JPK の器械によって生物的サンプルの伸縮性がある特性を定める原子力の顕微鏡検査を使用して

カバーされるトピック

導入
Hertz は模倣します
考慮されるべき問題
サンプル特性
適当な範囲
プローブの選択
刻み目の実験の例
プローブの準備
刻み目の実験の実行
データ処理
システムのテスト
結論

導入

原子力を使用して nanoindentation (AFM) のための顕微鏡は伸縮性がある特性を定める役に立つツールが生物的サンプル (図 1) のための弾性率を好むと同時に現れました。 片持梁は柔らかい nanoindenters として役立ちまセルまたはティッシュのような小さく、異種のサンプルのローカルテストを許可します。 興味のさまざまなモデルのパラメータを計算するためには使用されます、しかし殆んどは Hertz モデルに基づき、圧子のサンプルの形または厚さに関する実験条件に一致させるために伸びます。

異なった生物的材料のためのヤングの係数の図 1. 概要

セルの Nanomechanical の分析は癌および進化の生物学のような異なったフィールドでますます重要になっています。 常態および有害なセルの剛さの相違は見つけられ、また減少した細胞剛さの metastatic 潜在性の変更はマークすることができます。 zebrafish の胚葉の祖先の細胞皮質の張力を定めることは ecto、 meso および endodermal 祖先のセルの剛さの相違を明らかにしました。 進化の生物学のフィールドからのもう一つの例は成長の基板の機械テストです。 このアプリケーションはセル血統の指定のためのマトリックスの伸縮性の重要な役割を明らかにしました。 セルだけしかしコラーゲンの原繊維のような細胞外の環境のまたコンポーネントは、機械特性 [17] のためにテストされました。 この方法の潜在性はまた生物的で広く利用されて他の訓練異なったマトリックスおよび材料の伸縮性がある特性を記述するために。

このレポートは AFM の技術を使用して伸縮性の実験のアプリケーションそして獲得を記述します。 最も広く使われたモデルの概要は、 Hertz モデル与えられ、生物的サンプルとの使用のための仮定および生じる限定は詳しく論議されます。

Hertz は模倣します

Hertz モデルは無限に延長半分スペースを占める等方性および線形伸縮性がある固体としてサンプルを近づけます。 なお圧子が deformable ではないことが、そして圧子とサンプル間に追加相互作用がないこと仮定されます。 これらの条件が満たされればサンプルのヤングの係数 (e) はヘルツモデルを使用して合うか、または計算することができます。 サンプルおよび刻み目のプローブの特性を記述する複数のパラメータは指定されなければなりません。

図 2. 刻み目の実験のトップのスケッチ。 片持梁は間隔 z ((測定される) によってサンプルの方に高さ) 移動されます。 片持梁は反対の方向 (x) にサンプルが ä によって字下がりにされる間曲がっています。 最後に ä は高さから片持梁偏向を計算されます (測定される) 引くことによって。 底 - 先端サンプル分離 (力の刻み目のカーブ) を得る片持梁曲がる (x) のための高さの訂正の設計図。

刻み目の測定 (力の分光学のモード) によって得られるデータは通常 piezo 変位に対して力のプロット、よりもむしろひっくり返しますサンプル分離をです。 Hertz モデルを加えるためには、カーブは図 2. で説明されているように変換される必要があります。

Hertz モデルはサンプル厚さと比較して neglectable であると刻み目が仮定します従って刻み目の深さは最適化されなければなりません。 Hertz モデルは基板が計算に影響を及ぼさないところで小さい刻み目のために有効です (セルの高さの 5-10% まで、多分 200-500 nm を言って下さい)。 先端の形モデルが近似なら刻み目の深さに追加限定があるかもしれません。 多くの場合放物線モデルは合うことは容易であり、近似が小さい刻み目のために適度であるので圧子が球なら使用されます。 JPK IP のソフトウェアはここに示されているすべての圧子の形のための自動付属品をそうそこにですもはやこの近似をする必要性提供しません。

考慮されるべき問題

Hertz モデルはセルか他の生物的サンプルが検査されれば偽りなく会わない複数の仮定をします。

最も信頼できる測定をする方法をこのセクションでこれらの偏差は論議され。

サンプル特性

Hertz モデルはサンプルの絶対伸縮性がある動作、また同質性を仮定します。 しかしほとんどの生物的材料は同質絶対に伸縮性がありません。 圧子によって提供されるエネルギーはセルによって完全に力の延長と引き込めの部品間のヒステリシスが曲がると同時に (絶対伸縮性がある材料によって) 行われるが、ので与えられませんでしたりまた現われる粘性およびプラスチック動作のために散ります (図 3)。 粘性動作の可変性は目に見えるもし違ったら刻み目の速度にテストされますなります。 より高いローディングレート、より小さく刻み目およびより高い明白な剛さ。 この動作を記述する時間目盛は緩和時間で、各々の粘性/粘弾性がある材料のために異なっています。 緩和時間の近くの速度を使用してセル材料は字下がりにするプローブから移る時間があるので、より低い力で起因します。 高速はサンプル材料のより抗力が高いので起因し、全面的な相互作用はより伸縮性があります (力は刻み目、ない速度の段階にあります)。 各実験のための同じ最初の条件を持つために一般にこのパラメータで一貫しているとどまることが最善です。 しかしそれらが構成 (細胞骨格等の核、構成のサイズ) で非常に変わってもいいので各材料またはセルタイプが自身の緩和時間を過すことが忘れられているべきではないです。

取られる生きている CHO のセル (スキャン速度 5 µm/s) の図 3. 力の間隔のカーブ。 (赤) トレースし、セルの粘性およびプラスチック動作のために (えんじ色の) はっきりカーブショーヒステリシスを再トレースして下さい。

サンプルの異種はまた刻み目の深さによってヤングの係数の変化のような人工物で起因できますすなわち層かコンポーネントによって圧子は実際に押しています。 セルに別の剛さを反映できるさまざまなコンポーネントがあります (glycocalix、膜の拡張、核、または細胞器官のように)。 接点はまた表面をカバーしているプローブのこれらの変化にそして相互作用およびサンプル表面または分子苦しんでいます。 そのようなカーブは頻繁に E が柔らかいために計算される非常に浅い接点をよりサンプル実際にある示します。 サンプルの 「実質の」剛さはこうしてプローブがカーブの浅い部分の後にある適切な表面に達するときしか測定されません。 それから適合は力刻み目カーブ (図 4) の接点に一致させません。 しかしこれは Hertz モデルがサンプルとプローブ間のサンプルそして相互作用の同質性を仮定しないので意外ではないです。 最後に、あなたが調査したいと思う構造を表すカーブの方に焦点を合わせることは重要常にです。

図 4. 力対 Hertz モデルと合うセルから得られる刻み目のカーブ。 同じは 200 nm (上) の、そして二番目に 400 nm (底) の全刻み目の範囲上の刻み目に最初に合いました曲がります。 明らかにプローブは 2 つの層によって最初のカーブの合われた接点が第 2 カーブの接点と異なっているので押しました。 セル表面の剛さを記述する最初のカーブの E のモジュールは約 16 kPa、細胞質の te E のモジュールの仮定することができる第 2 カーブの 1 約 35 kPa です。

適当な範囲

また重要伸縮性の計算のための最適および再生可能な結果をもたらすのに使用される適合の範囲を見つけることはです。 E の上のセクションに記述されているように強く接点のまわりで非常に低い刻み目で変動しますしかし範囲最終的に基板の剛さの結果として増加への増加する刻み目が付いているプラトー再度、主に (スライドガラス等は、図 5 の底を見ます)。 従って字下がりにされた構造の高さは考慮される強くべきです。 Hertz モデルは基板が計算に影響を及ぼさないところで、そして刻み目の幾何学が圧子の幾何学に一致させるところで小さい刻み目のためだけに有効です (セルの高さの 5-10% まで、多分 200-500 nm を言って下さい)。 上記の Hertz セクションに記述されているように、最適範囲を見つける最もよい方法は比較的高い刻み目が付いている力の間隔のカーブを記録し、対応する力の刻み目のカーブの各ポイントのための E に合うことです。 E がヤングの係数 (図 5、中間) を定めるのに使用されるべきである一定した値の方にがちで始めるとき刻み目上の計画 E は刻み目を明らかにします。

しかしそれは特に異種のサンプルをことを字下がりにするとき明らかなプラトーがないこと起こることができます。 セルが比較的小さい圧子 (例えばピラミッド) を使用して核の上で正しくテストされれば例えば、核はプローブの下から入れることができ、核がプローブ (図 5 の上) によって押された直後に結果は測定された係数の減少です。

図 5. E 対異なった領域で錐体圧子と厳密に調べられる CHO のセルの刻み目のカーブ: (中間) 核の隣で核 (上)、領域の上で右およびセル (底) の端に近づいて下さい。 正しく核 (上) の上のテストはここに一時的に核の剛さしか表示しませんでした。 明らかに核は E. Probing の減少に終ってそれから比較的同種領域の (中間の) 明らかにされた 250 nm 頃開始する細胞質の刻み目押されました。 セル端 (底) の刻み目は秒、比較的低い刻み目で開始する基板の E の依存した増加の原因となります。

図 5 の 3 つのカーブはすべて同じセルから得、同じ条件の下の同じプローブと丁度取られました。 両方のためのガラス基板の効果の E そしてこうして明らかか典型的なヒントに明らかな 「二番目に」増加が上部 E 対刻み目のカーブないのに、中心体からの端への明白な剛さの増加は基板の影響を明記します。 しかしこれは 0.5 の µm のまわりにおよそ 1.3 µm と端であるために核のセルの高さがおよそ 5 µm であるために測定されたのでで意外核の包囲ではないです。 最後にこれらの結果は基板の効果がセルことをのより薄い領域で E 内の E の増加によって対刻み目のカーブしかしまた E 値の増加によってだけ目に見えることを示します。

プローブの選択

どの片持梁が使用されるべきであるか決まりますサンプルの剛さによって。 一般的に 1 つは片持梁の剛さがサンプル剛さの範囲のまわりにあるべきであることに留意できます。 非常に柔らかく、敏感ばねの定数と使用できる最も柔らかい片持梁がおよそであるセルのために 10-30 mN/m は使用されるべきです。 アガロースのゲルのより高いばねの定数のようなより堅いサンプルのために (30-100 mN/m または多く) 適切でであって下さい。

考慮するべきもう一つのポイントは圧子の形の選択です。 柔らかい生物的サンプルのために低圧で起因する鋭い錐体か円錐先端が使用されれば事実でであって下さいより力がより広いサンプル領域に加えられるので球形のプローブを使用することを推薦します。 サンプルのこの方法浸透は防がれます。 しかしこれは球形の圧子を好む唯一の理由ではないです。 セルかティッシュは非常に異種で、異なったコンポーネント (核、 cytoskeletal コンポーネント、細胞器官…) から成っています。 20 の µm のビードのようなそのような異種材料の比較的大きい圧子のための汎用印象をもたらすことが有用でであって下さい。

高リゾリューションを、例えばテスト単一セルか異なったセル部品へもたらすことは、か小さい直径のより堅い材料のビードを字下がりにする圧力を高めることは使用することができます (望ましい解像度による 1-10 µm、)。 球は最もよい解決常にではないです。 サンプルが非常に小さい次元またはもし違ったらなら領域高リゾリューションの (高くより 1 ミクロン) 錐体窒化珪素の先端でテストされることは代わりである場合もありますあります。 そのようなの不利な点はもっとまたはより少なく鋭い先端当然そのそれら場合がありますサンプルを突き通し、ヤングの係数 (一般に剛さの減少) の不正確な計算にこうして導くです。

しかし一方ではそれらは glycocalix から伸びる細胞拡張のような構造か残余によってより少なく球があるより妨げられます。 球形の圧子は頻繁にそのような拡張を感じ、結果は定まり非常ににくいの非常に浅い接点ですなぜ合うべきであるか) (また理由の。 セルと発生する汎用問題は大抵表示される歪められた力のカーブ、ので接触領域 (図 6) の 「肩」です。 これらのゆがみはのような小さい構造が付いている接触からプローブから入れる membranous 拡張のまたは第 2 接点の原因となるストレス・ファイバー、張線維得ることができます。

図 6. Distorted 2 つの µm の球形の圧子を使用して CHO のセルで取られるカーブを伸ばします。

刻み目の実験の例

この例で生存 CHO のセルのヤングの係数を得る作業の流れは記述されています。 ツァイスの光学顕微鏡 (AxioObserver) に取付けられた CellHesion® 200 が使用される筈だった、また刻み目の実験を行うために CellHesion® 200 が細胞付着および機械工をテストする必要性を満たすために専ら発達する新しい AFM によって基づく装置、である球形のプローブを準備するのに使用されました。 PetriDishHeater™はサンプルホールダーとしてセルが WPI ペトリ皿で育ったので使用されました。 セルは全実験 (37°C の HEPES によって緩衝される媒体) の間に生理学的な条件の下で保たれました。

プローブの準備

球形の圧子は Novascan (片持梁に接続する 0.6-25 の µm ガラス球) からの粒子のプローブのような特別な提供者から購入することができますかまたは片持梁の球をつけることによって手製でもいいです。 そのような目的の tipless 片持梁のためにうってつけでであって下さい。 心配は特に小さい球を添付すれば先端の片持梁が使用されれば取られなければなりません。 これは特に選択された球の直径がチップ高さよりより少しなら先端にまだ実験の影響があるように、球が先端の側面に接続するので、あります端によりもむしろ。 ケイ素の片持梁におよそ 15 まで µm の先端があります。 従ってより短い先端が (5 まで µm) ある tipless 片持梁はよりよい選択または少なくとも窒化珪素の片持梁です。

この例のため tipless 片持梁 (矢 TL1、 NanoWorld、 k は刻み目のプローブ (図 7) として = 接続された無水ケイ酸球 (直径 11 の µm) との 0.03 N/m) 使用されました。 無水ケイ酸のビードは 2 部のエポキシが付いている片持梁、他の biocompatible 接着剤に光学接着剤がまたうってつけであるように接続しましたが。 これは球が隣接した部分の 1 つの部そしてエポキシで沈殿する顕微鏡のスライドの準備によって容易にすることができます。 ビードが液体で中断されれば、低下はスライドに置かれ、乾燥します。 きれいなピンセットのペアはまたスライドに乾燥したビードを転送するか、またはビードの解決を広げるのに使用することができます。 それからわずかエポキシは刃またはピペットの先端を使用してビードの近くで非常に薄く広がります。

接続する 11 ミクロン球が付いている図 7. Tipless の片持梁

片持梁はエポキシに最初に浸らなければなりません。 アプローチはガラスのきれいな領域で表面を見つけるために行われます。 それから片持梁先端は位置ねじを使用してエポキシパッチの端に置かれ、接着剤に先端を浸すために力の分光学の測定は動作します。 およそ 0.5 から 1 ボルトのセット・ポイントは十分なべきです。 先端にたくさんの接着剤があればビードに流れ、それを埋め込むことができます。 これを防ぐためには、 1つ以上の追加分光学の測定はきれいなガラス領域で行われるべきです。 これは余分な接着剤を取除きます。 最後に、球を接続するために、別の力のカーブは球に置かれる先端と動作します。

刻み目の実験の実行

microsphere のプローブは取付けられ、 AFM ヘッドで通常ように一直線に並びました。 付着性 CHO のセルを含んでいる WPI ペトリ皿はペトリ皿のヒーターに取付けられ、温度は 37°C. にセットされました。 片持梁は丁度サンプルに適用されるべき力を指定できるためにそれから、すなわちばねの一定した断固としたの目盛りが付いていました。 NanoWizard® か CellHesion200® を使用して JPK SPM のソフトウェアの口径測定マネージャは線形接触の部品内の力のカーブに (堅い基板で取られる) 合い、一定した熱騒音方法とばねを定めることによって感度を計算する口径測定プロセスによってユーザーを導きます。 口径測定が完全なら、望ましいセット・ポイント力はニュートンで入力することができます (通常 pico- か nano ニュートン)。 ここで実験は開始できます。

力の間隔のカーブは異なったセルの核の上で直接取られました。 比較的高い setpoints はこれらのセルの機械特性が未知だったので使用されました (4 まで nN)。 拡張は 5 µm/s に/速度をセットされました引き込め、閉じたループは使用されました。

データ処理

JPK IP のソフトウェアは動作する複数のステップ (図 8) による力のカーブからヤングの係数を得るために可能性を与えます。 すべての操作はそれ以来の延長カーブに (普通または少なくとも液体で) 含んでいません接点の決定を不可能にする相互作用をように付着適用されなければなりません。 処理の第一歩はオフセットを除去しか、またはカーブから傾き、接点を見つけることです。 従ってオプションは 「ベースライン」を引き、 「発見接点」は選ばれるべきです。 接点を丁度定めることは必要ではないですまたはそれらが可変的な適合パラメータで、適合の結果の影響を持っていないのでベースラインはここに相殺しました。 これが Hertz 適合の部分ではないのでどの傾きでもベースラインから取除かれるべきです。 次のステップは曲がる片持梁 「のための」正しい高さ長さの単位の piezo 動きと片持梁縦の偏向の間で相違を取ることによって刻み目の深さを計算する機能です。 ここでカーブ Hertz モデルとヤングの係数を得るために合われること準備ができたの。 合われた 「接点」および適合の品質パラメータ 「残り RMS」のような他の値は、また表示されます。

力のカーブからヤングの係数を得る図 8. 操作。 第一歩はオフセットを除去しか、またはベースラインから傾き、接点を見つけることです。 接点の決定を最適化するためにはカーブは滑らかにすることができます。 次および重要な一歩は刻み目をもたらす piezo 動きから片持梁に曲がることを引くことです先端のサンプル分離と呼出されるすなわち新しいチャネルは作成されます。 最後に Hertz モデルは応用である場合もあります。 圧子の幾何学は、また (生物的サンプルのための 0.5 で残すことができる) ポアソンの比率合うべきデータ範囲指定されるべきで。

多くのカーブが記録されたらバッチすべての記述されていた操作がカーブのバッチに適用することができるところでプロセシングを使用する可能性があります (1 冊のホールダーの内で)。

バッチプロセシング前に、すべてのカーブに加えることができる最適適合の範囲を見つけるために少数のカーブをより詳しく検査することは有用です。 従って適合の範囲は E の係数が一定した値の方にがちであるまで 1 歩ずつ増加するべきです。 図 9 で CHO のセルから得られるヤングの係数は刻み目への依存で計画されます。 ここに刻み目の深さの 700-800 nm 頃一定した値を取る E の開始。 カーブのアレイを、バッチプロセシングを使用して検査していたら、この値は適合の範囲に使用するべきです。 当然適合の品質は直接カーブを見ることまたはまた生成される結果ファイルに書かれる残り RMS を比較することによって常に点検されるべきですバッチプロセシングを使用した場合。

図 9. E 対 CHO のセルの刻み目のカーブ。 一定した範囲 (およそ 450 Pa) への 700 の nm の刻み目 E のレベル頃。

システムのテスト

ヤングの係数は頻繁に使用されますセルおよび他のサンプルの機械特性を記述するために。 多くの場合そのような実験をする意思は他の研究者が作り出す他のデータと結果を比較することです。 文献 1 を通ってとかすことは E 値間の矛盾を同じような実験の行われる異なった装置を使用して常に見つけます。 システムが評価することはどのように働くが、また技術のための感じおよびそれを扱うことを得ることは頻繁に伸縮性が同じようなシステムと既に記述されてしまったサンプルかから開始して有用です。 アガロースまたはポリビニルアルコールのようなポリマーのゲルは伸縮性の測定の原則を記述するために頻繁に使用される welldescribed サンプルです。

セルが実験するシステムをテストするためには 2.5% 行われましたアガロースのゲルが 11 の µm の球形のプローブを使用して字下がりにされた。 この集中のアガロースのゲルがセルより堅いので、より堅いプローブは 0.5-5 N/m. のばねの定数と、例えば使用されなければなりません。 この例 mikromasch からの NSC の片持梁 (4 N/m) は使用されました。 対応する E は対刻み目のカーブおよそ 36 kPa の最終的な E を表示する図 10 で示されています。 この値は文献 (図 1) とよく一致します。

2,5% のアガロースのゲルの図 10. E 対 4 N/m. のばねの定数の 11 の µm の球形のプローブを使用して取られる力の間隔のカーブのために計算される刻み目のカーブ。 最終的な E はおよそ 36 kPa です

結論

セルのような生物的サンプルの機械特性を表現することある限定にもかかわらず Hertz モデルは有用な、広く使われた方法です。 サンプルの適合の範囲か構成のような留意されるべきであるある問題があります。 生物的サンプルは頻繁に粘弾性がある動作を表示し、異なった伸縮性がある特性が付いている異なった 「材料」から異種、すなわち成っていますです。 コンポーネントが結果によって丁度記述されているそれを丁度知ることはサンプルを知り合い、十分にパラメータを調節して重要です。

これらの問題がすべて適度で、再生可能な結果をもたらすのを助けることを考えると。

JPK NanoWizard®II か専用サンプルホールダーと組み合わせた CellHesion®200 はPetriDishHeater™または BioCell™のような、生物的サンプルの伸縮性データを (多数の中で他のデータタイプ) 得る方法を提供します。 さらに JPK IP のソフトウェアはすべてのステップによってユーザーが処理する Hertz のために得られたカーブを準備するのを助け、ヤングの係数に使いやすい計算機を提供します。

ソース: JPK の器械

このソースのより多くの情報のために JPK の器械を訪問して下さい

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:06

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