Bruk Atomic Force Mikroskopi fastslår Elastisk Properties av biologiske prøver ved JPK Instruments

:: AZoNanotechnology Artikkel

Emner som dekkes

Innledning
Den Hertz Model
Problemer med å bli vurdert
Eksempel Properties
Fit Range
Valg av Probe
Eksempel på en Innrykk Experiment
Utarbeidelse av Probe
Utføre Innrykk Experiments
Data Processing
Testing System
Konklusjon

Innledning

Bruke atomic force mikroskop (AFM) for nanoindentation har dukket opp som et nyttig verktøy for å bestemme elastiske egenskaper som elastisk modulus for biologiske prøver (figur 1). Cantilevers tjene som myk nanoindenters tillate lokale testing av små og inhomogene prøver som celler eller vev. For å beregne parameter av interesse ulike modeller blir brukt, men de fleste av dem er basert på Hertz-modellen og utvidet for å matche den eksperimentelle forholdene vedrørende Indenters "-form eller tykkelse av prøven.

Figur 1. Oversikt over Youngs modulus for ulike biologiske materialer

Nanomechanical analyse av celler blir stadig viktigere i forskjellige områder som kreft og utviklingsbiologi. Forskjeller i stivhet i normal og sverte celler ble funnet og også endringen i metastatisk potensial med avtagende cellular stivhet kan merkes. Bestemme cellen cortex spenningen sebrafisk bakterie lag stamfedre avslørt forskjeller i stivhet i ecto-, meso-og endodermal stamceller. Et annet eksempel fra feltet av utviklingsbiologi er en mekanisk testing av vekst underlag. Denne applikasjonen avslørte den viktige rollen matrix elastisitet for celle avstamning spesifikasjonen. Ikke bare celler, men også deler av sin ekstracellulære miljøet, har som kollagen fibriller blitt testet for sine mekaniske egenskaper [17]. Potensialet i denne metoden er mye brukt i biologisk og også andre disipliner for å beskrive elastiske egenskaper av forskjellige matriser og materialer.

Denne rapporten beskriver programmet og oppkjøpet av elastisitet eksperimenter ved hjelp av AFM teknikk. En oversikt over de mest brukte modellen, er Hertz modell gitt og de forutsetninger og resulterende begrensninger for bruk med biologiske prøver er diskutert i detalj.

Den Hertz Model

Den Hertz Modellen approximates prøven som isotrope og lineær elastisk solid opptar en uendelig utvide halv plass. Videre er det antatt at indenter er ikke deformerbare og at det er ingen ekstra interaksjoner mellom indenter og prøve. Dersom disse vilkårene er oppfylt i Youngs modulus (E) av prøven kan monteres eller beregnes ved hjelp av Hertzian modell. Flere parametere som beskriver egenskapene til prøven og innrykk probe må spesifiseres.

Figur 2. Top - Skisse av innrykk forsøket. Den cantilever flyttes mot prøven ved en avstand z (høyde (målt)). Den cantilever bøyer seg i motsatt retning (x) mens prøven er innrykket av en. Endelig et beregnes ved å trekke cantilever deflection fra høyden (målt). Bottom - Skjematisk av korrigering av høyde for cantilever bøying (x) til å utlede tip-sample-separasjon (force innrykk kurve).

Dataene innhentet ved innrykk målinger (force spektroskopi modus) er vanligvis plott av makt mot piezo forflytning, snarere enn spissen prøve separasjon. Hvis du vil bruke Hertz modell, kurvene må konverteres som forklart i figur 2.

Den Hertz Modellen forutsetter innrykk være neglectable i forhold til prøven tykkelse, og dermed innrykk må være optimalisert. Den Hertz modellen er gyldig for små fordypninger (si opptil 5-10% av høyden på cellen, kanskje 200-500 nm) der underlaget ikke påvirker beregningene. Det kan være ytterligere begrensninger i innrykk hvis spissen forme modellen er en tilnærming. Ofte parabolske modellen brukes hvis indenter er en sfære fordi det er enklere å montere og tilnærming er rimelig for små fordypninger. Den JPK IP programvare tilbyr automatisk passer for alle indenter former vises her, så det er ikke lenger nødvendig å gjøre dette tilnærming.

Problemer med å bli vurdert

Den Hertz Modellen gjør flere forutsetninger som ikke er helt oppfylt dersom celler eller andre biologiske prøver er undersøkt.

I denne seksjonen disse avvikene blir drøftet og hvordan du får mest mulig pålitelige målinger.

Eksempel Properties

Den Hertz Modellen forutsetter absolutt elastisk oppførsel samt homogenitet av prøven. Men de fleste biologiske materialer er verken homogent eller helt elastisk. Energien levert av indenter er ikke helt gitt tilbake av en celle (som det ville skje ved et absolutt elastisk materiale), men forsvinner på grunn av tyktflytende og plast atferd som også vises som hysterese mellom utvide og trekke en del av kraften kurven (fig. 3). Variabilitet av den tyktflytende adferd blir synlig hvis forskjellig innrykk hastigheter er testet. Jo høyere overføringshastighet, desto mindre innrykk og jo høyere den tilsynelatende stivhet. Tidsskalaen beskriver denne atferden er avslapning tid og er forskjellig for hver tyktflytende / viscoelastic materiale. Bruk hastighetene nær avslapning tid vil resultere i lavere styrker, fordi cellen materialet har tid til å bevege seg bort fra innrykk probe. Høyere hastigheter resultere i en høyere motstand av prøvematerialet og det generelle samspillet er mer elastisk (force er i fase med innrykk, ikke hastighet). Generelt er det best å holde seg konsekvent i denne parameteren skal ha samme startbetingelsene for hvert forsøk. Men det bør ikke bli glemt at hver materiale eller celletype har sin egen avslapning gang siden de kan variere sterkt i sin sammensetning (størrelsen på kjernen, sammensetningen av cytoskjelettet etc.).

Figur 3. Force avstand kurve tatt med på en levende CHO celler (skannehastighet 5 mikrometer / s). Trace (rød) og gå tilbake (mørk rød) kurve viser tydelig hysterese på grunn av viskøse og plast oppførsel av cellen.

Inhomogeneity av prøven også kan resultere i gjenstander som variasjon over Youngs modulus avhengig av innrykk, dvs. avhengig av lag eller komponent indenter er faktisk trykke inn Cells har ulike komponenter (som glycocalix, membran extensions, nucleus, eller organeller) som kan gjenspeile ulik stivhet. Kontakten Poenget er også lider av disse variasjonene og interaksjoner av sonden og prøven overflaten eller molekyler som dekker overflaten. Slike kurver viser ofte en veldig grunt kontaktpunkt der E er beregnet til å være mykere enn prøven egentlig er. Den "ekte" stivhet i prøven således kun måles når sonden kommer riktig overflate som er etter den grunne delen av kurven. Da passer ikke samsvarer kontakten punktet i Force-innrykk-kurven (figur 4). Men dette er ikke overraskende siden Hertz modellen forutsetter homogenitet i prøven og ingen interaksjoner mellom prøven og probe. Til slutt er det alltid viktig å fokusere på den delen av kurven som representerer strukturen du ønsker å undersøke.

Figur 4. Force versus innrykk kurver utledet fra en celle, utstyrt med Hertz modell. Den samme kurven første var montert på en innrykk på 200 nm (øverst), og andre over hele innrykk utvalg på 400 nm (nederst). Tydeligvis sonden presset gjennom to forskjellige lag siden monteres kontaktpunkt i den første kurven er forskjellig fra kontaktpunkt i den andre kurven. E-modulen i den første kurven, beskriver stivhet av cellen overflaten, er rundt 16 kPa, den ene av den andre kurven, som kan antas å være te E-modulen til cytoplasma, ca 35 kPa.