Använda atomkraftsmikroskopi att reda elastiska egenskaper av biologiska prover med JPK Instruments

:: AZoNanotechnology Artikel

Ämnen som tas upp

Inledning
Hertz Modell
Frågor som bör beaktas
Exempel på egenskaper
Fit Range
Val av Probe
Exempel på en Indrag Experiment
Beredning av Probe
Utföra Indrag Experiment
Data Processing
Test System
Slutsats

Inledning

Använda atomkraftsmikroskop (AFM) för nanoindentation har vuxit fram som ett användbart verktyg för att bestämma elastiska egenskaper som elasticitetsmodul för biologiska prover (figur 1). Utliggare tjäna som mjuka nanoindenters tillåter lokal testning av små och inhomogena prover som celler eller vävnader. För att beräkna parametern av intresse olika modeller används, men de flesta är baserade på Hertz modell och utvidgas till att matcha de experimentella villkoren för indentorer "formen eller tjockleken på provet.

Figur 1. Översikt över Youngs modul för olika biologiska material

Nanomechanical analys av celler blir allt viktigare inom olika områden som cancer och utvecklingsbiologi. Skillnader i styvhet av normala och maligna celler hittades och även förändringen i metastaserande potential med minskande cellulära stelhet kan markeras. Fastställande av spänning cell cortex om zebrafisk stamceller könsceller lagret framkom skillnader i styvhet i Ecto-, meso-och endodermal progenitorceller. Ett annat exempel från området för utvecklingsbiologi är mekanisk provning av tillväxt substrat. Denna applikation visar den viktiga roll som matris elasticitet för cellsläktträd specifikation. Inte bara celler utan även delar av deras extracellulära miljön har som kollagen fibriller testats för deras mekaniska egenskaper [17]. Potentialen för denna metod används ofta i biologiska och även andra discipliner för att beskriva elastiska egenskaperna hos olika matriser och material.

Denna rapport beskriver tillämpningen och förvärv av elasticitet experiment med AFM teknik. En översikt av de vanligaste modellen är Hertz modell som finns och de antaganden och leder begränsningar för användning med biologiska prover diskuteras i detalj.

Hertz Modell

Hertz-modellen approximerar provet som ett isotropt och linjärt elastiskt fast ockupera ett oändligt utvidga halv utrymme. Dessutom förutsätts att diamanten inte är deformerbar och att det finns inga ytterligare interaktioner mellan indenter och prov. Om dessa villkor är uppfyllda för Youngs modul (E) av provet kan monteras eller beräknas med hjälp av Hertz'skt modellen. Flera parametrar som beskriver egenskaper hos provet och indrag sonden måste specificeras.

Figur 2. Top - Skiss över indraget experimentet. Den cantilever flyttas mot provet med ett avstånd z (höjd (mätt)). Den cantilever är böjning i motsatt riktning (x) medan provet indragen med en. Äntligen en beräknas genom att subtrahera fribärande böjning från höjd (mätt). Bottom - Schematisk av korrigeringen av höjden vid fribärande böjning (x) för att härleda tip-sample-separation (force indrag kurva).

De data som erhålls genom indrag mätningar (kraft spektroskopi läge) är oftast tomter av våld mot piezo förskjutning, snarare än spets prov separation. För att tillämpa Hertz modell, kurvor måste omvandlas som förklaras i figur 2.

Utföra Indrag Experiment

Den mikrosfär sond monterades och anpassas som vanligt på AFM huvudet. Den WPI petriskål som innehåller anhängare CHO-celler var monterad i petriskålen värmare och temperaturen var satt till 37 ° C. Den cantilever då var kalibrerad, dvs fjäderkonstanten bestäms att kunna exakt ange den kraft som skall tillämpas på provet. Använda NanoWizard ® eller CellHesion200 ® kalibrering chef för JPK SPM programvara leder användaren genom kalibreringen, beräkning av känsligheten genom att montera en kraftkurva (tagit ett hårt substrat) inom den linjära kontakten delen och bestämma fjäderkonstanten med termiskt brus metod. När kalibreringen är klar, kan det önskade börvärdet kraft anges i Newton (vanligtvis pico-eller nano-Newton). Nu experimentet kunde påbörjas.

Force avstånd kurvor togs direkt ovanför kärnan i olika celler. Relativt höga börvärden användes (upp till 4 nN) sedan de mekaniska egenskaperna hos dessa celler var okända. Förlängningen / in fart var satt till 5 ìm / s och slutna användes.

Data Processing

Den JPK IP-programvara ger möjlighet att härleda Youngs modul från kraft kurvor som löper genom flera steg (fig. 8). Alla transaktioner måste tillämpas i den utsträckning kurvan eftersom det (normalt eller åtminstone i vätska) innehåller inga interaktioner som vidhäftning som gör en bestämning av kontaktpunkten omöjligt. Det första steget i behandlingen är att ta bort offset eller luta från kurvan och hitta kontaktpunkt. Därför alternativ "Subtrahera baseline" och "Hitta kontaktpunkt" ska väljas. Det är inte nödvändigt att fastställa exakt kontaktpunkten eller baslinjen kompenseras här eftersom de är rörliga passar parametrar och inte har något inflytande på plats resultaten. Varje lutning bör tas bort från baslinjen, eftersom detta inte är en del av Hertz passform. Nästa steg är att "rätt höjd för fribärande böjning", en funktion som beräknar indraget djupet genom att ta skillnaden mellan piezo-rörelsen och den fribärande vertikala deformationen i enheter för längd. Nu kurvorna en klar att förses med Hertz modellen för att härleda Youngs modul. Andra värden, såsom den monterade "kontaktpunkt" och passar kvalitet parametern "kvarvarande RMS" visas också.

Figur 8. Verksamheten att härleda Youngs modul från en kraft kurva. Det första steget är att ta bort offset eller luta från baslinjen och för att hitta den kontaktpunkt. För att optimera fastställandet kontaktpunkt kurvan kan jämnas ut. Nästa och avgörande steg är att subtrahera fribärande böjning från piezo-rörelsen att ge indraget, dvs en ny kanal som heter spets prov separation skapas. Slutligen Hertz Modellen kan tillämpas. Geometrin på diamanten ska specificeras samt Poissons tal (som kan lämnas på 0,5 för biologiska prover) och dataområdet som skall monteras.

Om många kurvor spelats in finns det möjlighet att använda batch-bearbetning där alla beskrivna verksamheten kan tillämpas på ett parti kurvor (inom en mapp).

Innan batchbearbetning, är det lämpligt att undersöka några kurvor i mer detalj för att hitta optimal passform område som sedan kan tillämpas på alla kurvor. Därför passar intervallet ökas stegvis tills E modulen tenderar mot ett konstant värde. I figur 9 på Youngs modul kommer från en CHO-celler ritas i beroendet av indrag. Här E börjar ta konstanta värden kring 700-800 nm indrag djup. Om prövningen av en rad kurvor, med hjälp av batch-bearbetning, bör detta värde användas för passa sortiment. Naturligtvis kvaliteten på plats bör alltid kontrolleras av antingen tittar direkt på kurvorna, eller genom att jämföra kvarvarande RMS som också skrivs ned i resultaten filen som genereras när du använder batch-bearbetning.

Figur 9. E kontra indrag kurva för en CHO cell. På runt 700 nm indrag E nivåer för att en konstant omfång (cirka 450 Pa).