Usando a Microscopia Atômica da Força Para Determinar as Propriedades Elásticas de Amostras Biológicas por Instrumentos de JPK

Assuntos Cobertos

Introdução
Hertz Modela
Edições A Ser Consideradas
Propriedades da Amostra
Escala Apta
Selecção da Ponta De Prova
Exemplo de uma Experiência do Recorte
Preparação da Ponta De Prova
Executando Experiências do Recorte
De Processo De Dados
Testando o Sistema
Conclusão

Introdução

Usar o microscópio atômico da força (AFM) para o nanoindentation emergiu enquanto uma ferramenta útil para determinar as propriedades elásticas gosta do módulo elástico para amostras biológicas (figura 1). Os Modilhões servem como nanoindenters macios permitindo o teste local de amostras pequenas e inhomogeneous como pilhas ou tecidos. Para calcular o parâmetro de vários modelos do interesse são usados, mas a maioria deles são baseados no modelo de Hertz e estendidos para combinar as condições experimentais a respeito da forma ou da espessura dos indenters da amostra.

Figura 1. Vista Geral do módulo Young para materiais biológicos diferentes

A análise de Nanomechanical das pilhas está tornando-se cada vez mais importante em campos diferentes como o cancro e a biologia desenvolvente. As Diferenças na rigidez do normal e de pilhas caluniadas foram encontradas e igualmente a mudança no potencial metastático com diminuição da rigidez celular pode ser marcada. Determinar a tensão do córtice de pilha de ancestral da camada de germe dos zebrafish revelou diferenças na rigidez das pilhas ecto, meso e endodermal do ancestral. Um Outro exemplo do campo da biologia desenvolvente é o teste mecânico de carcaças do crescimento. Esta aplicação revelou o papel importante da elasticidade da matriz para a especificação da linhagem da pilha. Não somente as pilhas mas igualmente os componentes de seu ambiente extracelular, como fibrilas do colagénio foram testados para suas propriedades mecânicas [17]. O potencial desta metodologia é amplamente utilizado em biológico e outras disciplinas descrever igualmente as propriedades elásticas de matrizes e de materiais diferentes.

Este relatório descreve a aplicação e a aquisição de experiências da elasticidade usando a técnica do AFM. Uma vista geral do modelo o mais de uso geral, o modelo de Hertz é dada e as limitações das suposições e resultar para o uso com amostras biológicas são discutidas em detalhe.

Hertz Modela

O modelo de Hertz aproxima a amostra como um sólido elástico isotropic e linear que ocupa um meio espaço infinita de alargamento. Além Disso supor que o indenter não é deformable e que não há nenhuma interacção adicional entre o indenter e a amostra. Se estas circunstâncias são estadas conformes o módulo Young (e) da amostra pode ser cabido ou calculado usando o modelo Hertzian. Diversos parâmetros que descrevem as propriedades da ponta de prova da amostra e do recorte têm que ser especificados.

Figura 2. Parte Superior - Esboço da experiência do recorte. O modilhão é movido para a amostra por uma distância z (altura (medida)). O modilhão está dobrando-se no sentido oposto (x) enquanto a amostra é recortada pelo ä. O ä é calculado Finalmente subtraindo a deflexão do modilhão da altura (medida). Parte Inferior - Diagrama Esquemático da correcção da altura para a dobra do modilhão (x) para derivar a ponta-amostra-separação (curva do recorte da força).

Os dados obtidos por medidas do recorte (modo da espectroscopia da força) são geralmente lotes da força contra o deslocamento piezo, um pouco do que a separação da amostra da ponta. Para aplicar Hertz modele, as curvas precisam de ser convertidos como explicado em figura 2.

O modelo de Hertz supor o recorte para ser neglectable em comparação com a espessura da amostra, assim a profundidade do recorte tem que ser aperfeiçoada. O modelo de Hertz é válido para recortes pequenos (diga até 5-10% da altura da pilha, talvez 200-500 nanômetro) onde a carcaça não influencia os cálculos. Pode haver umas limitações adicionais na profundidade do recorte se o modelo da forma da ponta é uma aproximação. O modelo parabólico é usado Frequentemente se o indenter é uma esfera porque é mais fácil caber e a aproximação é razoável para recortes pequenos. O software do IP de JPK oferece o encaixe automático para todas as formas do indenter mostradas aqui, tão lá é já não toda a necessidade de fazer esta aproximação.

Edições A Ser Consideradas

O modelo de Hertz faz diversas suposições que não são encontradas verdadeiramente se as pilhas ou outras amostras biológicas são examinadas.

Nesta secção estes desvios são discutidos e como fazer as medidas as mais seguras.

Propriedades da Amostra

O modelo de Hertz supor o comportamento assim como a homogeneidade elásticos absolutos da amostra. Mas a maioria de materiais biológicos são nem homogêneos nem absolutamente elásticos. A energia entregada pelo indenter não é dada completamente para trás por uma pilha (porque seria feita por um material elástico absoluto) mas dissipa-se devido ao comportamento viscoso e plástico que igualmente aparece enquanto a histerese entre o alargamento e a peça do retraimanto da força se curva (Fig. 3). A variabilidade do comportamento viscoso torna-se visível se as velocidades diferentes do recorte são testadas. Mais alta a taxa de carregamento, menor o recorte e mais alto a rigidez aparente. A escala de tempo que descreve este comportamento é o tempo de abrandamento e é diferente para cada material viscoso/viscoelastic. Usar velocidades perto do tempo de abrandamento conduzirá a umas mais baixas forças, porque o material da pilha tem o tempo para se mover longe da ponta de prova de recorte. Umas velocidades Mais Altas conduzem a uma resistência mais alta do material da amostra e a interacção total é mais elástica (a força se realiza na fase com recorte, não velocidade). No general é o melhor ficar consistente neste parâmetro para ter as mesmas condições iniciais para cada experiência. Mas não se deve esquecer que cada tipo do material ou da pilha tem seu próprio tempo de abrandamento desde que podem variar extremamente em sua composição (tamanho do núcleo, da composição do cytoskeleton Etc.).

Figura 3. curva da distância da Força tomada em uma pilha viva de CHO (velocidade 5 µm/s da varredura). Siga (vermelho) e reconstituir (obscuridade - vermelho) da curva a histerese da mostra claramente devido ao comportamento viscoso e plástico da pilha.

A Heterogeneidade da amostra igualmente pode conduzir aos produtos manufacturados como a variação do módulo Young segundo a profundidade do recorte, isto é segundo a camada ou o componente o indenter está pressionando realmente dentro. As Pilhas têm os vários componentes (como o glycocalix, as extensões da membrana, o núcleo, ou os organelles) que podem reflectir a rigidez diferente. O ponto de contacto igualmente está sofrendo destas variações e interacções da ponta de prova e a superfície ou as moléculas da amostra que estão cobrindo a superfície. Tais curvas mostram frequentemente um ponto de contacto muito raso onde E seja calculado para ser mais macio do que a amostra estão realmente. A rigidez “real” da amostra é medida assim somente quando a ponta de prova alcança a superfície apropriada que é após a parte rasa da curva. Então o ajuste não combina o ponto de contacto da Força-recorte-Curva (figura 4). Mas isto não é surpreendente desde que o modelo de Hertz supor a homogeneidade da amostra e de nenhumas interacções entre a amostra e a ponta de prova. Finalmente, é sempre importante focalizar da parte da curva que representa a estrutura que você quer investigar.

Figura 4. Força contra as curvas do recorte derivadas de uma pilha, cabida com o modelo de Hertz. O mesmos curvam-se foram cabidos primeiramente a um recorte de 200 nanômetro (parte superior), e em segundo sobre a escala inteira do recorte de 400 nanômetro (parte inferior). Obviamente a ponta de prova empurrou com duas camadas diferentes desde que o ponto de contacto cabido da primeira curva é diferente do ponto de contacto da segunda curva. O módulo de E da primeira curva, descrevendo a rigidez da superfície da pilha, é aproximadamente 16 o kPa, essa da segunda curva, que pode ser supor para ser módulo do te E do citoplasma, o kPa aproximadamente 35.

Escala Apta

Igualmente importante é encontrar a escala do ajuste que deve ser usada para render resultados os melhores e reprodutíveis para cálculos da elasticidade. Como descrito na secção acima de E flutua fortemente em recortes muito baixos em torno do ponto de contacto mas alcances um platô com o recorte crescente finalmente ao aumento outra vez, principalmente em conseqüência da rigidez da carcaça (a placa de vidro Etc., considera figura 5, parte inferior). Assim a altura da estrutura recortada deve fortemente ser considerada. O modelo de Hertz é somente válido para recortes pequenos (diga até 5-10% da altura da pilha, talvez 200-500 nanômetro) onde a carcaça não influencia os cálculos e onde a geometria do recorte combina a geometria do indenter. Como descrito na secção de Hertz acima, a melhor maneira de encontrar a escala a melhor é gravar uma curva da distância da força com o recorte relativamente alto e caber E para cada ponto da curva correspondente do recorte da força. O Traço E sobre o recorte revela o recorte quando E começa tender para um valor constante que deva ser usado para determinar o módulo Young (figura 5, média).

Mas pode acontecer que não há nenhum platô óbvio, especialmente ao recortar amostras inhomogeneous. Se uma pilha por exemplo está testada certo acima do núcleo usando um indenter relativamente pequeno (por exemplo uma pirâmide), o núcleo pode deslizar longe sob da ponta de prova e o resultado é uma diminuição do módulo medido right after o núcleo foi empurrado pela ponta de prova (figura 5, parte superior).

Figura 5. E contra curvas do recorte de uma pilha de CHO sondada com um indenter piramidal em regiões diferentes: direito acima do núcleo (parte superior), da região ao lado do núcleo (médio) e aproxime a borda da pilha (parte inferior). Testar certo acima do núcleo (parte superior) aqui somente denotou transiente a rigidez do núcleo. O núcleo foi empurrado Obviamente então afastado tendo por resultado a diminuição de E. Sondagem um recorte revelado (médio) relativamente homogéneo da região mesmo do citoplasma que começa ao redor de 250 nanômetro. O Recorte da borda da pilha (parte inferior) conduz a um segundo, aumento dependente da carcaça de E que começa em recortes relativamente baixos.

Todas As três curvas de figura 5 se derivam da mesma pilha e foram tomadas com a mesma ponta de prova sob exactamente as mesmas circunstâncias. Mesmo que haja “em segundo” um aumento não óbvio em E e assim na sugestão não óbvia ou típica de um efeito da carcaça de vidro para ambos E superior contra curvas do recorte, o aumento da rigidez aparente do centro de pilha à borda indica uma influência da carcaça. Mas este não é surpreendente desde que a altura da pilha no núcleo foi medida para ser o µm ao redor 5, no cerco do núcleo ser o µm ao redor 1,3 e na borda em torno de 0,5 µm. Finalmente estes resultados mostram que o efeito da carcaça é não somente visível por um aumento de E dentro de E contra curvas do recorte mas igualmente aumentando valores de E em umas regiões mais finas das pilhas.

Selecção da Ponta De Prova

Que modilhão deve ser usado depende da rigidez da amostra. Em geral um pode manter-se na mente que a rigidez do modilhão deve ser em torno da escala da rigidez da amostra. Para as pilhas de que são muito macios e delicados os modilhões os mais macios disponíveis com constantes da mola ao redor 10-30 mN/m devem ser usados. Para umas amostras mais duras como umas constantes mais altas da mola dos geles do agarose (30-100 mN/m ou mais) seja apropriado.

Um Outro ponto a considerar é a escolha da forma do indenter. Para amostras biológicas macias recomenda-se usar pontas de prova esféricas desde que a força é aplicada a uma área mais larga da amostra do que seja o caso se uma ponta piramidal ou cónica afiada é usada, que conduza a uma pressão mais baixa. Esta penetração da maneira da amostra é impedida. Mas esta não é a única razão preferir indenters esféricos. As Pilhas ou os tecidos são muito inhomogeneous, consistindo em componentes diferentes (núcleo, componentes cytoskeletal, organelles…). Para render uma impressão geral para tais indenters relativamente grandes inhomogeneous dos materiais como 20 grânulos do µm seja útil.

Para render mais de alta resolução, por exemplo às únicas pilhas do teste ou às peças diferentes da pilha, ou aumentar a pressão recortar uns grânulos mais duros dos materiais de diâmetros menores podem ser usados (µm 1-10, segundo a definição desejada). As Esferas não são sempre a melhor solução. Se a amostra é de dimensões muito pequenas ou se diferente as áreas devem ser testado em mais de alta resolução (mais altamente de um mícron) as pontas piramidais do nitreto de silicone podem ser uma alternativa. Uma desvantagem do tal pontas mais ou menos afiadas é naturalmente essa elas pode penetrar a amostra e assim conduzi-la aos cálculos imprecisos do módulo Young (geralmente uma diminuição da rigidez).

Mas por outro lado são impedidos menos por estruturas como extensões celulares ou por resíduos que estendem do glycocalix do que as esferas são. Os indenters Esféricos sentem frequentemente tais extensões, e o resultado é um ponto de contacto muito raso que seja extremamente difícil de determinar (que é igualmente a razão pela qual deve ser cabido). Um problema mais geral que ocorra com pilhas é curvas distorcidas da força, indicadas na maior parte porque um “ombro” na região do contacto (Fig. 6). Estas distorções podem derivar-se do contacto com estruturas pequenas como as fibras de esforço ou as extensões membranosos, que deslizam então longe da ponta de prova, conduzindo a um segundo ponto de contacto.

A Figura 6. Distorted estende a curva tomada em uma pilha de CHO usando um indenter esférico de 2 µm.

Exemplo de uma Experiência do Recorte

Neste exemplo os trabalhos para derivar o módulo Young de pilhas de vida de CHO são descritos. O CellHesion® 200, montado em um microscópio óptico de Zeiss (AxioObserver), foi usado para preparar a ponta de prova esférica que estava indo ser usada assim como para executar experiências do recorte O CellHesion® 200 é um dispositivo baseado AFM novo, desenvolvido exclusivamente para encontrar as necessidades de testar a adesão celular e os mecânicos. Um PetriDishHeater™ foi usado como um suporte da amostra desde que as pilhas foram crescidas em pratos de WPI petri. As pilhas foram mantidas sob circunstâncias fisiológicos durante a experiência inteira (37°C, media protegido HEPES).

Preparação da Ponta De Prova

Os indenters Esféricos podem ou ser comprados dos fornecedores especiais como pontas de prova da partícula de Novascan (0.6-25 esferas de vidro do µm anexadas aos modilhões), ou podem ser caseiros colando esferas em modilhões. Para tal modilhão tipless da finalidade é o poço - serido. Deve ser tomado se os modilhões com pontas são usados, especialmente se as esferas pequenas são anexadas. Isto é porque a esfera anexará ao lado da ponta, um pouco do que na extremidade, de modo que a ponta ainda tenha um impacto na experiência, especialmente se o diâmetro escolhido da esfera é menos do que a altura de ponta. Os modilhões do Silicone têm pontas do µm até ao redor 15. Assim os modilhões tipless seriam melhor escolha ou pelo menos modilhões do nitreto de silicone que têm umas pontas mais curtos (µm até 5).

Para este exemplo um modilhão tipless (a Seta TL1, NanoWorld, k = 0,03 N/m) com uma esfera anexada do silicone (µm do diâmetro 11) foi usada como a ponta de prova do recorte (Fig. 7). Os grânulos do silicone foram anexados ao modilhão com uma cola Epoxy bipartido, mas a outros adesivos biocompatible como o adesivo óptico é igualmente bom - serido. Isto pode facilmente ser feito preparando uma corrediça do microscópio onde as esferas sejam depositadas em de uma parte e na cola Epoxy em uma Divisória adjacente. Se os grânulos são suspendidos no líquido, uma gota está posta sobre a corrediça e secada. Um par de pinça limpa pode igualmente ser usado para transferir grânulos secos na corrediça, ou para espalhar a solução do grânulo. Uma pequena quantidade da cola Epoxy é espalhada Então muito fina perto dos grânulos usando uma ponta da lâmina ou da pipeta.

Figura 7. modilhão de Tipless com uma esfera de 11 mícrons anexada

O modilhão deve primeiramente ser mergulhado na cola Epoxy. Uma aproximação é feita em uma região limpa de vidro para encontrar a superfície. A ponta do modilhão é posicionada Então sobre a borda da correcção de programa da cola Epoxy usando os parafusos de posicionamento e uma medida da espectroscopia da força é executada para mergulhar a ponta na colagem. Um setpoint de ao redor 0,5 a 1 V deve ser suficiente. Se há demasiada colagem na ponta pode fluir sobre o grânulo e encaixá-lo. Para impedir isto, umas ou várias medidas adicionais da espectroscopia devem ser executadas em uma área de vidro limpa. Isto removerá a colagem adicional. Finalmente, para anexar uma esfera, uma outra curva da força é executada com a ponta posicionada sobre uma esfera.

Executando Experiências do Recorte

A ponta de prova da microsfera foi montada e alinhada como de costume na cabeça do AFM. O prato de WPI petri que contem pilhas aderentes de CHO foi montado ao calefator do prato de petri e a temperatura foi ajustada a 37°C. O modilhão foi calibrado então, isto é o determinado constante da mola para poder especificar exactamente a força a ser aplicada à amostra. Usando o NanoWizard® ou o CellHesion200® o gerente da calibração do software de JPK SPM conduz o usuário com o processo da calibração, calculando a sensibilidade cabendo uma curva da força (tomada em uma carcaça dura) dentro da peça linear do contacto e determinando a mola constante com o método térmico do ruído. Uma Vez Que a calibração está completa, a força setpoint desejada pode ser incorporada aos Newtons (geralmente pico- ou nano-Newtons). Agora a experiência podia ser começada.

As curvas da distância da Força foram tomadas directamente acima do núcleo de pilhas diferentes. Os setpoints Relativamente altos foram usados (nN até 4) desde que as propriedades mecânicas destas pilhas eram desconhecidas. A extensão/retrai a velocidade foi ajustada a 5 µm/s e o laço fechado foi usado.

de processo de dados

O software do IP de JPK dá a possibilidade para derivar o módulo Young das curvas da força que são executado com diversas etapas (Fig. 8). Todas As operações têm que ser aplicadas à curva do alargamento desde ela (normalmente ou pelo menos no líquido) não contêm nenhuma interacção como adesão que faz uma determinação do ponto de contacto impossível. A primeira etapa do processamento é remover todo o offset ou incliná-la da curva e encontrar o ponto de contacto. Conseqüentemente as opções “Subtraem a linha de base” e do “o ponto de contacto Achado” deve ser seleccionada. Não é essencial determinar exactamente o ponto de contacto ou a linha de base deslocou aqui desde que são parâmetros variáveis do ajuste e não têm nenhuma influência nos resultados do ajuste. Toda A inclinação deve ser removida da linha de base desde que esta não é parte de Hertz coube. O passo seguinte está “a uma altura Correcta para o modilhão que dobra-se”, uma característica que calcule a profundidade do recorte tomando a diferença entre o movimento piezo e a deflexão vertical do modilhão nas unidades de comprimento. Agora as curvas um pronto para ser cabido com o modelo de Hertz para derivar o módulo Young. Outros valores, tais como de “o ponto contacto cabido” e o parâmetro “RMS residual” da qualidade do ajuste são indicados igualmente.

Figura 8. Operações para derivar o módulo Young de uma curva da força. A primeira etapa é remover todo o offset ou incliná-la da linha de base e encontrar o ponto de contacto. A fim aperfeiçoar a determinação do ponto de contacto a curva pode ser alisada. A etapa seguinte e crucial é subtrair o modilhão que dobra-se do movimento piezo para render o recorte, isto é um canal novo chamado separação da amostra da ponta é criado. Finalmente o modelo de Hertz pode ser aplicado. A geometria do indenter deve ser especificada assim como a relação de Poisson (de que pode ser deixado em 0,5 para amostras biológicas) e a escala de dados a ser cabida.

Se muitas curvas foram gravadas há a possibilidade para usar o processamento de grupo onde todas as operações descritas podem ser aplicadas a um grupo de curvas (dentro de um dobrador).

Antes de processar de grupo, é útil examinar com maiores detalhes algumas curvas para encontrar a escala óptima do ajuste que pode então ser aplicada a todas as curvas. Conseqüentemente a escala do ajuste deve ser aumentada por etapas até que o módulo de E tender para um valor constante. Em figura 9 o módulo Young derivado de uma pilha de CHO é traçado na dependência no recorte. Aqui começos de E para tomar valores constantes ao redor de 700-800 nanômetro da profundidade do recorte. Se examinando uma disposição de curvas, usando o processamento de grupo, este valor deve ser usado para a escala do ajuste. Naturalmente a qualidade do ajuste deve sempre ser verificada olhando directamente nas curvas ou comparando o RMS residual que é escrito igualmente para baixo na lima dos resultados que é gerada ao usar o processamento de grupo.

Figura 9. E contra a curva do recorte de uma pilha de CHO. Ao redor de 700 Nível E do recorte do nanômetro a uma escala constante (Pa ao redor 450).

Testando o Sistema

O módulo Young é usado frequentemente descrever propriedades mecânicas das pilhas e das outras amostras. Em muitos casos a intenção fazer tais experiências é comparar os resultados com outros dados, produzidos por outros pesquisadores. Pentear através da literatura uma encontra sempre discrepâncias entre os valores de E de experiências similares mas executados usando dispositivos diferentes. Para avaliar como o sistema trabalha mas ganhar igualmente um sentimento para a técnica e a manipulação dela é frequentemente úteis começar com uma amostra onde a elasticidade seja descrita já com um sistema similar. Os Geles dos polímeros como o álcool do agarose ou de polyvinyl são as amostras welldescribed que são usadas frequentemente descrever princípios de medidas da elasticidade.

Para testar o sistema em que a pilha experimenta foram executados uns 2,5% o gel do agarose que foi recortado usando uma ponta de prova esférica de 11 µm. Desde Que os geles do agarose nesta concentração são mais duros do que pilhas, umas pontas de prova mais duras têm que ser usadas, por exemplo com constantes da mola de 0.5-5 N/m. Neste exemplo um modilhão de NSC do mikromasch (4 N/m) foram usados. O E correspondente contra a curva do recorte é mostrado em figura 10 que indica um E final do kPa ao redor 36. Este valor concorda bem com a literatura (figura 1).

Figura 10. E contra a curva do recorte calculada para uma curva da distância da força tomada em um gel do agarose de 2,5% usando uma ponta de prova esférica de 11 µm com uma constante da mola de 4 N/m. O E final é o kPa ao redor 36

Conclusão

Apesar de algumas limitações o modelo de Hertz é um método útil e de uso geral expressar propriedades mecânicas de amostras biológicas como pilhas. Há algumas edições que devem ser mantidas na mente tal como a escala do ajuste ou a composição da amostra. As amostras Biológicas indicam frequentemente o comportamento viscoelastic e são inhomogeneous, isto é consistem em “materiais diferentes” com propriedades elásticas diferentes. Para conhecê-lo exactamente que o componente é descrito exactamente pelos resultados é o mais importante tornar-se familiar com a amostra e ajustar adequadamente os parâmetros.

Considerando Que todas estas edições ajudarão a render resultados razoáveis e reprodutíveis.

Os JPK NanoWizard®II ou os CellHesion®200 em combinação com suportes dedicados da amostra, como o PetriDishHeater™ ou o BioCell™, fornecem os meios obter dados da elasticidade (entre numeroso outros tipos de dados) para amostras biológicas. Adicionalmente o software do IP de JPK ajuda o usuário com todas as etapas a preparar as curvas adquiridas para Hertz que processa e fornece uma calculadora fácil de usar para o módulo Young.

Source: Instrumentos de JPK

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Instrumentos de JPK

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:20

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