Genom Att Använda Atom- StyrkaMicroscopy för Att Bestämma ResårRekvisita av Biologiskt Tar Prov vid JPK Instrumenterar

Täckte Ämnen

Inledning
Hertz Modellerar
Utfärdar för att vara Ansett
Ta Prov Rekvisita
Passformen Spänner
Val av Sonden
Exempel av ett InryckningsExperiment
Förberedelse av Sonden
Utföra InryckningsExperiment
Data - bearbeta
Testa Systemet
Avslutning

Inledning

Genom Att Använda det atom- styrkamikroskopet (AFM) för nanoindentation har dykt upp, som ett användbart bearbetar för att bestämma resårrekvisitanågot liknande som resårmodulusen för biologiskt tar prov (figurera 1). Cantileversserven som mjuka nanoindenters låta att testa för lokal av litet och inhomogeneous tar prov lika celler eller silkespapper. Att beräkna parametern av intressera olikt modellerar används, men mest av dem baseras på Hertz modellerar, och fördjupat villkorar för att matcha det experimentellt att angå indenters'na formar eller tjockleken av ta prov.

Figurera 1. Överblick av den Young modulusen för olika biologiska material

Nanomechanical analys av celler är passande mer och mer viktigt i olikt sätter in lik cancer och utvecklings- biologi. Skillnader i styvhet av det normala och maligna celler fanns, och också kan ändringen i metastatic potentiellt med minskning av cell- styvhet markeras. När Du Bestämmer spänningen för cellcortexen av föregångare för zebrafishbakterielagrar avslöjde skillnader i styvhet av de ecto, meso och endodermal föregångarecellerna. Ett Annat exempel från sätta in av utvecklings- biologi är mekaniskt testa av tillväxtsubstrates. Denna applikation avslöjde den viktiga rollen av matrisspänst för cellhärstamningspecifikation. Inte endast celler men också delar av deras extracellular miljö, lika collagenfibrils har testats för deras mekaniska rekvisita [17]. Det potentiellt av denna methodology används brett i biologiskt och också andra discipliner för att beskriva resårrekvisita av olika matriser och material.

Denna rapport beskriver applikationen, och förvärvet av spänst experimenterar genom att använda AFM-teknik. En överblick av som används mest gemensam, modellerar, modellerar Hertz ger sig, och antagandena och de resulterande begränsningarna för bruket med biologiskt tar prov diskuteras in specificerar.

Hertz Modellerar

Hertz modellerar approximerar ta prov som isotropiska och linjära resårheltäckande som upptar fördjupande ett oändligt halvt utrymme. Dessutom antas tar prov det, att indenteren inte är deformable och att det inte finns några extra växelverkan mellan indenteren och. Om dessa villkorar möts den Young modulusen (E) av ta prov kan vara inpassade, eller beräknat genom att använda det Hertzian modellera. Flera parametrar som beskriver rekvisitan av ta prov och inryckningssonden, måste att specificeras.

Figurera 2. Bästa - Skissa av inryckningsexperiment. Cantileveren är rörd in mot ta prov vid en distansera z ((mätt) höjd). Cantileveren böjer in i stunden för motsatsriktning (x) som ta prov inryckas av ä. Slutligen beräknas ä, genom att subtrahera cantileveravböjningen från (den mätte) höjden. Botten - som är Schematisk av korrigeringen av höjden för cantileveren som böjer (x) för att härleda spets-ta provavskiljandet (styrkainryckningen buktar).

Datan erhållande av inryckningsmätningar (styrkaspektroskopifunktionsläge) är vanligt täppor av styrka mot piezo förskjutning, ganska än spets tar prov avskiljande. Att applicera Hertz modellera, buktar behov att konverteras, som förklarat in figurera 2.

Hertz modellerar antar inryckningen för att vara neglectable i jämförelse till ta provtjockleken, således måste inryckningsdjup att optimeras. Hertz modellerar är giltig för lilla inryckningar (något att säga upp till 5-10% av höjden av cellen, kanske 200-500 nm) var substraten inte gör påverkan beräkningarna. Det kan finnas extra begränsningar i inryckningsdjup, om spetsen formar modellerar är en närhet. Ofta modellerar det paraboliskt används, om indenteren är en sphere, därför att det är lättare till passformen, och närheten är rimlig för lilla inryckningar. Passande för erbjudanden för JPK-IP-programvara det automatiska för alla indenter formar visat här, så där är ej längre något behov att göra denna närhet.

Utfärdar för att vara Ansett

Hertz modellerar gör flera antaganden som inte möts riktigt, om celler eller annat biologiskt tar prov undersöks.

I detta dela upp dessa avsteg diskuteras och hur man gör de pålitligaste mätningarna.

Ta Prov Rekvisita

Hertz modellerar antar evig sanningresåruppförande såväl som enhetlighet av ta prov. Men mest biologiska material är ingen av homogent nor absolut resår. Energin som levereras av indenteren, ges inte fullständigt tillbaka av en cell (som den skulle göras av en materiell evig sanningresår), men skingrar att vara skyldig till viscous och plast- uppförande som visas också, som hysteresis mellan fördjupningen och tillbakadragningsdelen av styrkan buktar (Fig. 3). Variabilityen av det viscous uppförandet blir synlig, om olika inryckningshastigheter testas. Ladda klassar higher, mindre inryckningen och högre den påtagliga styvheten. Tidfjäll som beskriver detta uppförande, är avkopplingtiden och är olikt för varje viscous/viscoelastic materiellt. När Du Använder hastigheter nära avkopplingtiden ska resultat i lägre styrkor, därför att den materiella cellen har tid till flyttningen i väg från den inryckande sonden. Högre hastigheter resulterar i ett högre motstånd av den materiella ta prov, och total- växelverkan är mer resår (styrka är arrangerar gradvis in med inryckningen, inte hastighet). I allmänhet är det det bäst staget som är jämnt i denna parameter som har det samma initialt, villkorar för varje experiment. Men det bör inte glömmas att varje materiell eller celltyp har dess egna avkopplingtid, sedan de kan variera väldeliga i deras sammansättning (storleksanpassa av nucleusen, sammansättning av cytoskeletonen Etc.).

Figurera 3. Styrka distanserar buktar taget på en cell för uppehälle CHO (bildläsningen rusar 5 µm/s). Spåra (rött) och se över igen (det röda mörkret -) buktar klart showhysteresis som varar skyldig till det viscous och plast- uppförandet av cellen.

Inhomogeneity av ta prov också kan resultera i lik variation för kulturföremål av den Young modulusen beroende av inryckningsdjup, dvs. beroende av lagrar eller del- är indenteren faktiskt tränga in. Celler har olika delar (lik glycocalix, membranf8orlängningar, nucleus eller organelles) som kan reflektera olik styvhet. Kontakten pekar lider också från dessa variationer, och växelverkan av sonden och ta prov ytbehandlar eller molekylar som täcker ytbehandla. Sådan buktar ofta show som en mycket grund kontakt pekar, var E beräknas för att vara mer mjuk än ta prov är egentligen. ”Den verkliga” styvheten av ta prov thus mätas endast, när sonden ner det riktigt ytbehandlar som är efter den grunda delen av bukta. Därefter matchar passformen inte kontakten pekar av Styrka-inryckning-Bukta (figurera 4). Men detta är inte överraska, sedan Hertz modellerar antar att enhetlighet av ta prov och inga växelverkan between tar prov och sonderar. Slutligen är det alltid viktigt att fokusera på delen av bukta som föreställer strukturera som, du önskar att utforska.

Figurera 4. Inryckningen för Styrka buktar kontra härlett från en cell som är inpassad med Hertz, modellerar. Samma buktar var först inpassade till en inryckning av 200 nm (överträffa) och understöder över den hela inryckningen spänner av 400 nm (botten). Självfallet buktar sonden som skjuts till och med två olika lagrar, sedan den inpassade kontakten pekar av första, är olik från kontakten pekar av understödja buktar. E-enheten av första buktar och att beskriva styvheten av cellen ytbehandlar, är kPa omkring 16, den av understödja buktar, som kan antas för att vara enheten för te E av cytoplasmen, kPa omkring 35.

Passformen Spänner

Också viktigt är att finna passformen spänner som är att vara den van vid avkastningoptimaln och reproducible resultat för spänstberäkningar. Som beskrivit i dela upp ovanför E fluctuates starkt på mycket låga inryckningar runt om kontakten pekar, men räckvidder en platå med den ökande inryckningen till slutligen förhöjning igen, främst som ett resultat av substratestyvheten (den glass glidbanan Etc., ser för att figurera 5, botten). Således strukturerar höjden av inryckad är starkt att vara ansedd. Hertz modellerar är endast giltig för lilla inryckningar (något att säga upp till 5-10% av höjden av cellen, kanske 200-500 nm) var substraten inte gör påverkan beräkningarna och var geometrin av inryckningen matchar geometrin av indenteren. Som beskrivit i Hertz dela upp över, spänner det bäst långt som finner optimaln, är att anteckna en styrka distanserar buktar med förhållandevis kickinryckningen, och till passform E för varje peka av den motsvarande styrkainryckningen buktar. När du Konspirerar E över inryckning avslöjer inryckningen, när E-starter som ansar in mot en konstant, värderar som bör vara van vid bestämmer den Young modulusen (figurera 5, en mitt).

Men det kan hända att det inte finns någon tydlig platå, när speciellt inhomogeneous inryckning tar prov. Om en cell för anföra som exempel testas rätt ovanför nucleusen genom att använda en förhållandevis liten indenter (e.g en pyramid), nucleusen kan snedsteget i väg från under sonden, och resultatet är en minskning av den mätte modulusrätten, efter nucleusen sköts av sonden (figurerar 5, bästa).

Figurera 5. Inryckningen för E buktar kontra av en CHO-cell som sonderas med en pyramidal indenter på olika regioner: rätten ovanför nucleusen (överträffa), regionen bredvid nucleusen (en mitt) och near kanta av cellen (botten). När du Testar rätt ovanför nucleusen (överträffa), här endast betecknade övergående styvheten av nucleusen. Självfallet var nucleusen därefter skjutet resultera bort i minskning av E. Sondera per den förhållandevis homogena avslöjda även inryckningen för regionen (en mitt) av cytoplasmstarten på omkring 250 nm. Inryckningen av cellen kantar blytak (för botten) till en understödja, substrateanhörigförhöjning av E-start på förhållandevis låga inryckningar.

Alla trena buktar av figurerar 5 härleder från den samma cellen och togs med den samma sonden under samma villkorar exakt. Och thus inte tydligt eller typisk antyda av en verkställa av den glass substraten för båda den övreinryckningen för E buktar kontra, Även om det inte finns något tydligt ”understöder” förhöjning i E, centrerar förhöjningen av den påtagliga styvheten från cellen till kanta indikerar en påverkan av substraten. Men denna är inte överraska, sedan höjden av cellen på nucleusen mättes för att vara µm omkring 5, på omge av nucleusen att vara µm omkring 1,3 och på kanta runt om 0,5 µm. Slutligen visar dessa resultat att verkställa av substraten är inte endast synlig vid en förhöjning av E inom inryckning för E buktar kontra men vid ökande E värderar också på tunnare regioner av cellerna.

Val av Sonden

Vilken cantilever bör användas, beror på styvheten av ta prov. Som regel av tum en kan uppehället i åtanke att styvheten av cantileveren bör vara runt om spänna av ta provstyvheten. För celler, som är mycket mjuka och delikat, fjädrar de mest mjuka cantileversna som är tillgängliga med, konstanter av omkring 10-30 mN/m bör användas. För mer styv tar prov lika agarosegels fjädrar higher konstanter (30-100 mN/m eller mer) är anslår.

Another pekar för att betrakta är det primat av indenteren formar. För mjukt biologiskt tar prov det rekommenderas att använda sfäriska sonder, sedan styrkan appliceras till ett mer bred tar prov område, än skulle var fallet, om den pyramidal eller koniska spetsen för en kor används, som resulterar i ett lägre pressar. Hitåt förhindras genomträngningen av ta prov. Men detta är inte det enda resonerar för att föredra sfäriska indenters. Celler eller silkespapper är mycket inhomogeneous och att bestå av olika delar (nucleus, cytoskeletal delar, organelles…). Till avkastning är ett allmänt intryck för sådan inhomogeneous material förhållandevis som stor µm för indentersnågot liknande 20 pryder med pärlor, användbart.

Till högre upplösning för avkastning e.g att testa singelceller eller olika celldelar eller till förhöjning pryder med pärlor pressa för att inrycka mer styv material av mindre diametrar kan användas (µm 1-10, beroende av den önskade upplösningen). Spheres är inte alltid den bäst lösningen. Om ta prov är av mycket litet dimensionerar, eller, om olika områden ska testas i högre upplösning (higher än en mikron) pyramidal silikonnitridespetsar kan vara ett alternativ. En missgynna av sådan mer eller mindre korspetsar är naturligtvis den dem kan tränga igenom ta prov och thus leda till felaktiga beräkningar av den Young modulusen (allmänt en minskning av styvhet).

Men å andra sidan hindereds de mindre by strukturerar lika cell- f8orlängningar eller rest som fördjupa från glycocalixen, än spheres är. Är sådan f8orlängningar för Sfärisk för indenters känselförnimmelse ofta och resultatet en mycket grund kontakt pekar som är extremt svår att bestämma (som är också resonera därför den bör vara inpassad). Ett allmänare problem, som uppstår med celler är förvriden styrka, buktar, mestadels visat, som ”knuffa” i kontaktregionen (Fig. 6). Dessa distorsioner kan härleda från kontakt med litet strukturerar lika spänningsfibrer, eller membranous f8orlängningar, som därefter snedsteget i väg från sonden som leder till en understödjakontakt, pekar.

Figurera 6. Distorted fördjupa buktar taget på en CHO-cell genom att använda en sfärisk indenter för 2 µm.

Exempel av ett InryckningsExperiment

I detta exempel beskrivas workflowen som härleder den Young modulusen av att bo CHO-celler. CellHesion®en 200 som monterades på Zeiss ett optiskt mikroskop (AxioObserver), var van vid förbereder den sfäriska sonden som gick att användas, såväl som att utföra inryckningsexperiment CellHesion®en 200 är en ny AFM baserad apparat som framkallas exklusivt för att möta behoven av att testa cell- adhesion och mekaniker. En PetriDishHeater™ användes som en ta provhållare, sedan celler var fullvuxna på disk för WPI petri. Cellerna hölls under fysiologiskt villkorar under helhetsexperiment (37°C, HEPES fungera som buffert medel).

Förberedelse av Sonden

Sfäriska indenters kan endera inhandlas från lika partikelsonder för speciala familjeförsörjare från Novascan (0.6-25 glass spheres för µm som fästas till cantilevers), eller de kan vara hemlagade, genom att limma spheres på cantilevers. För sådan ämna den tipless cantileveren är väl - anpassat. Omsorg måste tas, om cantilevers med spetsar används, om speciellt lilla spheres fästas. Detta är, därför att spheren ska bilagan till sidan av spetsen, ganska än på avsluta, så att spetsen som fortfarande ska, har en få effekt på experiment, om speciellt den valda spherediametern är mindre än spetshöjden. Silikoncantilevers har spetsar av upp till µm omkring 15. Således skulle tipless cantilevers är bättre primat eller åtminstone silikonnitridecantilevers som har kortare spetsar (upp till µm 5).

För detta exempel användes en tipless cantilever (Pilen TL1, NanoWorld, K = 0,03 N/m) med en fäst silicasphere (µm för diameter 11) som inryckningssonden (Fig. 7). Silicaen pryder med pärlor fästes till cantileveren med endel epoxy, men annat optiskt bindemedel för biocompatible bindemedelnågot liknande är också väl - anpassat. Detta kan lätt göras, genom att förbereda en mikroskopglidbana var spheres sättas in på en del och epoxy på en närgränsande del. Om pryder med pärlor inställs i flytande, är en tappa pålagd glidbanan och torkat. En para av ren pincett kan också vara den torra van vid överföringen pryder med pärlor på glidbanan eller till spridning pryda med pärlorlösningen. Därefter är ett litet belopp av epoxyen spritt mycket tunt nära pryder med pärlor genom att använda en blad- eller pipettespets.

Figurera 7. Tipless cantilever med 11 en fäst mikron sphere

Cantileveren måste först doppas in i epoxyen. En att närma sig göras på en ren region av exponeringsglas för att finna ytbehandla. Därefter placeras cantileverspetsen över kanta av epoxyen lappar genom att använda positioneringen skruvar, och en styrkaspektroskopimätning körs för att doppa spetsen in i limma. Ett setpoint av omkring 0,5 till 1 V bör vara tillräckligt. Om det finns för mycket, limma på spetsen som den kan flöda över pryda med pärlor och bädda in den. Att förhindra detta, bör en eller flera extra spektroskopimätningar utföras på ett rent glass område. Ska Detta tar bort överskotts limmar. Slutligen att fästa en sphere, buktar en annan styrka körs med spetsen som placeras över en sphere.

Utföra InryckningsExperiment

Microspheresonden monterades och arrangera i rak linje som vanlig på AFM-huvudet. Maträtten för WPI som petri innehåller fastsittande CHO-celler, monterades till den petri maträttvärmeapparaten, och temperaturen var fastställd till 37°C. Cantileveren kalibrerades därefter, dvs. det konstant beslutsamt för fjädra för att vara kompetent exakt att specificera styrkan som ska appliceras till ta prov. Genom Att Använda NanoWizard®en eller CellHesion200®en leder kalibreringschefen av programvaran för JPK SPM användaren till och med den processaa kalibreringen, beräkna buktar känsligheten vid passande en styrka (taget på en hård substrate) inom den linjära kontaktdelen, och bestämma fjädrakonstanten med thermalen stoja metoden. När kalibreringen är färdig, kan den önskade setpoint styrkan skrivas in i Newtons (vanligt pico- eller nano-Newtons). Nu kunde experiment startas.

Styrka distanserar buktar togs direkt ovanför nucleusen av olika celler. Förhållandevis användes kicksetpoints (upp till nN 4) sedan den mekaniska rekvisitan av dessa celler var okänd. F8orlängningen/drar tillbaka rusar var fastställd till 5 µm/s, och stängt kretsa användes.

data - bearbeta

JPK-IP-programvaran ger möjligheten för att härleda den Young modulusen från styrka buktar spring till och med flera kliver (Fig. 8). Alla funktioner måste att appliceras till fördjupningen buktar efter den (normalt eller åtminstone i vätska) innehåller ingen lik adhesion för växelverkan som gör en beslutsamhet av kontakten att peka omöjligt. Första steg av bearbeta är att ta bort någon offset, eller lutande från bukta och att finna kontakten pekar. Därför Subtraherar alternativen ”grundlinjen”, och ”pekar Fyndkontakten” är att vara utvald. Det är inte nödvändigt att bestämma exakt kontakten pekar eller grundlinjeoffset här, sedan de är färdiga parametrar för variabel och inte har någon påverkan på de färdiga resultaten. Någon lutande bör tas bort från grundlinjen, sedan denna inte är delen av den Hertz passformen. De nästa kliver är ”Korrekt höjd för cantileveren som böjer”, ett särdrag som beräknar inryckningsdjupet, genom att ta skillnaden mellan den piezo rörelsen och cantileverlodlinjeavböjningen i enheter av längden. Nu buktar en ordna till för att vara inpassat med Hertz modellerar för att härleda den Young modulusen. Annat värderar, liksom den inpassade ”kontakten peka”, och den färdiga kvalitets- parametern ”resterande RMS” visas också.

Figurera 8. Funktioner som härleder den Young modulusen från en styrka, buktar. Första steg är att ta bort någon offset, eller lutande från grundlinjen och att finna kontakten pekar. För att optimera kontakten peka beslutsamhet som bukta kan slätas. De nästa och de avgörande kliver är att subtrahera cantileveren som böjer från den piezo rörelsen till avkastning inryckningen, dvs. kanaliserar ett nytt kallad spets tar prov avskiljande skapas. Slutligen modellerar Hertz kan appliceras. Geometrin av indenteren ska specificeras, såväl som Poissons förhållande (som kan lämnas på 0,5 för biologiskt tar prov), och datan spänner för att vara inpassade.

Om många buktar antecknades där är möjligheten som ska användas, grupperar att bearbeta, var alla beskrev funktioner kan appliceras till en gruppera av, buktar (inom en mapp).

För gruppera att bearbeta, det är användbart att undersöka några buktar i mer specificerar för att finna den optimala passformen spänner alla som kan därefter appliceras till buktar. Därför spänner passformen bör vara den ökande stepwise kassalådan som E-modulusen ansar in mot en konstant värderar. I figurera 9 som den Young modulusen som härledas från en CHO-cell, konspireras i beroende på inryckning. Här värderar E-starter som tar konstant, på omkring 700-800 nm av inryckningsdjup. Om undersöka en samling av buktar, genom att använda gruppera att bearbeta, detta värderar bör användas för passform spänner. Naturligtvis bör det kvalitets- av passformen alltid kontrolleras, genom endera att se direkt på, buktar, eller, genom att jämföra den resterande RMSEN, som är också skriftlig, besegra i resultaten sparar som frambrings, när du använder gruppera att bearbeta.

Figurera 9. Inryckningen för E buktar kontra av en CHO-cell. På omkring 700 nm- sominryckningen E jämnar till en konstant, spänna (Pa omkring 450).

Testa Systemet

Den Young modulusen är ofta van vid beskriver mekanisk rekvisita av celler, och annan tar prov. I många fall är avsikten att göra sådan experiment att jämföra resultaten med andra data som produceras av andra forskare. att Kamma till och med litteraturen en finner alltid diskrepanser mellan Et värderar av liknande experiment men utfört genom att använda olika apparater. Att att utvärdera, hur systemet fungerar, men också att nå en känsla för tekniken och bruk den är ofta användbara att starta med en ta prov var spänsten har redan beskrivits med ett liknande system. Gels av lik agarose för polymrer eller polyvinylalkohol welldescribeds tar prov som är ofta van vid beskriver principer av spänstmätningar.

Att testa systemet, som cellen experimenterar på, utfördes 2,5%, agarose somgelen inryckades genom att använda en sfärisk sond för 11 µm. E.g med fjädra konstanter av 0.5-5 N/m., Sedan agarosegels i denna koncentration är mer styv än celler, måste mer styv sonder att användas. I detta exempel användes en NSC-cantilever från mikromasch (4 N/m). Den motsvarande inryckningen för E buktar kontra visas in figurerar 10 som visar en final E av kPa omkring 36. Detta värderar instämm väl med litteraturen (figurera 1).

Figurera 10. Inryckningen för E buktar kontra beräknat för en styrka distanserar buktar taget på en 2,5% agarosegel genom att använda en sfärisk sond för 11 µm med en fjädrakonstant av 4 N/m. Finalen E är kPa omkring 36

Avslutning

Trots några begränsningar som Hertz modellerar är ett hjälpsamt, och den gemensamt använda metoden till uttrycklig mekanisk rekvisita av biologiskt tar prov lika celler. Det finns något utfärdar som bör hållas liksom passformen spänner i åtanke eller sammansättning av ta prov. Biologiskt tar prov ofta viscoelastic uppförande för skärm, och de är inhomogeneous, består dvs. av olika ”material” med olik resårrekvisita. Att att veta exakt, som del- beskrivas exakt av resultaten, den är viktigast att bli bekantat med ta prov och tillräckligt att justera parametrarna.

Att Betrakta allt dessa utfärdar ska hjälp till rimliga och reproducible resultat för avkastning.

JPKNA NanoWizard®II eller CellHesion®200na i kombination med hängivet tar prov hållare, gillar PetriDishHeater™en, eller BioCell™en, ger hjälpmedlet för att erhålla spänstdata (bland talrikt andra datatyper) för biologiskt tar prov. Dessutom alla hjälper JPK-IP-programvaran användaren till och med kliver för att förbereda fången buktar för Hertz som bearbetar och, ger en enkel att använda räknemaskin för den Young modulusen.

Källa: JPK Instrumenterar

För mer information på denna källa behaga besök JPK Instrumenterar

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:30

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit