利用原子力显微镜来确定JPK仪器，生物样品的弹性性能

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讨论主题

简介
赫兹模型
需要考虑的问题
样本性质
适合范围
探头的选择
压痕实验的范例
探头的制备
执行压痕实验
数据处理
测试系统
结论

简介

使用纳米压痕的原子力显微镜（AFM）已成为一个有用的工具，以确定生物样品（图1）弹性模量等弹性性能。悬臂服务允许本地测试样细胞或组织小型和不均匀样品的软nanoindenters。要计算的各种型号的利益参数的使用，但其中大部分都是基于赫兹模式和扩展，以配合有关压头“形状或样品的厚度的实验条件。

图1。针对不同的生物材料的杨氏模量的概述

在不同的领域，如癌症和发育生物学，细胞的纳米力学分析变得越来越重要。在正常和恶性细胞的刚度差异和转移潜能与减少细胞刚度的变化也可以被标记。确定斑马鱼胚层祖细胞皮层紧张僵硬的ecto，中观和内胚层祖细胞中发现的差异。从发育生物学领域的另一个例子是增长基材的力学性能测试。此应用程序显示矩阵弹性的细胞谱系规范的重要作用。不仅细胞，而且他们的外环境的组成部分已经过测试，其机械性能，如胶原纤维[17]。这种方法的潜力被广泛应用在生物和其他学科来描述不同的矩阵和材料的弹性性能。

这份报告介绍了弹性实验用原子力显微镜技术的应用和收购。最常用的模型概述，赫兹模型，并给出的假设和使用生物样品限制的详细讨论。

赫兹模型

赫兹模式近似于占领无限延长的半空间各向同性和线弹性固体样品。此外，它是假设压头不变形，有没有额外的压头和样品之间的相互作用。如果这些条件得到满足的样品的杨氏模量（E）可安装或使用赫兹模型计算。要指定几个参数描述样品和压痕探针的属性。

图2。首页 - 压痕实验示意图。悬臂走向一个距离z（高度（测））样品。悬臂弯曲成相反的方向（X），而样本是由缩进。最后一个是计算的高度（测量值）减去悬臂偏转。底部 - 悬臂的弯曲（X）推导出针尖样品分离（力量压痕曲线）的高度校正的原理图。

由压痕测量获得的数据（强制光谱模式）通常武力对压电位移，而不是提示样本分离的地块。要申请赫兹模式，曲线图2解释，需要转换。

赫兹模型假定在比较样品的厚度可忽略的压痕，压痕深度进行优化。赫兹模型是有效的小凹痕（说高达5-10％的单元格的高度，也许200-500纳米）的基板不影响计算。可能有压痕深度的限制，如果笔尖形状模型是一个近似值。通常情况下，抛物线模型是使用压头是一个球体，因为它更容易，以适应和近似是合理的小凹痕。 JPK IP软件提供了自动拟合这里显示所有的压头形状，所以不再有任何需要，使这种近似。

需要考虑的问题

赫兹模式不是真正的满足，如果细胞或其他生物样品研究的几个假设。

在本节中讨论这些偏差，如何使最可靠的测量。

样本性质

赫兹模型假设绝对的弹性行为，以及样本的同质性。但大多数生物材料既不是同质的，也不是绝对的弹性。压头提供的能量是不完全由一个细胞（因为这将是一个绝对的弹性材料做），但由于粘性和塑性行为，也出现滞后之间的延伸和消散，收回力曲线的一部分（图3）。粘性行为的可变性变得可见，如果不同的缩进速度进行测试。负荷率越高，规模较小的压痕和明显的刚度越高。描述了这个行为的时间尺度的松弛时间和每个粘性/粘弹性材料的不同。使用附近的弛豫时间的速度，将导致较低的力量，因为细胞的物质有时间从缩进探头。更高的速度在一个较高的样品材料的电阻和整体互动的结果是更有弹性（力与压痕，而不是速度在第一阶段）。一般情况下，最好留在这个参数一致，每个实验有相同的初始条件。但它不应该忘记，每一种材料或细胞类型有其自身的弛豫时间，因为它们可以在其组成（原子核的大小，细胞骨架等组成）大大不同。

图3。队距离曲线上生活的CHO细胞（扫描速度5微米/秒）。跟踪（红色）和回扫（暗红色）曲线清楚地表明滞后，由于细胞的粘性和塑性行为。

样品的不均匀性也可能会导致文物如根据压痕深度的杨氏模量的变化，即根据压头实际上是紧迫的，细胞有各种组件（如glycocalix，膜扩展，细胞核或细胞器）的层或组件可以反映不同的刚度。接触点也遭受探头从这些变化和相互作用和样品表面或分子表面覆盖。常常表现出这样的曲线，其中E是计算要弱于样品确实是一个很浅的接触点。因此，只有“真正的”样品的刚度测量时探头达到浅部的曲线，经过适当的表面。然后，适合不匹配部队压痕曲线（图4）的接触点。但这并不奇怪，因为赫兹模型假定同质化的样品和样品和探测器之间没有相互作用。最后，它始终是重要的，把重点放在曲线，表示要调查的结构的一部分。

图4。力与压痕曲线来自一个单元格，装有赫兹模型。相同的曲线拟合200纳米（顶部）的缩进，并在整个缩进范围为400纳米（底部）第二。显然，通过两种不同的层次探头推以来的第一条曲线拟合的联络点，从第二条曲线的接触点是不同的。第一条曲线，描述细胞表面的刚度，E模块是16千帕左右，第二条曲线，可以被假定为TE E模块的细胞质中，约35千帕，一个。

适合范围

同样重要的是找到合适的范围，是被用来产生最佳弹性计算和可重复性的结果。上述E部分所述的强烈波动，在非常低的接触点周围缩进的，但达到了增加缩进高原终于再次增加主要是由于基板的刚度，（载玻片等，参见图5，底部）。因此缩进结构的高度，大力加以考虑。赫兹模型只是小凹痕有效（比如高达5-10％的细胞，也许200-500纳米的高度）基板不影响计算和压痕的几何形状的几何匹配压头。如赫兹以上部分所述，最好的办法，以找到最佳范围是记录一个相对较高的压痕力距离曲线，以适应相应的力量压痕曲线的每个点发送。绘制超过压痕发送显示的缩进，当E开始趋于一个定值，应使用确定的杨氏模量（图5中）。

但它可能发生，没有明显的高原，尤其是当缩进不均匀的样品。以上使用一个相对较小的压头（例如金字塔）的核心的测试，如果一个细胞，例如，原子核可以从探头下溜走，结果是减少了测量的弹性模量的权利后，原子核是由探头推（图5，顶部）。

图5。发送一个CHO细胞与压痕曲线进行了探讨与锥体压头在不同的地区：正上方附近的原子核（顶），该地区未来核（中）和细胞（底部）的边缘。以上的细胞核内（顶部）这里只是短暂表示原子核的刚度测试。显然细胞核然后推开减少E.探测一个相对同质的区域（中）透露，即使在250纳米左右开始细胞质的压痕。小区边缘的（底部）的缩进，导致第二，电子基板依赖性增加开始在相对较低的缩进的。

所有三个曲线图5来自相同的细胞，并用相同的探头完全相同的条件下采取的。即使有没有明显的“第二届”在E增加，因此玻璃基板的效果没有明显的或典型的双上肢发送与压痕曲线的提示，从细胞中心到边缘明显的刚度增加，显示影响基板。但是，这并不奇怪，因为在细胞核的细胞高度测量5微米左右，在周围约1.3微米的细胞核在0.5微米左右的边缘，。最后，这些结果表明，基板的效果是不是E的发送与压痕曲线内增加，但也只增加E值在细胞较薄的地区可见。

探头的选择

应该使用哪一个悬臂取决于样品的刚度。作为一个经验法则，可以牢记刚度悬臂应围绕样品刚度的范围。对于细胞是非常柔软细腻，柔软的弹簧常数约10-30分钟/ M悬臂应使用。对于像琼脂糖凝胶更高的弹簧常数（30-100分钟/米或以上）的围追堵截样品是合适的。

另一点要考虑的是压头形状的选择。对于软的生物样品，建议使用球形探头以来的力施加到一个更广泛的样本区域会比如果一个尖锐的锥体或锥尖的情况下，结果在一个较低的压力。这种样品的方式渗透是可以避免的。但是，这不是唯一的理由喜欢球形压头。 （细胞核，细胞骨架的组成部分，细胞器不同的组件组成的细胞或组织很不均匀，...).这种不均匀材料的产量一般的印象比较大的压头如20微米珠都是有益的。

，收益率更高的分辨率，例如测试单细胞或不同的细胞部分，或增加压力来缩进更严厉的材料小直径珠（1-10微米，根据所需的分辨率）可用于。球并不总是最好的解决办法。如果样品是非常小的尺寸的或不同的地区，如果要在更高的分辨率测试（高于一微米）锥体氮化硅提示可替代。当然等更多或更少锋利的提示的一个缺点是，他们可以穿透样品，从而导致不​​准确的杨氏模量（一般的刚度下降）计算。

但另一方面，他们不太阻碍了像蜂窝扩展或残留物，从比领域的glycocalix延伸结构。球形压头往往觉得这样的扩展，结果是一个很浅的接触点，是非常难以确定（这也是为什么它应安装的原因）。一个更一般的问题，与细胞发生扭曲力曲线，主要是作为一个“肩”（图6）在接触区域显示。这些扭曲可以接触来自小的结构，如应力纤维或膜扩展，然后滑离探头，导致了第二个联络点。

图6。扭曲延长使用2微米的球形压痕在CHO细胞采取曲线。

压痕实验的范例

在这个例子中，工作流，以获得生活的CHO细胞的杨氏模量是描述。 CellHesion ® 200 ，装上蔡司光学显微镜（AxioObserver），是用来准备的球形探头，这是将要使用以及执行压痕实验CellHesion ® 200是一个新的原子力显微镜的装置，专门开发，以满足细胞粘附和力学测试的需要。一个PetriDishHeater™是用来作为样品架，因为细胞在WPI的培养皿中生长。保持细胞生理条件下，在整个实验期间（37 ° C，HEPES缓冲介质）。

探头的制备

球形压头可以从专门的供应商购买Novascan（0.6-25微米的玻璃球，以悬臂）的粒子探测器一样，或者他们可以通过自制的悬臂上的粘合领域。对于这样的目的无针尖悬臂非常适合。如果使用提示悬臂必须采取护理，尤其是在小球连接。这是因为球会附加到一侧的尖端，而不是结束，这样的提示，仍会有对实验的影响，特别是如果选择的球体直径小于针尖高度。硅悬臂的提示到15微米左右。因此，无针尖悬臂，将是更好的选择，或至少氮化硅悬臂其中有较短的秘诀（可达5微米）。

在这个例子中，一个无针尖悬臂附加硅球（直径11微米）（箭头的TL1，纳米世界，K = 0.03牛顿/米）被用作压痕探针（图7）。两部分的环氧树脂，硅珠悬臂，但像其他光学胶生物相容性粘合剂也非常适合。这可以很容易地做准备载玻片上存入一个部分和相邻的部分环氧领域。如果珠子悬浮在液体中，跌幅是幻灯片上，晒干。也可以用一双干净的镊子将其转移到幻灯片干珠，或传播珠的解决方案。少量的环氧树脂是传播速度非常薄附近使用刀片或枪头珠。

图7。 11微米的连接领域的无针尖悬臂

悬臂必须先浸入环氧树脂。一种方法是在清洁地区的玻璃表面。然后在悬臂的针尖对环氧修补使用的定位螺丝和运行的力量光谱测量浸入胶水提示的边缘位置。设定值约0.5至1 V应该足够了。如果有太多的胶水上的提示，它可以流过的珠，并嵌入。为了防止这种情况，一个或更多的光谱测量应在一个干净的玻璃面积。这将删除多余的胶水。最后，附上一个球体，另一种力量曲线是运行在一个球体定位的提示。

执行压痕实验

微探头被安装和通常的原子力显微镜头对齐。 WPI的培养皿中含有壁CHO细胞被安装到培养皿加热器和温度设置为37 ° C悬臂然后校准，即确定要能够准确地指定的力量被应用到样品的弹簧常数。使用NanoWizard ®或CellHesion200 ®校准经理JPK的SPM软件导致用户通过校准过程中，装修范围内，线性接触部分的力量曲线（硬盘基片上采取），并确定与弹簧常数计算的灵敏度热噪声的方法。一旦校准完成后，所需的设定点力，可进入在牛顿（通常是微型或纳米牛顿）。现在可以开始实验。

采取了上述不同细胞的细胞核直接的部队距离曲线。相对较高的设定值（4 nN个），因为这些细胞的力学性能不明。延长/收回的速度被设置到5μm/ s和闭环。

数据处理

JPK IP软件提供了来自力曲线运行通过几个步骤（图8）的杨氏模量的可能性。所有的操作都​​被应用到延长曲线，因为它（正常或至少在流体）包含没有像粘附的相互作用，使接触点是不可能的决心。处理的第一步是删除任何偏移或倾斜的曲线，并找到接触点。因此，选项“减去基线”和“接触点”被选中。这是没有必要的，以确定确切的联系点或基线偏移，因为它们是变量的拟合参数，并没有任何影响的拟合结果。从基线，因为这是不赫兹适合的一部分，应删除任何倾斜。下一步的“正确的高度为悬臂梁弯曲”，这一特点压痕深度计算压电运动和垂直偏转悬臂长度单位之间的差异。现在的曲线一个准备与赫兹模型拟合得到的杨氏模量。其它值，如安装“接触点”和合适的质量参数“剩余的RMS”，也显示出来。

图8。操作得到的杨氏模量从力曲线。第一步是删除任何偏移或倾斜从基线，并找到接触点。为了优化接触点的决心，可以平滑的曲线。接下来关键的一步是要减去弯曲的悬臂式压电运动产生压痕，即称为尖样品分离创建一个新的渠道。最后赫兹模式可以适用。压头的几何形状，以及被指定为泊松比（生物样品，可在0.5左）和数据的范围，要安装。

如果许多曲线，有可能使用批量处理，其中描述的所有操作都可以应用到一批曲线（一个文件夹内）。

批量处理之前，它是有用的详细考察几个曲线，找到最佳的适应范围，然后将其应用到所有曲线。因此适应范围应逐步增加，直到模量E对一个恒定值趋向。图9从CHO细胞衍生的杨氏模量是绘制在上压痕的依赖。在这里，e开始，需时约700-800纳米压痕深度的不断值。如果研究曲线的数组，使用批处理，这个值应该用于合适的范围。当然适合的质量应该总是通过直接在曲线或比较残余RMS使用批处理时生成的结果文件，这也是书面检查。

图9。发送与一个CHO细胞的压痕曲线。在约700纳米压痕E水平恒定的范围内（约450帕）。

测试系统

杨氏模量往往是用来描述细胞和其他样品的机械性能。在许多情况下，打算做这样的试验，比较的结果与其他研究人员所产生的其他数据，。通过文献中梳理，总能找到类似的实验，E值之间的差异，但使用不同的设备进行。为了评估系统是如何工作的，但也获得一个开始具有弹性已经使用了类似的系统描述的样本通常是有用的技术和处理的感觉。琼脂糖或聚乙烯醇聚合物凝胶welldescribed样品，经常被用来描述弹性测量的原则。

为了测试细胞实验系统进行2.5％琼脂糖凝胶缩进使用11微米的球形探头。由于在此浓度的琼脂糖凝胶是比细胞更严厉，更严厉的探头都必须使用，如弹簧常数为0.5-5 /米在这个例子中，一个由mikromasch（4个N / M）国科会悬臂使用。相应的e与压痕曲线如图10所示，显示约36千帕的最后发送。同意此值与文献（图1）。

图10。 Ë与压痕曲线计算距离在2.5％琼脂糖凝胶的力量曲线，使用11微米的球形探头，与4个N /米的弹簧常数最后E是36千帕左右

结论

在一定的局限性，但赫兹模式是一个有用的和常用的方法来表达生物样品（如细胞）的力学性能。有一些问题，如合适的范围或样品的组成应该牢记。生物样品往往显示粘弹行为，他们是不均匀的，即由不同的“材料”，具有不同的弹性性能。确切地知道到底是哪一个组件描述成为熟悉样品，并适当调整参数，它是最重要的结果。

考虑到所有这些问题将有助于产生合理的和可重复性的结果。

JPK NanoWizard ® II或CellHesion ® 200结合专门的样品架一样，PetriDishHeater ™ 或BioCell ™，提供必要的手段来获取生物样品的弹性数据（其中包括许多其他数据类型）。此外JPK IP软件可以帮助用户通过所有步骤赫兹处理，以备收购曲线，并提供了一个易于使用的杨氏模量的计算器。

资料来源：JPK仪器

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