使用基本强制显微学确定生物范例有弹性属性由 JPK 仪器

包括的事宜

简介
赫兹塑造
将考虑的问题
范例属性
适合的范围
探测的选择
凹进实验的示例
探测的准备
执行凹进实验
数据处理
测试系统
结论

简介

使用基本强制 nanoindentation 的显微镜涌现了,当确定有弹性属性的有用的工具喜欢生物范例的 (图 1) 弹性模数。 悬臂担当虚拟 nanoindenters 允许小和不同类的范例局部测试象细胞或组织的。 要计算利息多种设计的参数使用,但是大多数在赫兹设计基础上并且延伸符合关于这个范例的受托代购商的形状或厚度的试验条件。

年轻的模数的图 1. 概览不同的生物材料的

对细胞的 Nanomechanical 分析变得愈加重要用象癌症和发展生物的不同的域。 找到在正常和恶性细胞的僵硬上的区别并且在变形的潜在上的变化与越来越少的蜂窝电话僵硬可以被标记。 确定 zebrafish 胚叶祖先细胞外皮紧张显示了在 ecto, meso 和内胚层的祖先细胞的僵硬上的区别。 从发展生物的域的另一个示例是增长基体机械测试。 此应用显示了矩阵弹性的重要角色细胞后裔说明的。 不仅他们的细胞外环境细胞,而且要素,象胶原原纤维为他们的机械性能 [17] 被测试了。 此方法潜在是用途广泛在生物并且其他学科描述不同的矩阵和材料有弹性属性。

使用 AFM 技术,此报表描述弹性实验的应用和购买。 赫兹设计提供这个最常用的设计概览,并且假定和发生限制为与生物范例的使用详细讨论。

赫兹塑造

赫兹设计接近这个范例作为占用一个无限延伸的休息平台的一种各向同性和线性有弹性固体。 此外假设,受托代购商不可变性,并且没有受托代购商和范例之间的另外的交往。 如果这些情况符合使用这个赫兹波的设计,这个范例的年轻的模数 (e) 可以适合或被计算。 描述范例和凹进探测的属性的几个参数必须指定。

图 2. 顶的草图凹进实验。 悬臂被移动朝这个范例由距离 z ((被评定的) 高度)。 这个范例由 ä,缩进悬臂弯曲到这个相反的方向 (x)。 最终 ä 通过减去悬臂式偏折计算从这个高度 (被评定)。 底层 - 高度的更正的概要悬臂式弯曲的 (x) 的能派生技巧范例分隔 (强制凹进曲线)。

凹进评定得到的数据 (强制分光学模式) 通常是强制剧情压力位移,而不是打翻范例分隔。 要运用赫兹设计,曲线需要被转换按照图 2. 说明。

赫兹设计假设凹进是 neglectable 与范例厚度比较,因而凹进深度必须被优选。 赫兹设计为小的凹进是有效的 () 请说 5-10% 这个细胞的高度,可能 200-500 毫微米这个基体不影响计算的地方。 如果技巧形状设计是近似值,可能有另外的限制凹进深度。 通常使用抛物面设计,如果受托代购商是范围,因为适合是更加容易的,并且这个近似值为小的凹进是合理的。 JPK IP 软件提供显示的所有受托代购商形状的自动配件这里,那么那里不再是所有需要做此近似值。

将考虑的问题

赫兹设计做正确地没有满足的几个假定,如果细胞或其他生物范例被检查。

在此部分这些偏差讨论和如何做最可靠的评定。

范例属性

赫兹设计假设这个范例的绝对有弹性工作情况以及同质性。 但是多数生物材料不是同类和绝对有弹性的。 细胞不完全地产生受托代购商提供的这个能源 (因为它将由一份绝对弹性材料完成),但是由于也出现的黏和塑料工作情况消散,当在延伸和强制之间的缩回零件的迟滞现象弯曲 (图 3)。 这个黏工作情况的若不同可变性成为可视凹进速度被测试。 越高贷款利率,越小凹进和越高明显的僵硬。 描述此工作情况的时间表是弛豫时间并且为每黏/黏弹性材料是不同的。 使用在弛豫时间附近的速度,因为细胞材料有时间移动远离缩进的探测,导致更低的强制。 更高的速度导致高电阻范例材料,并且整体交往是更加有弹性的 (强制是在与不是凹进,速度的阶段)。 一般坚持一致在此参数有每个实验的同样最初的条件是最佳的。 但是不应该忘记每个材料或细胞类型有其自己的弛豫时间,因为他们在他们的构成 (细胞骨架等) 的中坚力量,构成的范围可以非常地变化。

在一个生存 CHO 细胞 (扫描速度 5 µm/s) 的图 3. 强制被采取的距离曲线。 跟踪 (红色) 并且由于这个细胞的黏和塑料工作情况折回 (深红) 清楚曲线显示迟滞现象。

这个范例的多相性可能也导致象这个年轻的模数的差异的人工制品根据凹进深度,即根据层或要素受托代购商实际上压入。 细胞有可能反射另外僵硬的多种要素 (象 glycocalix、膜扩展名、中坚力量或者细胞器)。 联系人地点也遭受包括表面探测的这些差异和交往和范例表面或者分子。 这样曲线经常显示 E 比这个范例确实被计算虚拟的一个非常浅联系人地点。 这个范例的 “实际”僵硬只因而被评定,当探测到达是在曲线以后的浅部分的适当的表面时。 然后适应不符合强制凹进曲线 (图 4) 的联系人地点。 因为赫兹设计假设范例和没有交往的同质性范例和探测之间,但是这不惊奇。 终于,集中在表示这个结构您要调查的曲线部分总是重要的。

图 4. 强制与从细胞派生的凹进曲线,符合赫兹设计。 同样弯曲首先适合了对凹进 200 毫微米 (顶层) 和其次在全部的凹进范围的 400 毫微米 (底层)。 明显地,因为第一曲线的适合的联系人地点是与第二曲线的联系人地点不同,探测通过二块不同层推进了。 第一曲线的 E 模块,描述细胞表面的僵硬,是大约 16 kPa,那个第二曲线,可以假设是细胞质的 te E 模块,大约 35 kPa。

适合的范围

并且重要的是查找将使用产生弹性计算的最佳和再现结果的适应范围。 正如在 E 上的部分所描述严格动摇在非常低凹进在联系人地点附近,但是伸手可及的距离随着再终于增加的凹进的增加一个高原,主要由于基体僵硬 (载玻片等,参见图 5,底层)。 因而这个缩进的结构的高度严格将考虑。 赫兹设计为小的凹进只是有效的 () 请说 5-10% 这个细胞的高度,可能 200-500 毫微米这个基体不影响计算的地方,并且凹进的几何符合受托代购商的几何的地方。 正如上面赫兹部分所描述,这个最佳的方式查找这个最佳范围将记录与相对地高凹进的强制距离曲线和适合对应的强制凹进曲线的每点的 E。 在凹进的密谋 E 显示凹进,当 E 开始趋向于往应该用于确定这个年轻的模数的一个恒定的值时 (图 5,中间)。

但是它可能发生没有明显的高原,特别是当缩进不同类的范例时。 使用相对地小的受托代购商 (即金字塔),例如如果细胞上面这个中坚力量被测试,这个中坚力量可能滑倒远离在探测下,并且这个结果是这个被评定的模数的减少,在这个中坚力量由探测之后 (图 5,顶层) 推进。

图 5. E 与 CHO 细胞的凹进曲线探查与金字塔形受托代购商在不同的地区: 正确在这个中坚力量 (顶层),这个区域上在这个中坚力量旁边 (中间) 和请临近这个细胞 (底层) 的边缘。 测试上面这个中坚力量 (顶层) 这里临时只表示这个中坚力量的僵硬。 明显地这个中坚力量然后推开造成 E. Probing 减少开始在 250 毫微米前后的细胞质的甚而相对地同源区域 (中间) 显示的凹进。 细胞边缘 (底层) 的凹进导致一秒钟, E 开始在相对地低凹进的基体从属的增量。

全部三曲线图 5 从同一个细胞派生和采取了与同一探测在同一个条件下。 即使没有在 E 和因而没有玻璃基体的作用的明显或典型的暗示的明显的 “其次”增量两的上面的 E 与凹进曲线,明显的僵硬的增量从细胞中心的到边缘指示基体的影响。 但是这不是惊奇,因为细胞的高度在这个中坚力量的被评定是大约 5 µm,在包围这个中坚力量是大约 1.3 µm 和在这个边缘在 0.5 µm 附近。 最终这些结果向显示这个基体的作用是不仅可视的由 E 增量在 E 内的与凹进曲线,而且通过增加 E 值在细胞的更加稀薄的地区。

探测的选择

应该使用哪个悬臂取决于这个范例的僵硬。 根据经验一个人可能记住悬臂的僵硬应该是在范例僵硬附近的范围。 对是非常软和精美的最软的悬臂可用对弹簧常数大约的细胞应该使用 10-30 个 mN/m。 对于象琼脂糖胶凝体更高的弹簧常数的更加僵硬的范例 (30-100 个 mN/m 或更多) 请是适当的。

要考虑的另一点是受托代购商形状的选择。 对于软的生物范例推荐使用球状探测,因为强制比实际情形被应用于一更宽的范例区,如果使用一个锋利的金字塔形或圆锥形技巧,导致低压。 这个范例的此方式渗透被防止。 但是这不是唯一的原因更喜欢球状受托代购商。 细胞或组织是非常不同类的,包括不同的要素 (中坚力量、 cytoskeletal 要素,细胞器…)。 要产生这样不同类的材料相对地大受托代购商的一个通用印象象 20 个 µm 小珠请是有用。

可以使用要产生更加高分辨率,即对测试单细胞或不同的细胞零件,或者增加压缩进小的直径更加僵硬的材料小珠 (1-10 µm,根据期望解决方法)。 范围总是不是这个最佳的解决方法。 如果这个范例是非常小的维数或若不同区是将被测试在更加高分辨率的 (高于一微米) 金字塔形氮化硅技巧可以是替代。 当然缺点的这样更或较不锋利的技巧是该他们可能击穿这个范例和因而导致这个年轻的模数 (一般减少的不正确的计算僵硬)。

另一方面,但是他们由象蜂窝电话扩展名的延长从 glycocalix 的结构或残滓比范围妨害。 球状受托代购商经常感觉这样扩展名,并且这个结果 是非常难确定 (也是这个原因的一个非常浅联系人地点为什么应该适合它)。 发生与细胞的一个更加通用的问题是误解的强制曲线,主要被显示,因为 “肩膀”在联络区域 (图 6)。 这些畸变可能从与小的结构的联络派生象压力纤维或膜扩展名,然后滑倒远离探测,导致第二个联系人地点。

图 6. Distorted 延伸在 CHO 细胞采取的曲线使用 2 µm 球状受托代购商。

凹进实验的示例

在本例中派生居住的 CHO 细胞的年轻的模数的工作流被描述。 CellHesion® 200,挂接在蔡司光学显微镜 (AxioObserver),用于准备打算使用以及执行凹进实验 CellHesion® 200 是一个新的 AFM 基于设备,完全被发展适应测试蜂窝电话黏附力和机械工的需要的球状探测。 因为细胞在 WPI 培养皿,增长 PetriDishHeater™使用了作为范例持有人。 在全部的实验 (37°C, HEPES 缓冲的媒体) 期间,细胞在生理情况下被保留了。

探测的准备

球状受托代购商可能或者从象微粒探测的特殊提供者被采购从 Novascan (0.6-25 µm 玻璃范围附加悬臂),或者他们可以是自创通过胶合在悬臂的范围。 对于这样目的 tipless 悬臂请是非常合适的。 必须保重,如果使用有技巧的悬臂,特别是如果小的范围附上。 这,因为这个范围将附有这个技巧的端,而不是在这个末端,因此这个技巧将有对这个实验的影响,特别是如果选择的范围直径比技巧高度是较少。 硅悬臂有大约 15 µm 技巧。 因而有更短的技巧的 tipless 悬臂是更好的选择或至少氮化硅悬臂 (5 µm)。

对此示例一个 tipless 悬臂 (箭头 TL1, NanoWorld, k = 0.03 N/m) 与一个附上硅土范围 (直径 11 µm) 使用了作为凹进探测 (图 7)。 如光学粘合剂也是非常合适的,硅土小珠附有了有两部分环氧的悬臂,但是其他生物适合的粘合剂。 这可能由准备范围在一部分和环氧存款在一个相邻部分的显微镜幻灯片容易地完成。 如果小珠在液体被暂停,下落在这张幻灯片放置并且被烘干。 一个对干净的镊子可能也用于调用在这张幻灯片上的干燥小珠,或者分布小珠解决方法。 使用刀片或吸移管技巧,然后少量的环氧在小珠附近非常稀薄地被涂。

图 7. 有附属的一个 11 微米范围的 Tipless 悬臂

必须首先浸洗悬臂到环氧。 途径在玻璃的一个干净的区域完成查找表面。 然后这个悬臂式技巧确定在这个环氧补丁程序的边缘使用确定的螺丝,并且强制分光学评定运行浸洗这个技巧到胶浆。 调整点大约 0.5 到 1 个 V 应该是满足的。 如果有在这个技巧的许多胶浆它可能漫过这个小珠和埋置它。 要防止此,在一干净的玻璃区应该进行一个或更多另外的分光学评定。 这将取消超额胶浆。 终于,附有范围,另一强制曲线运行与这个技巧确定在范围。

执行凹进实验

微球体探测被挂接并且对齐和平常一样在 AFM 题头。 包含依附 CHO 细胞的 WPI 培养皿被挂接到培养皿加热器,并且这个温度被设置了对 37°C。 悬臂然后被校准,即弹簧恒定确定能正确地指定将适用的强制于这个范例。 使用 NanoWizard® 或 CellHesion200® JPK SPM 软件的定标经理通过定标进程导致这个用户,计算区分通过适合强制曲线 (采取在一个困难基体) 在线性联络零件内和确定恒定的弹簧与热量噪声方法。 一旦定标是完全的,期望调整点强制在牛顿可以被输入 (通常 pico- 或纳诺牛顿)。 现在这个实验能开始。

强制距离曲线直接地上面不同的细胞中坚力量被采取了。 相对地使用了高 setpoints (4 nN),因为这些细胞机械性能是未知的。 这个扩展名/缩回速度被设置了对 5 个 µm/s,并且使用了闭合电路。

数据处理

JPK IP 软件产生这个可能性从运行强制的曲线派生这个年轻的模数通过几个步骤 (图 8)。 所有运算必须适用于延伸曲线从它 (通常或至少在流体) 不包含使确定联系人地点不可能的交往,如黏附力。 处理的第一步将去除所有抵销或掀动从曲线和查找联系人地点。 所以选项 ‘减去草拟’,并且 ‘查找联系人地点’将被选择。 正确地确定联系人地点是不重要的或草拟抵销了这里,因为他们是可变的适应参数,并且没有对适应结果的任何影响。 因为这不作为赫兹适应的部分应该从草拟取消所有掀动。 下一个步骤是 ‘弯曲的悬臂的正确的高度’,通过采取这个区别计算凹进深度在压力移动和悬臂式垂直的偏折之间在长度部件的功能。 现在曲线准备好符合赫兹设计派生年轻的模数。 其他值,例如适合的 “联系人地点”和适应质量参数 “残余的 RMS”也被显示。

图 8. 派生年轻的模数的运算从强制曲线。 第一步将去除所有抵销或掀动从草拟和查找联系人地点。 为了优选联系人地点确定可以使光滑曲线。 下个和关键的步骤将从这个压力移动减去悬臂式弯曲产生凹进的,即称技巧范例分隔的一条新的通道被创建。 最终赫兹设计可以是应用的。 受托代购商的几何将指定以及可以被留下在 0.5 生物范例的) 的泊松的比例 (和将适合的数据范围。

如果许多曲线被记录了有使用批处理的这个可能性所有被描述的运算可以适用于批曲线的地方 (在一个文件夹之内)。

在批处理前,较详细地检查一些曲线查找可能然后被运用于所有曲线的最佳的适应范围是有用的。 所以, E 模数趋向于往一个恒定的值,应该逐步地增加适应范围。 在表 9 从 CHO 细胞派生的这个年轻的模数在对凹进的依赖性被密谋。 这里采取恒定的值的 E 起始时间在 700-800 毫微米前后凹进深度。 如果检查一一些曲线,使用批处理,应该为适应范围使用此值。 当然应该通过比较在结果文件也写下被生成,当使用批处理时的残余的 RMS 总是检查适应的质量通过查看直接地曲线或。

图 9. E 与 CHO 细胞的凹进曲线。 在对一个恒定的范围 (大约 450 的 700 个毫微米凹进 E 级别前后 Pa)。

测试系统

这个年轻的模数是常用的描述细胞和其他范例机械性能。 在许多情况下这个意图执行这样实验将结果与其他数据比较,导致由其他研究员。 梳通过这个文件一总是查找相似的实验的 E 值之间的差异,但是执行使用不同的设备。 要评估这个系统如何运作,而且获取这个技术的一种感觉和处理它经常是有用从弹性已经描述了与一个相似的系统的范例开始。 聚合物胶凝体象琼脂糖或聚乙烯醇的 是常用的描述弹性评定的原则的 welldescribed 范例。

要测试这个细胞试验的系统执行 2.5% 胶凝体缩进使用 11 µm 球状探测的琼脂糖。 因为在此浓度的琼脂糖胶凝体比细胞僵硬,更加僵硬的探测必须使用,即与 0.5-5 N/m. 弹簧常数。 在本例中从 mikromasch 的一个 NSC 悬臂 (使用了 4 N/m)。 对应的 E 与凹进曲线在显示大约 36 kPa 的最终 E 表 10 显示。 此值很好与这个文件 (图 1) 一致。

在 2,5% 琼脂糖胶凝体的图 10. E 与为强制距离曲线计算的凹进曲线被采取使用与 4 个 N/m. 弹簧常数的 11 µm 球状探测。 最终 E 是大约 36 kPa

结论

竟管那些限制赫兹设计是一个有用和常用的方法表示生物范例机械性能象细胞的。 有应该记住例如这个范例的适应范围或构成的有些问题。 生物范例经常显示黏弹性工作情况,并且他们是不同类的,即包括不同的 “材料”用不同的有弹性属性。 要确切认识要素是正确地由的结果描述的它是最重要相识这个范例和足够调整参数。

就所有这些问题将帮助产生合理和再现结果而论。

JPK NanoWizard®II 或与专用的范例持有人的组合 CellHesion®200,象 PetriDishHeater™BioCell™,提供方法得到弹性数据 (在许多中其他数据类型) 为生物范例。 另外 JPK IP 软件通过所有步骤帮助这个用户获取的曲线为处理的赫兹做准备并且为这个年轻的模数提供一个易用计算器。

来源: JPK 仪器

关于此来源的更多信息请参观 JPK 仪器

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:46

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