使用基本強制顯微學確定生物範例有彈性屬性由 JPK 儀器

包括的事宜

簡介
赫茲塑造
將考慮的問題
範例屬性
適合的範圍
探測的選擇
凹進實驗的示例
探測的準備
執行凹進實驗
數據處理
測試系統
結論

簡介

使用基本強制 nanoindentation 的顯微鏡湧現了,當確定有彈性屬性的有用的工具喜歡生物範例的 (圖 1) 彈性模數。 懸臂擔當虛擬 nanoindenters 允許小和不同類的範例局部測試像細胞或組織的。 要計算利息多種設計的參數使用,但是大多數在赫茲設計基礎上并且延伸符合關於這個範例的受託代購商的形狀或厚度的試驗條件。

年輕的模數的圖 1. 概覽不同的生物材料的

對細胞的 Nanomechanical 分析變得愈加重要用像癌症和發展生物的不同的域。 找到在正常和惡性細胞的僵硬上的區別並且在變形的潛在上的變化與越來越少的蜂窩電話僵硬可以被標記。 確定 zebrafish 胚葉祖先細胞外皮緊張顯示了在 ecto, meso 和內胚層的祖先細胞的僵硬上的區別。 從發展生物的域的另一個示例是增長基體機械測試。 此應用顯示了矩陣彈性的重要角色細胞後裔說明的。 不僅他們的細胞外環境細胞,而且要素,像膠原原纖維為他們的機械性能 [17] 被測試了。 此方法潛在是用途廣泛在生物並且其他學科描述不同的矩陣和材料有彈性屬性。

使用 AFM 技術,此報表描述彈性實驗的應用和購買。 赫茲設計提供這個最常用的設計概覽,并且假定和發生限制為與生物範例的使用詳細討論。

赫茲塑造

赫茲設計接近這個範例作為佔用一個無限延伸的休息平臺的一種各向同性和線性有彈性固體。 此外假設,受託代購商不可變性,并且沒有受託代購商和範例之間的另外的交往。 如果這些情況符合使用這個赫茲波的設計,這個範例的年輕的模數 (e) 可以適合或被計算。 描述範例和凹進探測的屬性的幾個參數必須指定。

圖 2. 頂的草圖凹進實驗。 懸臂被移動朝這個範例由距離 z ((被評定的) 高度)。 這個範例由 ä,縮進懸臂彎曲到這個相反的方向 (x)。 最終 ä 通過減去懸臂式偏折計算從這個高度 (被評定)。 底層 - 高度的更正的概要懸臂式彎曲的 (x) 的能派生技巧範例分隔 (強制凹進曲線)。

凹進評定得到的數據 (強制分光學模式) 通常是強制劇情壓力位移,而不是打翻範例分隔。 要運用赫茲設計,曲線需要被轉換按照圖 2. 說明。

赫茲設計假設凹進是 neglectable 與範例厚度比較,因而凹進深度必須被優選。 赫茲設計為小的凹進是有效的 () 请說 5-10% 這個細胞的高度,可能 200-500 毫微米這個基體不影響計算的地方。 如果技巧形狀設計是近似值,可能有另外的限制凹進深度。 通常使用拋物面設計,如果受託代購商是範圍,因為適合是更加容易的,并且這個近似值為小的凹進是合理的。 JPK IP 軟件提供顯示的所有受託代購商形狀的自動配件這裡,那麼那裡不再是所有需要做此近似值。

將考慮的問題

赫茲設計做正確地沒有滿足的幾個假定,如果細胞或其他生物範例被檢查。

在此部分這些偏差討論和如何做最可靠的評定。

範例屬性

赫茲設計假設這個範例的绝對有彈性工作情況以及同質性。 但是多數生物材料不是同類和绝對有彈性的。 細胞不完全地產生受託代購商提供的這個能源 (因為它將由一份绝對彈性材料完成),但是由於也出現的黏和塑料工作情況消散,當在延伸和強制之間的縮回零件的遲滯現象彎曲 (圖 3)。 這個黏工作情況的若不同可變性成為可視凹進速度被測試。 越高貸款利率,越小凹進和越高明顯的僵硬。 描述此工作情況的時間表是弛豫時間并且為每黏/黏彈性材料是不同的。 使用在弛豫時間附近的速度,因為細胞材料有時間移動遠離縮進的探測,導致更低的強制。 更高的速度導致高電阻範例材料,并且整體交往是更加有彈性的 (強制是在與不是凹進,速度的階段)。 一般堅持一致在此參數有每個實驗的同樣最初的條件是最佳的。 但是不應該忘記每個材料或細胞類型有其自己的弛豫時間,因為他們在他們的構成 (細胞骨架等) 的中堅力量,構成的範圍可以非常地變化。

在一個生存 CHO 細胞 (掃描速度 5 µm/s) 的圖 3. 強制被採取的距離曲線。 跟蹤 (紅色) 并且由於這個細胞的黏和塑料工作情況折回 (深紅) 清楚曲線顯示遲滯現象。

這個範例的多相性可能也導致像這個年輕的模數的差異的人工製品根據凹進深度,即根據層或要素受託代購商實際上壓入。 細胞有可能反射另外僵硬的多種要素 (像 glycocalix、膜擴展名、中堅力量或者細胞器)。 聯繫人地點也遭受包括表面探測的這些差異和交往和範例表面或者分子。 這樣曲線經常顯示 E 比這個範例確實被計算虛擬的一個非常淺聯繫人地點。 這個範例的 「實際」僵硬只因而被評定,當探測到達是在曲線以後的淺部分的適當的表面時。 然後適應不符合強制凹進曲線 (圖 4) 的聯繫人地點。 因為赫茲設計假設範例和沒有交往的同質性範例和探測之間,但是這不驚奇。 終於,集中在表示這個結構您要調查的曲線部分總是重要的。

圖 4. 強制與從細胞派生的凹進曲線,符合赫茲設計。 同樣彎曲首先適合了對凹進 200 毫微米 (頂層) 和其次在全部的凹進範圍的 400 毫微米 (底層)。 明顯地,因為第一曲線的適合的聯繫人地點是與第二曲線的聯繫人地點不同,探測通過二塊不同層推進了。 第一曲線的 E 模塊,描述細胞表面的僵硬,是大約 16 kPa,那個第二曲線,可以假設是細胞質的 te E 模塊,大約 35 kPa。

適合的範圍

並且重要的是查找将使用產生彈性計算的最佳和再現結果的適應範圍。 正如在 E 上的部分所描述嚴格動搖在非常低凹進在聯繫人地點附近,但是伸手可及的距離隨著再終於增加的凹進的增加一個高原,主要由於基體僵硬 (載玻片等,參見圖 5,底層)。 因而這個縮進的結構的高度嚴格将考慮。 赫茲設計為小的凹進只是有效的 () 请說 5-10% 這個細胞的高度,可能 200-500 毫微米這個基體不影響計算的地方,并且凹進的幾何符合受託代購商的幾何的地方。 正如上面赫茲部分所描述,這個最佳的方式查找這個最佳範圍將記錄與相對地高凹進的強制距離曲線和適合對應的強制凹進曲線的每點的 E。 在凹進的密謀 E 顯示凹進,當 E 開始趨向於往應該用於確定這個年輕的模數的一個恆定的值時 (圖 5,中間)。

但是它可能發生沒有明顯的高原,特別是當縮進不同類的範例時。 使用相對地小的受託代購商 (即金字塔),例如如果細胞上面這個中堅力量被測試,這個中堅力量可能滑倒遠離在探測下,并且這個結果是這個被評定的模數的減少,在這個中堅力量由探測之後 (圖 5,頂層) 推進。

圖 5. E 與 CHO 細胞的凹進曲線探查與金字塔形受託代購商在不同的地區: 正確在這個中堅力量 (頂層),這個區域上在這個中堅力量旁邊 (中間) 和请臨近這個細胞 (底層) 的邊緣。 測試上面這個中堅力量 (頂層) 這裡臨時只表示這個中堅力量的僵硬。 明顯地這個中堅力量然後推開造成 E. Probing 減少開始在 250 毫微米前後的細胞質的甚而相對地同源區域 (中間) 顯示的凹進。 細胞邊緣 (底層) 的凹進導致一秒鐘, E 開始在相對地低凹進的基體從屬的增量。

全部三曲線圖 5 從同一個細胞派生和採取了與同一探測在同一個條件下。 即使沒有在 E 和因而沒有玻璃基體的作用的明顯或典型的暗示的明顯的 「其次」增量兩的上面的 E 與凹進曲線,明顯的僵硬的增量從細胞中心的到邊緣指示基體的影響。 但是這不是驚奇,因為細胞的高度在這個中堅力量的被評定是大約 5 µm,在包圍這個中堅力量是大約 1.3 µm 和在這個邊緣在 0.5 µm 附近。 最終這些結果向顯示這個基體的作用是不僅可視的由 E 增量在 E 內的與凹進曲線,而且通過增加 E 值在細胞的更加稀薄的地區。

探測的選擇

應該使用哪個懸臂取決於這個範例的僵硬。 根據經驗一個人可能記住懸臂的僵硬應該是在範例僵硬附近的範圍。 对是非常軟和精美的最軟的懸臂可用對彈簧常數大約的細胞應該使用 10-30 个 mN/m。 對於像瓊脂糖膠凝體更高的彈簧常數的更加僵硬的範例 (30-100 个 mN/m 或更多) 请是適當的。

要考慮的另一點是受託代購商形狀的選擇。 對於軟的生物範例推薦使用球狀探測,因為強制比實際情形被應用於一更寬的範例區,如果使用一個鋒利的金字塔形或圓錐形技巧,導致低壓。 這個範例的此方式滲透被防止。 但是這不是唯一的原因更喜歡球狀受託代購商。 細胞或組織是非常不同類的,包括不同的要素 (中堅力量、 cytoskeletal 要素,細胞器…)。 要產生這樣不同類的材料相對地大受託代購商的一個通用印象像 20 個 µm 小珠请是有用。

可以使用要產生更加高分辨率,即對測試單細胞或不同的細胞零件,或者增加壓縮進小的直徑更加僵硬的材料小珠 (1-10 µm,根據期望解決方法)。 範圍總是不是這個最佳的解決方法。 如果這個範例是非常小的維數或若不同區是將被測試在更加高分辨率的 (高於一微米) 金字塔形氮化硅技巧可以是替代。 當然缺點的這樣更或較不鋒利的技巧是該他們可能擊穿這個範例和因而導致這個年輕的模數 (一般減少的不正確的計算僵硬)。

另一方面,但是他們由像蜂窩電話擴展名的延長從 glycocalix 的結構或殘滓比範圍妨害。 球狀受託代購商經常感覺這樣擴展名,并且這個結果 是非常難確定 (也是這個原因的一個非常淺聯繫人地點為什麼應該適合它)。 發生與細胞的一個更加通用的問題是誤解的強制曲線,主要被顯示,因為 「肩膀」在聯絡區域 (圖 6)。 這些畸變可能從與小的結構的聯絡派生像壓力纖維或膜擴展名,然後滑倒遠離探測,導致第二個聯繫人地點。

圖 6. Distorted 延伸在 CHO 細胞採取的曲線使用 2 µm 球狀受託代購商。

凹進實驗的示例

在本例中派生居住的 CHO 細胞的年輕的模數的工作流被描述。 CellHesion® 200,掛接在蔡司光學顯微鏡 (AxioObserver),用於準備打算使用以及執行凹進實驗 CellHesion® 200 是一個新的 AFM 基於設備,完全被發展適應測試蜂窩電話黏附力和機械工的需要的球狀探測。 因為細胞在 WPI 培養皿,增長 PetriDishHeater™使用了作為範例持有人。 在全部的實驗 (37°C, HEPES 緩衝的媒體) 期間,細胞在生理情況下被保留了。

探測的準備

球狀受託代購商可能或者從像微粒探測的特殊提供者被採購從 Novascan (0.6-25 µm 玻璃範圍附加懸臂),或者他們可以是自創通過膠合在懸臂的範圍。 對於這樣目的 tipless 懸臂请是非常合適的。 必須保重,如果使用有技巧的懸臂,特別是如果小的範圍附上。 這,因為這個範圍將附有這個技巧的端,而不是在這個末端,因此這個技巧將有對這個實驗的影響,特別是如果選擇的範圍直徑比技巧高度是較少。 硅懸臂有大約 15 µm 技巧。 因而有更短的技巧的 tipless 懸臂是更好的選擇或至少氮化硅懸臂 (5 µm)。

对此示例一個 tipless 懸臂 (箭頭 TL1, NanoWorld, k = 0.03 N/m) 與一個附上硅土範圍 (直徑 11 µm) 使用了作為凹進探測 (圖 7)。 如光學粘合劑也是非常合適的,硅土小珠附有了有兩部分環氧的懸臂,但是其他生物適合的粘合劑。 這可能由準備範圍在一部分和環氧存款在一個相鄰部分的顯微鏡幻燈片容易地完成。 如果小珠在液體被暫停,下落在這張幻燈片放置并且被烘乾。 一個對乾淨的鑷子可能也用於調用在這張幻燈片上的乾燥小珠,或者分佈小珠解決方法。 使用刀片或吸移管技巧,然後少量的環氧在小珠附近非常稀薄地被塗。

圖 7. 有附屬的一個 11 微米範圍的 Tipless 懸臂

必須首先浸洗懸臂到環氧。 途徑在玻璃的一個乾淨的區域完成查找表面。 然後這個懸臂式技巧確定在這個環氧補丁程序的邊緣使用確定的螺絲,并且強制分光學評定運行浸洗這個技巧到膠漿。 調整點大約 0.5 到 1 个 V 應該是滿足的。 如果有在這個技巧的許多膠漿它可能漫過這個小珠和埋置它。 要防止此,在一乾淨的玻璃區應該進行一個或更多另外的分光學評定。 這將取消超額膠漿。 終於,附有範圍,另一強制曲線運行與這個技巧確定在範圍。

執行凹進實驗

微球體探測被掛接并且對齊和平常一樣在 AFM 題頭。 包含依附 CHO 細胞的 WPI 培養皿被掛接到培養皿加熱器,并且這個溫度被設置了對 37°C。 懸臂然後被校準,即彈簧恆定確定能正確地指定將適用的強制於這個範例。 使用 NanoWizard® 或 CellHesion200® JPK SPM 軟件的定標經理通過定標進程導致這個用戶,計算區分通過適合強制曲線 (採取在一個困難基體) 在線性聯絡零件內和確定恆定的彈簧與熱量噪聲方法。 一旦定標是完全的,期望調整點強制在牛頓可以被輸入 (通常 pico- 或納諾牛頓)。 現在這個實驗能開始。

強制距離曲線直接地上面不同的細胞中堅力量被採取了。 相對地使用了高 setpoints (4 nN),因為這些細胞機械性能是未知的。 這個擴展名/縮回速度被設置了對 5 个 µm/s,并且使用了閉合電路。

數據處理

JPK IP 軟件產生這個可能性從運行強制的曲線派生這個年輕的模數通過幾個步驟 (圖 8)。 所有運算必須適用於延伸曲線從它 (通常或至少在流體) 不包含使確定聯繫人地點不可能的交往,如黏附力。 處理的第一步將去除所有抵銷或掀動從曲線和查找聯繫人地點。 所以選項 『減去草擬』,并且 『查找聯繫人地點』将被選擇。 正確地確定聯繫人地點是不重要的或草擬抵銷了這裡,因為他們是可變的適應參數,并且沒有對適應結果的任何影響。 因為這不作為赫茲適應的部分應該從草擬取消所有掀動。 下一個步驟是 『彎曲的懸臂的正確的高度』,通過採取這個區別計算凹進深度在壓力移動和懸臂式垂直的偏折之間在長度部件的功能。 現在曲線準備好符合赫茲設計派生年輕的模數。 其他值,例如適合的 「聯繫人地點」和適應質量參數 「殘餘的 RMS」也被顯示。

圖 8. 派生年輕的模數的運算從強制曲線。 第一步將去除所有抵銷或掀動從草擬和查找聯繫人地點。 為了優選聯繫人地點確定可以使光滑曲線。 下個和關鍵的步驟將從這個壓力移動減去懸臂式彎曲產生凹進的,即稱技巧範例分隔的一條新的通道被創建。 最終赫茲設計可以是應用的。 受託代購商的幾何将指定以及可以被留下在 0.5 生物範例的) 的泊松的比例 (和將適合的數據範圍。

如果許多曲線被記錄了有使用批處理的這個可能性所有被描述的運算可以適用於批曲線的地方 (在一個文件夾之內)。

在批處理前,較詳細地檢查一些曲線查找可能然後被運用於所有曲線的最佳的適應範圍是有用的。 所以, E 模數趨向於往一個恆定的值,應該逐步地增加適應範圍。 在表 9 從 CHO 細胞派生的這個年輕的模數在對凹進的依賴性被密謀。 這裡採取恆定的值的 E 起始時間在 700-800 毫微米前後凹進深度。 如果檢查一一些曲線,使用批處理,應該為適應範圍使用此值。 當然應該通過比較在結果文件也寫下被生成,當使用批處理時的殘餘的 RMS 總是檢查適應的質量通過查看直接地曲線或。

圖 9. E 與 CHO 細胞的凹進曲線。 在對一個恆定的範圍 (大約 450 的 700 個毫微米凹進 E 級別前後 Pa)。

測試系統

這個年輕的模數是常用的描述細胞和其他範例機械性能。 在許多情況下這個意圖執行這樣實驗將結果與其他數據比較,導致由其他研究員。 梳通過這個文件一總是查找相似的實驗的 E 值之間的差異,但是執行使用不同的設備。 要評估這個系統如何運作,而且獲取這個技術的一種感覺和處理它經常是有用從彈性已經描述了與一個相似的系統的範例開始。 聚合物膠凝體像瓊脂糖或聚乙烯醇的 是常用的描述彈性評定的原則的 welldescribed 範例。

要測試這個細胞試驗的系統執行 2.5% 膠凝體縮進使用 11 µm 球狀探測的瓊脂糖。 因為在此濃度的瓊脂糖膠凝體比細胞僵硬,更加僵硬的探測必須使用,即與 0.5-5 N/m. 彈簧常數。 在本例中從 mikromasch 的一個 NSC 懸臂 (使用了 4 N/m)。 對應的 E 與凹進曲線在顯示大約 36 kPa 的最終 E 表 10 顯示。 此值很好與這個文件 (圖 1) 一致。

在 2,5% 瓊脂糖膠凝體的圖 10. E 與為強制距離曲線計算的凹進曲線被採取使用與 4 个 N/m. 彈簧常數的 11 µm 球狀探測。 最終 E 是大約 36 kPa

結論

竟管那些限制赫茲設計是一個有用和常用的方法表示生物範例機械性能像細胞的。 有應該記住例如這個範例的適應範圍或構成的有些問題。 生物範例經常顯示黏彈性工作情況,并且他們是不同類的,即包括不同的 「材料」用不同的有彈性屬性。 要確切認識要素是正確地由的結果描述的它是最重要相識這個範例和足够調整參數。

就所有這些問題將幫助產生合理和再現結果而論。

JPK NanoWizard®II 或與專用的範例持有人的組合 CellHesion®200,像 PetriDishHeater™BioCell™,提供方法得到彈性數據 (在許多中其他數據類型) 為生物範例。 另外 JPK IP 軟件通過所有步驟幫助這個用戶獲取的曲線為處理的赫茲做準備并且為這個年輕的模數提供一個易用計算器。

來源: JPK 儀器

關於此來源的更多信息请請參觀 JPK 儀器

Date Added: Jan 16, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:49

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