5-5 N/m. In questo esempio una trave a mensola di NSC da mikromasch (4 N/m) sono stati usati. La E corrispondente contro la curva della dentellatura è indicata nella figura 10 che video una E definitiva del kPa intorno 36. Questo valore è d'accordo bene con la letteratura (figura 1).

Figura 10. E contro la curva della dentellatura calcolata per una curva di distanza della forza catturata su un gel di agarosio di 2,5% facendo uso di una sonda sferica di 11 µm con una costante della sorgente di 4 N/m. La E definitiva è kPa intorno 36

Conclusione

Malgrado alcune limitazioni il modello di Hertz è un metodo utile e comunemente usato esprimere i beni meccanici dei campioni biologici come le celle. Ci sono alcune emissioni che dovrebbero essere tenute presente quali l'intervallo di misura o la composizione del campione. I campioni Biologici video spesso il comportamento viscoelastico e sono non omogenei, cioè consistono “dei materiali„ differenti con differenti beni elastici. Per conoscerla esattamente che la componente è descritta esattamente tramite i risultati è la più importante da essere al corrente del campione e da regolare adeguatamente i parametri.

Visto Che tutte queste emissioni contribuiranno a dare i risultati ragionevoli e riproducibili.

I JPK NanoWizard®II o i CellHesion®200 congiuntamente ai supporti dedicati del campione, come il PetriDishHeater™ o il BioCell™, forniscono i mezzi per ottenere i dati di elasticità (fra numeroso altri tipi di dati) per i campioni biologici. Il software del IP di JPK guida Ulteriormente l'utilizzatore con tutti i punti preparare le curve acquistate per Hertz che elabora e fornisce un calcolatore di facile impiego per il modulo Di Young.

Sorgente: Strumenti di JPK

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego gli Strumenti di JPK

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:03

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