Используя Атомную Микроскопию Усилия для того чтобы Определить Эластичные Свойства Биологических Образцов Аппаратурами JPK

Покрытые Темы

Введение
Герци Моделируют
Вопросы, котор нужно Рассматривать
Свойства Образца
Подходящий Ряд
Выбор Зонда
Пример Эксперимента По Вмятия
Подготовка Зонда
Выполнять Эксперименты По Вмятия
Преобразование Данных
Испытывать Систему
Заключение

Введение

Используя атомное усилие микроскоп (AFM) для nanoindentation вытек по мере того как полезный инструмент для того чтобы определить эластичные свойства любит модуль пластичности для биологических образцов (диаграммы 1). Cantilevers служят как мягкие nanoindenters позволяющ местный испытанию малых и негомогенных образцов как клетки или ткани. Для того чтобы высчитать параметр моделей интереса различных используйте, но большое часть из их основана на модели Герцей и расширена для того чтобы соответствовать экспириментально условиям относительно формы или толщины индентеров образца.

Диаграмма 1. Обзор Young модуля для различных биологических материалов

Анализ Nanomechanical клеток будет все больше и больше важным в различных полях как рак и отработочная биология. Были найдены Разницы в жесткости нормального и наклеветанных клеток и также изменение в metastatic потенциале с уменьшать клетчатую жесткость можно маркировать. Определять напряжение коркы клетки progenitors слоя семенозачатка zebrafish показал разницы в жесткости ecto, meso и endodermal клеток progenitor. Другой пример от поля отработочной биологии механически испытание субстратов роста. Это применение показало важную роль упругости матрицы для спецификации происхождения клетки. Не только клетки но также компоненты их внеклеточной окружающей среды, как волоконца коллагена были испытаны для их механически свойств [17]. Потенциал этой методологии широко использован в биологическом и также другие дисциплины для того чтобы описать эластичные свойства различных матриц и материалов.

Этот рапорт описывает применение и прием экспериментов по упругости используя метод AFM. Дается обзор наиболее обыкновенно используемой модели, модель Герцей и ограничения предположений и приводить к для пользы с биологическими образцами обсужены подробно.

Герци Моделируют

Модель Герцей приближается образец как равносвойственное и линейное эластичное твердое тело занимая инфинитно удлиняя половинный космос. Furthermore предположено индентер не deformable и что никакие дополнительные взаимодействия между индентером и образцом. Если эти условия соотвествованы, то Young модуль (E) образца можно приспосабливать или высчитать используя Hertzian модель. Несколько параметров описывая свойства зонда образца и вмятия должны быть определены.

Диаграмма 2. Верхняя Часть - Эскиз эксперимента по вмятия. Cantilever приближен к образец расстоянием z ((измеренной) высотой). Cantilever гнет в противоположное направление (x) пока образец выделен ä. Окончательно ä высчитано путем вычитать консольное отклонение от (измеренной) высоты. Дно - Схема коррекции высоты для консольного (x) для того чтобы вывести подсказк-образц-разъединение (кривый вмятия усилия).

Данные полученные измерениями вмятия (режимом спектроскопии усилия) обычно графики усилия против piezo смещения, вернее чем наклоняют разъединение образца. Для того чтобы приложить модель Герцей, кривым нужно быть преобразованным как объяснено в диаграмме 2.

Модель Герцей принимает вмятие для того чтобы быть neglectable по сравнению с толщиной образца, таким образом глубина вмятия должна быть оптимизирована. Модель Герцей действительна для малых вмятий (скажите до 5-10% из высоты клетки, возможно 200-500 nm) где субстрат не влияет на вычисления. Могут быть дополнительные ограничения в глубине вмятия если модель формы подсказки приближение. Часто параболистическая модель использована если индентер сфера, то потому что легке приспосабливать и приближение разумно для малых вмятий. ПО IP JPK предлагает автоматический штуцер для всех форм индентера показанных здесь, настолько там больше не любой потребности сделать это приближение.

Вопросы, котор нужно Рассматривать

Модель Герцей делает несколько предположений которые поистине не встрещены если расмотрены клетки или другие биологические образцы.

В этом разделе обсужены эти отступления и как сделать самые надежные измерения.

Свойства Образца

Модель Герцей принимает абсолютные эластичные поведение так же, как гомогенность образца. Но большинств биологические материалы ни однотиповы ни совершенно эластичны. Энергия поставленная индентером вполне не дается назад клеткой (по мере того как она была бы сделана абсолютным эластичным материалом) но рассеивает вследствие вязкостного и пластичного поведения которое также появляется по мере того как гистерезис между удлинять и частью втягивать усилия изгибает (FIG. 3). Изменчивость вязкостного поведения будет видимой если различные скорости вмятия испытаны. Высоко тариф нагрузки, мало вмятие и более высоко ясная жесткость. Масштаб времени описывая это поведение время релаксации и различн для каждого вязкостного/вязко-эластического материала. Используя скорости около времени релаксации приведет к в более низких усилиях, потому что материал клетки имеет время двинуть далеко от выделяя зонда. Более Высокие скорости приводят к в высокоомном материала образца и общее взаимодействие эластичне (усилие в участке с вмятием, не скоростью). Вообще самое лучшее остаться, что последовательным в этом параметре имело такие же начальные условия для каждого опыта. Но оно не должен быть забыт что каждый тип материала или клетки имеет свое собственное время релаксации в виду того что они могут поменять значительно в их составе (размере ядра, состава цитоскелета Etc.).

Диаграмма 3. принятая кривый расстояния Усилия на живущей клетке CHO (скорости 5 µm/s развертки). Трассируйте (красный цвет) и retrace (темнота - красный цвет) кривого гистерезис выставки ясно вследствие вязкостного и пластичного поведения клетки.

Inhomogeneity образца также может привести к в артефактах как изменение Young модуля в зависимости от глубины вмятия, т.е. в зависимости от слоя или компонента индентер фактически отжимает внутри. Клетки имеют различные компоненты (как glycocalix, выдвижения мембраны, ядро, или органеллы) которые могут отразить различную жесткость. Точка соприкосновения также терпит от этих изменений и взаимодействий зонда и поверхности или молекул образца которые покрывают поверхность. Такие кривые часто показывают очень отмелую точку соприкосновения где высчитаны, что будет E мягке чем образец действительно. «Реальная» жесткость образца таким образом только измерена когда зонд достигает правильную поверхность которая после отмелой части кривого. После Этого пригонка не соответствует точке соприкосновения Усили-вмяти-Кривого (диаграммы 4). Да ведь это не удивительно в виду того что модель Герцей принимает гомогенность образца и никаких взаимодействий между образцом и зондом. Окончательно, всегда важно сфокусировать на части кривого которая представляет структуру вы хотите расследовать.

Диаграмма 4. Усилие против кривых вмятия выведенных от клетки, приспособленной с моделью Герцей. Эти же изгибают сперва были приспособлены к вмятию 200 nm (верхняя часть), и во-вторых над всем рядом вмятия 400 nm (дно). Очевидно зонд нажал через 2 различных слоя в виду того что приспособленная точка соприкосновения первой кривого отличал точка соприкосновения второй кривого. Модуль E первой кривого, описывая жесткость поверхности клетки, около 16 kPa, одна из второй кривого, которая можно принять, что была модулем te E цитоплазмы, kPa около 35.

Подходящий Ряд

Также важен найти ряд пригонки который быть использованным произвести оптимальные и возпроизводимые результаты для вычислений упругости. Как описано в разделом над E сильно изменяет на очень низких вмятиях вокруг точки соприкосновения но достигаемости плато 0Nс увеличением вмятием окончательно, котор нужно увеличивать снова, главным образом в результате жесткости субстрата (стеклянная вставка Etc., видит диаграмму 5, дно). Таким Образом высота выделенной структуры сильно быть рассмотренным. Модель Герцей только действительна для малых вмятий (скажите до 5-10% из высоты клетки, возможно 200-500 nm) где субстрат не влияет на вычисления и где геометрия вмятия соответствует геометрии индентера. Как описано в разделом Герцей выше, самый лучший путь найти оптимальный ряд записать кривый расстояния усилия с относительно высоким вмятием и приспосабливать E для каждого пункта соответствуя кривого вмятия усилия. Prokladkа Kursa E над вмятием показывает вмятие когда E начинает клонить к величине постоянной которая должна быть использована для того чтобы определить Young модуль (диаграмму 5, средние).

Но она может случиться что никакое очевидное плато, специально выделяя негомогенные образцы. Если клетка например испытана справедливо над ядром используя относительно малый индентер (например пирамидку), то ядро может сместить далеко от под зонда и результат уменшение измеренного модуля прямо после ядро было нажато зондом (диаграммой 5, верхняя часть).

Диаграмма 5. E против кривых вмятия клетки CHO, котор зондируют с pyramidal индентером на различных зонах: право над ядром (верхней частью), зоной рядом с ядром (средним) и приблизьте к краю клетки (дна). Испытывать справедливо над ядром (верхней частью) здесь только преходяще обозначил жесткость ядра. Очевидно ядро было после этого нажатый прочь приводить к в уменшении E. Зондировать относительно однородное вмятие зоны (среднее) показанное даже цитоплазмы начиная в пределах 250 nm. Вмятие края клетки (дна) водит к секунде, увеличению субстрата зависимому E начиная на относительно низких вмятиях.

Все 3 кривого диаграммы 5 выводят от такой же клетки и были приняты с таким же зондом под условиями точного такой. Даже если не очевидное «во-вторых» увеличение в E и таким образом не очевидном или типичном намеке влияния стеклянного субстрата для обоих верхний E против кривых вмятия, увеличение ясной жесткости от центра клетки к краю показывает влияние субстрата. Да ведь это не удивительно в виду того что высота клетки на ядре была измерена для того чтобы быть µm вокруг 5, на окружать ядра, котор нужно быть µm вокруг 1,3 и на крае вокруг 0,5 µm. Окончательно эти результаты показывают что влияние субстрата не только видимо увеличением E в пределах E против кривых вмятия но также путем увеличивать значения E на более тонких зонах клеток.

Выбор Зонда

Который cantilever должен быть используемыми быть в зависимости от жесткость образца. Как правило одно может держать в разуме что жесткость cantilever должна быть вокруг ряда жесткости образца. Для клеток которых очень мягки и чувствительны самые мягкие cantilevers доступные с константами весны вокруг 10-30 mN/m должно быть использовано. Для более жестких образцов как константы весны гелей агарозы более высокие (30-100 mN/m или больше) соотвествующий.

Другой пункт, котор нужно рассматривать выбор формы индентера. Для мягких биологических образцов порекомендованы, что использует сферически зонды в виду того что усилие прикладной к более широкой зоне образца чем был случаем если использована острая pyramidal или коническая подсказка, то которая приводит к в более низком давлении. Это проникание путя образца предотвращено. Да ведь это не единственная причина предпочитать сферически индентеры. Клетки или ткани очень негомогенны, состоящ из различных компонентов (ядра, цитоскелетных компонентов, органелл…). Для того чтобы произвести общее впечатление для таких негомогенных индентеров материалов относительно больших как 20 шариков µm полезна.

Произвести более высокое разрешение, например к клеткам испытания одиночным или различным частям клетки, или увеличить давление выделить более жесткие шарики материалов более малых диаметров можно использовать (µm 1-10, в зависимости от пожеланного разрешения). Сферы нет всегда самого лучшего разрешения. Если образец очень малых размеров или если различно зоны быть испытанным в более высоком разрешении, то (больше чем единица микроне) pyramidal подсказки нитрида кремния могут быть алтернативой. Недостаток такого больше или более менее острые подсказки конечно тот они может прорезать образец и таким образом вести к неточным расчетам Young модуля (вообще уменшения жесткости).

Но с другой стороны их более менее мешают структурами как клетчатые выдвижения или выпарками удлиняя от glycocalix чем сферы. Сферически индентеры часто чувствуют такие выдвижения, и результат очень отмелая точка соприкосновения которая весьма трудна для того чтобы определить (который также причина почему оно должно быть приспособлено). Более общая проблема которая происходит с клетками передернутые главным образом показанные кривые усилия, по мере того как «плечо» в зоне контакта (FIG. 6). Эти искажения могут вывести от контакта с малыми структурами как волокна усилия или membranous выдвижения, которые после этого смещают далеко от зонда, водя к второй точке соприкосновения.

Диаграмма 6. Distorted удлиняет кривый принятую на клетку CHO используя индентер 2 µm сферически.

Пример Эксперимента По Вмятия

В этом примере описан поток операций для того чтобы вывести Young модуль живя клеток CHO. CellHesion® 200, установленное на микроскопе Zeiss оптически (AxioObserver), было использовано для того чтобы подготовить сферически зонд который шел быть использованным так же, как выполнить эксперименты по вмятия CellHesion® 200 новый прибор основанный AFM, исключительно развитый для того чтобы отвечать потребностямы испытывать клетчатое прилипание и механиков. PetriDishHeater™ было использовано как держатель образца в виду того что клетки рослись на чашка Петри WPI. Клетки были сдержаны под физиологопсихологическими условиями во время всего эксперимента (37°C, средства амортизированного HEPES).

Подготовка Зонда

Сферически индентеры можно или закупить от специальных провайдеров как зонды частицы от Novascan (0.6-25 сфер µm стеклянных прикрепленных к cantilevers), или они могут быть домодельны путем клеить сферы на cantilevers. Для такого cantilever цели tipless одетый колоец -. Необходимо позаботиться если cantilevers с подсказками использованы, то специально если малые сферы прикреплены. Это потому что сфера прикрепится к стороне подсказки, вернее чем на конце, так как подсказка все еще будет иметь удар на эксперименте, специально если выбранный диаметр сферы чем высота подсказки. Cantilevers Кремния имеют подсказки µm до вокруг 15. Таким Образом tipless cantilevers были бы более лучшими cantilevers нитрида выбора или хотя бы кремния которые имеют более короткие подсказки (µm до 5).

Для этого примера tipless cantilever (Стрелка TL1, NanoWorld, k = 0,03 N/m) с прикрепленной сферой кремнезема (µm диаметра 11) был использован как зонд вмятия (FIG. 7). Шарики кремнезема были прикреплены к cantilever с двухраздельной эпоксидной смолой, но другим biocompatible прилипателям как оптически прилипатель также хорош - одето. Это может легко быть сделано путем подготовлять скольжение микроскопа где сферы депозированы на одной части и эпоксидной смоле на смежной части. Если шарики ы в жидкости, то падение положено на скольжение и высушено. Пару чистых щипчиков можно также использовать для того чтобы перенести сухие шарики на скольжение, или распространить разрешение шарика. После Этого небольшое количество эпоксидной смолы распространено очень тонко около шариков используя подсказку лезвия или пипетки.

Диаграмма 7. cantilever Tipless при прикрепленная сфера 11 микрона

Cantilever необходимо сперва окунуть в эпоксидную смолу. Подход сделан на чистой зоне стекла для того чтобы найти поверхность. После Этого консольная подсказка расположена над краем заплаты эпоксидной смолы используя располагая винты и измерение спектроскопии усилия работается для того чтобы окунуть подсказку в клей. Setpoint вокруг 0,5 до 1 V должно быть достаточно. Если там, то слишком много крепило на клею подсказка оно может пропустить над шариком и врезать его. Для того чтобы предотвратить это, одни или больше дополнительные измерения спектроскопии должны быть выполнены на чистой стеклянной области. Это извлекает сверхнормальный клей. Окончательно, прикрепить сферу, другая кривый усилия работается при подсказка расположенная над сферой.

Выполнять Эксперименты По Вмятия

Зонд микросферы был установлен и выровнял как обычно на головке AFM. Чашка Петри WPI содержа адэрентные клетки CHO было установлено к подогревателю чашка Петри и температура была установлена к 37°C. Cantilever после этого был откалибрирован, т.е. решительно весны постоянн для того чтобы мочь точно определить усилие для того чтобы быть прикладной к образцу. Используя NanoWizard® или CellHesion200® менеджер тарировки ПО JPK SPM водит пользователя через процесс тарировки, высчитывая чувствительность путем приспособление кривого усилия (принятой на трудный субстрат) внутри линейная часть контакта и определять весну постоянн с термальным методом шума. Как Только тарировка закончена, пожеланное setpoint усилие можно вписать в Ньютоны (обычно pico- или nano-Ньютоны). Теперь эксперимент смог быть начат.

Кривые расстояния Усилия были приняты сразу над ядром различных клеток. Относительно высокие setpoints были использованы (nN до 4) в виду того что механически свойства этих клеток были неизвестны. Выдвижение/втягивает скорость было установлено до 5 µm/s и короткозамкнутый виток был использован.

введенно информачи

ПО IP JPK дает возможность для того чтобы вывести Young модуль от кривых усилия работая через несколько шагов (FIG. 8). Все деятельности должны быть прикладной к кривому удлинять с ее (нормально или хотя бы в жидкости) не содержат никакие взаимодействия как прилипание которые делают определение точки соприкосновения невозможным. Первый шаг обрабатывать извлечь любое смещение или опрокинуть от кривого и найти точку соприкосновения. Поэтому варианты «Вычитают базис» и «точка соприкосновения Находки» быть выбранным. Не необходимо определить точно точку соприкосновения или базис возместил здесь в виду того что они переменные параметры пригонки и не имеют никакое влияние на результатах пригонки. Любой наклон следует извлечь от базиса в виду того что это нет части пригонки Герцей. Следующий шаг «Правильная высота для cantilever», характеристика которая высчитывает глубину вмятия путем принимать разницу между piezo движением и консольным вертикальным отклонением в блоках длины. Теперь кривые готовое быть приспособленным с моделью Герцей для того чтобы вывести Young модуль. Другие значения, как приспособленная «точка соприкосновения» и параметр «остаточный RMS» качества пригонки также показаны.

Диаграмма 8. Деятельности для того чтобы вывести Young модуль от кривого усилия. Первый шаг извлечь любое смещение или опрокинуть от базиса и найти точку соприкосновения. Для того чтобы оптимизировать определение точки соприкосновения кривый можно приглаживать. Следующий и критический шаг вичесть консольный гнуть от piezo движения для того чтобы произвести вмятие, т.е. создан новый вызванный канал разъединением образца подсказки. Окончательно модель Герцей может быть прикладной. Геометрия индентера быть определенным так же, как коэффициент Poisson (который можно выйти на 0,5 для биологических образцов) и ряд данных, котор нужно приспосабливать.

Если много кривых были записаны, то возможность для использования пакетной обработки где все описанные деятельности могут быть прикладной к серии кривых (внутри один скоросшиватель).

Перед пакетной обработкой, полезно рассмотреть немного кривых более подробно для того чтобы найти оптимальный ряд пригонки который может после этого быть прикладной к всем кривым. Поэтому ряд пригонки должен быть увеличен stepwise до модуль E клонит к величине постоянной. В диаграмме 9 Young модуль выведенный от клетки CHO прокладывать курс в зависимости на вмятии. Здесь E начинает принять величины постоянные в пределах 700-800 nm из глубины вмятия. Если рассматривающ блок кривых, используя пакетную обработку, это значение должно быть использовано для ряда пригонки. Конечно качество пригонки должно всегда быть проверено или смотреть сразу на кривых или путем сравнивать остаточный RMS который также написан вниз в архиве результатов который произведен при использовании пакетной обработки.

Диаграмма 9. E против кривого вмятия клетки CHO. В пределах 700 уровней вмятия E nm к постоянн ряду (PA вокруг 450).

Испытывать Систему

Young модуль часто использован для того чтобы описать механически свойства клеток и других образцов. В много случаев намерие сделать такие эксперименты сравнить результаты при другие данные, произведенные другими исследователями. Расчесывать до словесность одно всегда находит несоответствия между значениями E подобных экспериментов но выполненными используя различные приборы. Оценить как система работает но также приобрести ощупывание для метода и регулировать его часто полезны для того чтобы начать с образцом где упругость уже была описана с подобной системой. Гели полимеров как агароза или поливинилалкоголь welldescribed образцы которые часто использованы для того чтобы описать принципы измерений упругости.

Для того чтобы испытать систему на которой клетка экспериментирует выполнил 2,5% гель агарозы был выделен используя зонд 11 µm сферически. В Виду Того Что гели агарозы в этой концентрации жестке чем клетки, более жесткие зонды должны быть использованы, например с константами весны 0.5-5 N/m. В этом примере был использован cantilever NSC от mikromasch (4 N/m). Соответствуя E против кривого вмятия показан в диаграмме 10 показывая окончательный E kPa вокруг 36. Это значение соглашается хорошо с словесностью (диаграммой 1).

Диаграмма 10. E против кривого вмятия высчитанной для кривого расстояния усилия принятой на геле агарозы 2,5% используя зонд 11 µm сферически с константой весны 4 N/m. Окончательный E kPa вокруг 36

Заключение

Несмотря на некоторые ограничения модель Герцей полезный и обыкновенно используемый метод для того чтобы выразить механически свойства биологических образцов как клетки. Некоторые вопросы которые должны быть сдержаны в разуме как ряд пригонки или состав образца. Биологические образцы часто показывают вязко-эластическое поведение и они негомогенны, т.е. состоят из различных «материалов» с различными эластичными свойствами. Знать точно которые компоненту точно описывают результатами его самый важный для того чтобы стать acquainted с образцом и адекватно отрегулировать параметрами.

Учитывая все эти вопросы помогут произвести разумные и возпроизводимые результаты.

JPK NanoWizard®II или CellHesion®200 в комбинации с преданными держателями образца, как PetriDishHeater™ или BioCell™, обеспечивают середины получить данные по упругости (среди многочисленного другие типы данных) для биологических образцов. Дополнительно ПО IP JPK помогает пользователю через все шаги подготовить приобретенные кривые для Герцей обрабатывая и обеспечивает легкую для использования чалькулятора для Young модуля.

Источник: Аппаратуры JPK

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Аппаратуры JPK

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:23

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit