באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי לקבוע תכונות אלסטיות של דגימות ביולוגיות של מכשירים JPK

:: AZoNanotechnology סעיף

נושאים שידונו

הקדמה
מודל הרץ
נושאים שיש לקחת בחשבון
לדוגמה מאפיינים
Fit טווח
מבחר Probe
דוגמה של ניסוי הזחה
הכנת Probe
ביצוע ניסויים הזחה
עיבוד נתונים
בדיקת מערכת
מסקנה

הקדמה

באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) עבור nanoindentation התפתחה ככלי שימושי כדי לקבוע תכונות אלסטיות כמו מודול אלסטיות עבור דגימות ביולוגיות (איור 1). Cantilevers לשמש nanoindenters רך המאפשר בדיקה מקומית של דגימות קטנות הומוגניות כמו תאים או רקמות. כדי לחשב את הפרמטר של מודלים עניין שונים נמצאים בשימוש, אך רובם מבוססים על המודל הרץ המורחבת כדי להתאים את תנאי הניסוי לגבי הצורה "indenters או עובי של המדגם.

באיור 1. סקירה של מודולוס של יאנג עבור חומרים ביולוגיים שונים

ניתוח Nanomechanical של תאים הופך חשוב יותר ויותר בתחומים שונים כמו סרטן וביולוגיה התפתחותית. הבדלים הנוקשות של תאים נורמליים להשמיץ נמצאו גם את השינוי פוטנציאל גרורתי עם הפחתת נוקשות הסלולר יכול להיות מסומן. קביעת קליפת התא המתח של שכבת אבות דג הזברה חיידק גילה הבדלים של קשיחות חיצוני, טווינה ו endodermal ובתאים. דוגמה נוספת מתחום הביולוגיה ההתפתחותית היא בדיקה מכנית של מצעי גידול. יישום זה חשף את התפקיד החשוב של גמישות מטריצה ​​עבור מפרט השושלת התא. לא התאים, אלא גם מרכיבים של הסביבה תאיים שלהם, כמו סיבי קולגן נבדקו תכונות מכניות שלהם [17]. הפוטנציאל של מתודולוגיה זו נמצאת בשימוש נרחב בתחומים ביולוגיים אחרים גם כדי לתאר תכונות אלסטיות של מטריצות וחומרים שונים.

דו"ח זה מתאר את היישום רכישת ניסויים גמישות באמצעות טכניקה AFM. סקירה של המודל הנפוץ ביותר, המודל הרץ ניתנת ההנחות והמגבלות הנובעות לשימוש עם דגימות ביולוגיות נידונה בפירוט.

מודל הרץ

המודל הרץ בקירוב המדגם כמו מוצק אלסטי איזוטרופיים וליניארי כיבוש החלל half המשתרע עד אינסוף. יתר על כן ההנחה היא כי indenter אינו deformable וכי אין אינטראקציות נוספות בין indenter ואת המדגם. אם תנאים אלו מתקיימים מודולוס יאנג (E) של המדגם ניתן להתקין או מחושב באמצעות מודל Hertzian. מספר פרמטרים המתארים את המאפיינים של החללית מדגם הכניסה צריך להיות מוגדר.

איור 2. למעלה - סקיצה של הניסוי הכניסה. שלוחה היא התקדמה לעבר המדגם על ידי מרחק z (גובה (נמדד)). שלוחה היא כיפוף לתוך בכיוון ההפוך (x) ואילו המדגם הוא מסוכסך על ידי. ולבסוף מחושב על ידי הפחתת סטיה שלוחה מגובה (נמדד). התחתונה - סכמטי של תיקון גובה עבור שלוחה כיפוף (x) לגזור את קצה מדגם ההפרדה (הכניסה עקומת כוח).

הנתונים המתקבלים על ידי מדידות הכניסה (מצב כוח ספקטרוסקופיה) הם בדרך כלל מגרשים בכוח נגד העקירה piezo, ולא מדגם ההפרדה קצה. כדי להחיל את המודל הרץ, עקומות יש להמיר כמוסבר באיור 2.

המודל מניח הרץ שקע להיות neglectable בהשוואה עובי המדגם, ובכך עומק הכניסה צריך להיות מותאם. המודל הרץ תקף שקעים קטנים (נניח עד 50-10% של גובה של התא, אולי 200-500 ננומטר) שבה המצע אינו משפיע על החישובים. ייתכנו הגבלות נוספות לעומק הכניסה אם המודל צורה טיפ הוא קירוב. לעתים קרובות המודל פרבוליות משמש indenter אם הוא כדור כי זה קל יותר להתאים ו קירוב סביר עבור שקעים קטנים. JPK תוכנת ה-IP מציע מתאים אוטומטית את כל הצורות indenter המוצג כאן, כך שאין עוד צורך להפוך את זה קירוב.

נושאים שיש לקחת בחשבון

המודל הרץ עושה מספר הנחות שאינן נפגשו באמת אם תאים או דגימות ביולוגיות אחרות נבדקות.

בסעיף זה סטיות אלה הם דנו כיצד להפוך את המידות הכי אמין.

לדוגמה מאפיינים

המודל מניח הרץ התנהגות אלסטית מוחלטת, כמו גם ההומוגניות של המדגם. אבל רוב החומרים הביולוגיים הם הומוגניים ולא אלסטי לחלוטין. האנרגיה מועברת על ידי indenter אינו נתון לחלוטין בחזרה על ידי תא (כפי שהוא ייעשה על ידי חומר אלסטי מוחלט) אבל מתפוגג בשל צמיג והתנהגות פלסטיק גם מופיע hysteresis בין להאריך את לסגת חלק של עקומת כוח (איור 3). השתנות של התנהגות צמיג הופך לגלוי אם מהירויות הכניסה שונים נבדקים. ככל קצב הטעינה, קטן הכניסה ואת קשיחות גבוהה יותר לעין. ציר הזמן המתאר את ההתנהגות הזאת זה הזמן הרפיה שונה של חומר צמיג / viscoelastic כל אחד. באמצעות מהירויות סמוך לזמן רגיעה תביא כוחות נמוך, כי את החומר לתא יש זמן להתרחק החללית indenting. גבוהה מהירויות לגרום התנגדות גבוהה יותר של החומר מדגם האינטראקציה הכולל הוא אלסטי יותר (כוח נמצא בשלב עם הכניסה, לא מהירות). באופן כללי עדיף להישאר עקבי פרמטר זה לקבל את תנאי ההתחלה זהה עבור כל ניסוי. אבל אסור לשכוח כי כל חומר או סוג תא יש לו זמן רגיעה משלה מאז שהם יכולים להשתנות במידה רבה בהרכב שלהם (בגודל של גרעין, הרכב cytoskeleton וכו ').

איור 3. המרחק עקומת כוח לקחה על התא החי CHO (מהירות סריקה 5 מיקרומטר / s). עקוב אחר (אדום) לשחזר (אדום כהה) עקומת מראים בבירור בשל hysteresis להתנהגות צמיג פלסטיק של התא.

Inhomogeneity המדגם גם יכול לגרום חפצים כמו וריאציה של מודול של יאנג, תלוי בעומק הכניסה, כלומר בהתאם השכבה או רכיב indenter הוא למעשה לחיצה פנימה תאים יש מרכיבים שונים (כמו glycocalix, הרחבות קרום, גרעין או אברונים) זה יכול לשקף קשיחות שונות. נקודת מגע הוא גם סובל אלה וריאציות אינטראקציות של החללית ואת משטח מדגם או מולקולות כי הם מכסים את פני השטח. עקומות אלה מציגים לעתים קרובות נקודת מגע רדוד מאוד שבו E מחושב להיות רך יותר המדגם באמת. קשיחות "האמיתי" של המדגם ובכך נמדדת רק כאשר החללית מגיעה משטח ראוי כי הוא אחרי החלק הרדוד של העקום. ואז להתאים אינה תואמת את נקודת הקשר של עקומת כוח-הכניסה (איור 4). אבל זה לא מפתיע שכן המודל מניח הרץ ההומוגניות של המדגם ואין אינטראקציות בין המדגם בדיקה. בסופו של דבר, זה תמיד חשוב להתמקד בחלק של העקום המייצג את מבנה אתה רוצה לחקור.

איור 4. עקומות כוח מול הכניסה שמקורם בתא, מצויד הדגם הרץ. עקומת אותו הראשון היה מצויד בשקע של 200 ננומטר (למעלה), והשני מעל טווח ההזחה שלם של 400 ננומטר (התחתון). כמובן בדיקה דחף באמצעות שתי שכבות שונות מאז נקודת מגע מצויד העקומה הראשונה היא שונה מנקודת מגע של העקום השני. מודול E של העקום הראשון, המתאר את הנוקשות של תא השטח, הוא כ 16 kPa, זה של העקום השני, כי ניתן להניח כי מודול te E של הציטופלסמה, על kPa 35.