الجمع بين التصوير الضوئي وفؤاد من الخلايا باستخدام مجهر القوة الذرية NanoWizard من الصكوك JPK

: : AZoNanotechnology المادة

الموضوعات التي تغطيها

مقدمة
خلايا الميلانوما الماوس صفتها مع YFP
الليفية
علاج الخلايا الليفية
ملخص

مقدمة

الجمع بين التصوير الضوئي وفؤاد من الخلايا يفتح احتمالات كثيرة لربط المعلومات حول الهيكلية سطح الخلية مع وضع العلامات وظيفية لعناصر معينة. مدينة دبي للإنترنت وبرنامج التحصين الموسع ، باستخدام مضان في هذا التقرير ، وترد أمثلة فؤاد مجتمعة مع المجهر الضوئي على النقيض المرحلة ، NanoWizard JPK ® فؤاد شنت على المجهر الضوئي Axiovert زايس 200 المقلوب.

كتطبيق وجه الخصوص ، تم علاج الخلايا مع بيروكسيد الهيدروجين للحث على blebbing أفكارك. الجمع بين التصوير الضوئي ويسمح فؤاد أفضل تفسير للصلات القائمة بين التغيرات التي طرأت على سطح الغشاء كما شكل حويصلات ، وبنية الهيكل الخلوي أكتين تحتها.

خلايا الميلانوما الماوس صفتها مع YFP

في المثال الأول ، تم استخدام الماوس خط خلية الجلد الثانوية (B16). في هذا الخط خلية ، وكان المسمى أكتين مع الاصفر ببروتين (YFP). كانت الخلايا هدية عينية من الدكتور كليمنس فرانز (الخليوي مجموعة الآلات ، Biotechnologisches ZENTRUM ، TU درسدن).

الخلايا في هذه الخلية هي خط المحمول وخاصة لا تلتزم بشكل جيد لأنها تنمو ، لذلك كانت ثابتة لهما قبل التصوير. تم علاج الخلايا مع غلوتارالدهيد 2 ٪ فقط 45 ثانية ، لتقليل مساهمة مضان من غلوتارالدهيد ، وكانت ثابتة ثم الخلايا لمدة 20 دقيقة في بارافورمالدهيد 4 ٪.

وتظهر الصور الضوئية للخلية B16 في الشكل 1. لوحة العلوي صورة النقيض من المرحلة التي تم الحصول عليها باستخدام الغمر بالماء 20X الهدف. اللوحة السفلى ويبين مضان YFP في منطقة بالقرب من حافة الخلية ، وكان الحصول عليها باستخدام الانغماس النفط عدسة 63x (NA 1.2). التسميات YFP في مونومرات أكتين ، لذلك هناك بعض المساهمة في إشارة الفلورسنت من السيتوبلازم وكذلك من شعيرات أكتين.

الشكل 1. صور الضوئية ماوس خلية سرطان الجلد. العلوي الصورة -- على النقيض المرحلة ، 20X عدسة الغمر بالمياه. صورة أقل -- من مضان YFP المسمى أكتين ، 63x عدسة غمر النفط. تتميز المنطقة التي تغطيها صورة مضان مع مربع في الصورة العليا.

ونفذ فؤاد التصوير من الخلايا في حل PBS Dulbecco ل. لتصوير فؤاد ، كان يستخدم النمط المتقطع الاتصال ، مع الثلاثي الكابولي نيتريد السيليكون التي كان لها الربيع ثابتة نحو 0.3 غ / م في وضع اتصال متقطعة ، وجهاز استشعار فؤاد تتأرجح على سطح العينة ، ويتم استخدام السعة من التذبذب للسيطرة على الماسح الضوئي. هذا الوضع يعطي صورا طبوغرافية كل من سطح الخلية والصور من إشارة السعة ، والتي تبرز التفاصيل الدقيقة للسطح الخلية.

ويبين الشكل 2 مقارنة بين الصور البصرية وفؤاد من حافة الخلية B16 الماوس سرطان الجلد. لوحة العلوي صورة YFP مضان ، كما في الشكل (1) ، واللوحة السفلى هو المونتاج اثنين من صور فؤاد إشارة السعة. ويرتبط إشارة إلى السعة فؤاد التدرج في تضاريس كما غيض بفحص فوق السطح. وهذا يعني أن يظهر مظلل الصور ، كما لو كان يضيء تضاريس من جانب ، وتعتبر أصغر تفاصيل السطح بشكل واضح بشكل خاص. كما تتميز منطقة العينة في الشكل 1 ، ولكن صورة مضان تم تدويرها لتسهيل المقارنة مع الصور فؤاد. شريط الحجم هو 2 ميكرومتر في كل اللوحات.

الشكل 2. تصوير سرطان الجلد B16 الخلية باستخدام الماوس JPK NanoWizard ® شنت على Axiovert زايس مجهر ضوئي 200 المقلوب. لوحة العلوي -- YFP مضان. اللوحة السفلى -- المونتاج اثنين من صور فؤاد إشارة السعة في المنطقة نفسها. السهام -- أمثلة من شعيرات أكتين ينظر في كل اللوحات. خاتم -- مثال من الميزات تقريب على سطح الخلية ، وينظر فقط في الصور فؤاد. مقياس بار 2 ميكرون في كل اللوحات.

منذ YFP جميع التسميات أكتين (مونومرات وخيوط) ، هو المسمى ضعيف السيتوبلازم في صورة مضان ، فضلا عن خيوط الأكتين. يمكن رؤية خيوط الأكتين أكبر في كل من فؤاد والصور الضوئية مضان (يتم وضع علامة مثالين في الشكل 2 مع السهام). فؤاد الصور تظهر تفاصيل أخرى من سطح الخلية ، ومع ذلك ، التي لا تظهر في الصورة مضان ، مثل مجموعة من الميزات تقريب ملحوظ مع عصابة بيضاء في الشكل 2. في الجانب الأيسر من لوحة يظهر فؤاد بشكل خاص بنية السطح الذي يختلف تماما عن نمط من الهيكل الخلوي أكتين الكامنة.

الليفية

ونمت الخلايا الليفية الماوس الجلدي coverslips على الزجاج. تم إصلاح الخلايا مع غلوتارالدهيد 2 ٪ لمدة 45 ثانية ثم بارافورمالدهيد 4 ٪ لمدة 20 دقيقة ، أما بالنسبة للخلايا سرطان الجلد الماوس. وfluorescently المسمى على شعيرات الأكتين التي تفرخ الخلايا بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع phalloidin - FITC ، ومصنعين في التعليمات. وقد التقط هذه الخلايا في محلول PBS Dulbecco ل. وقد تم جمع الصور مضان على النحو الموصوف أعلاه ، وذلك باستخدام الغمر النفط 63x العدسة وFITC تعيين المرشح.

الشكل 3 يوضح صورة ضوئية من الخلايا الليفية معزولة. صورة تظهر مضان من شعيرات أكتين المسمى. وبقوة أكبر من المسمى أكتين لYFP في الشكل 1 ، والهيكل الخلوي في الخلايا الليفية أكثر تطورا من سرطان الجلد للخلية ، وبالتالي فإن الكابلات أكتين تبرز بشكل واضح في الصورة مضان.

الشكل 3. بصري صورة الخلية الليفية الماوس الجلدي. مضان من FITC - phalloidin أكتين المسمى. ويظهر في المنطقة التي تحمل علامة على المربع الأبيض في الشكل 4.

الصور في الشكل 4 تظهر كل منطقة من حافة الخلية التي وضعت مع مربع في الشكل 3. كانت الصورة البصرية مضان (أ) تناوب لتسهيل المقارنة مع الصور فؤاد (B ، مونتاج من صورتين إشارة السعة وجيم ، مونتاج من الصور الطوبوغرافية اثنين) من نفس المنطقة.

الشكل 4. المقارنة بين الصور البصرية وفؤاد لالليفية باستخدام JPK NanoWizard ®. ج : أكتين fluorescently المسمى (phalloidin - FITC). ب : مونتاج من صورتين فؤاد إشارة السعة. C : المونتاج اثنين من الصور الطوبوغرافية فؤاد. شريط مقياس 2 ميكرومتر في كل شيء ، مجموعة من الصور فؤاد ارتفاع 1.8 ميكرون.

ونتوءات غرامة في حدود الخلية (التي تحمل السهام البيضاء) بصوت ضعيف مرئية في الصورة مضان (A) ، ولكن لا يمكن حلها بشكل واضح في الصور فؤاد (B ، C). ميزات اخرى معزولة في سطح الخلية مرئية فقط في الصور فؤاد (على سبيل المثال ، ميزة كبيرة ملحوظ مع رأس السهم الأسود).

وفؤاد والصور الضوئية تعطي معلومات تكميلية هنا عن سطح كل من الخلايا والهياكل غشائي جزئيا. صور فؤاد يعطي كلا الحقيقي 3 - D المعلومات حول شكل خلية (من إشارة الطبوغرافيا) وانطباع جيد للهياكل على سطح الخلية (من إشارة السعة). الجمع بين المعلومات البصرية والهيكلية يسمح التعرف على مكونات الخلية الأساسية ولا سيما هياكل غشاء الخلية.

علاج الخلايا الليفية

لإثبات وجود طلب على المعلومات المختلفة التي يتوفر من هذا المزيج من تقنيات الفحص المجهري ، ودراسة موجزة للآثار أفكارك من بيروكسيد الهيدروجين (H ₂ O ₂₎ على الخلايا الليفية هي المعروضة هنا.

تم علاج الخلايا الليفية الماوس الجلدي مع تركيزات منخفضة من بيروكسيد الهيدروجين لبدء سلسلة موت الخلية. وحضنت الخلايا المعالجة مع 100 ميكرومتر بيروكسيد الهيدروجين لمدة 30 دقيقة أو ساعة واحدة ، قبل أن يتم إصلاح وأكتين الخيطية fluorescently المسمى كما هو موضح أعلاه من أجل التصوير القياسية.

وتعطى لمحة عامة عن النتائج في الشكل رقم 5 لخلايا التحكم (أي علاج ، صورة سلسلة AC) والخلايا تعامل مع بيروكسيد الهيدروجين لمدة 15 دقيقة (صورة سلسلة مدافع) أو 30 دقيقة (GI). الصور تظهر على طول كل صف تقنيات التصوير المختلفة للعينة الخلية نفسها. على النقيض من المرحلة (A ، D ، G) ، وبرنامج التحصين الموسع flurorescence - (B ، E ، H) تظهر الصور منطقة العينة نفسها. تتميز المنطقة للصور طبوغرافية فؤاد (C ، F ، I) في الصور الضوئية مع مربع. كانت منطقة المسح الضوئي للصور فؤاد 20 ميكرون × 20 ميكرون في كل حالة.

الشكل 5. مجموعة من الصور الضوئية والخلايا الليفية فؤاد تعامل مع بيروكسيد الهيدروجين. سلسلة معارض الصور AC الخلايا ntrol (رقم ₂ H ₂ O العلاج) ، مدافع يظهر الخلايا التي تم التعامل مع 100 ميكرومتر H ₂ O ₂ لمدة 30 دقيقة قبل التثبيت ، ويظهر - I الخلايا التي عولجت لمدة ساعة قبل التثبيت. على النقيض من الصور المرحلة (A ، D ، G) ، وبرنامج التحصين الموسع ومضان من TC - phalloidin شعيرات أكتين المسمى (B ، E ، H) تظهر نفس منطقة المسح الضوئي لكل حالة. فؤاد الطبوغرافيا الصور (C ، F ، I) هي 20 متر 20 ميكرومتر بمسح في كل حال ، للمنطقة التي تحمل مربع في الصور الضوئية السابقة. مقياس الارتفاع الإجمالي للC F د هو 2.3 ميكرون في كلتا الحالتين ، ومقياس الارتفاع الإجمالي في الأول هو 9 ميكرومتر. ونفذ فؤاد التصوير في وضع الاتصال به الكابولي DNP شحذ مع N الربيع 0،06 ثابت / م.

ويمكن رؤية الكابلات أكتين بارز في جميع الصور الثلاث (ميلان) للسيطرة على الخلايا غير المعالجة. بالإضافة ، يمكن أن ينظر إلى الحويصلات في مرحلة الصورة النقيض من ذلك ، التي تترابط مع نتوءات على سطح الخلية في الصور الطوبوغرافية فؤاد (على سبيل المثال ، واحدة حلقت في C).

بعد العلاج لمدة 30 دقيقة مع ميكرومتر 100 H ₂ O ₂ ، بدأت خيوط الأكتين إلى التراجع عن حواف الخلايا. صورة مضان E يظهر في تلوين باهتة في محيط الخلية ، ولكن يمكن أن يكون أكثر وضوحا من التفاصيل ينظر في الصورة المقابلة فؤاد (F). وغادر المنطقة من غشاء مسطحة نسبيا على هامش (التي تحمل علامة السهم في F) التي لديها بنية شبكة غرامة الداعمة لها ، ولكن ألياف الأكتين بارز لم يعد يمتد إلى حافة الخلية.

الخلايا تعامل مع H ₂ O ₂ لمدة ساعة واحدة تدل على تغيير جذري في التشكل الخلية ، وإعادة ترتيب كاملة من الهيكل الخلوي أكتين. وقد تراجع الخلايا وتصبح دائرية ، يتم تخفيض الكابلات أكتين الفقاعات وبدأت تتشكل على سطح الأرض.

الفقاعات في شكل كبير هياكل ثلاثية الأبعاد -- مقياس الارتفاع الكلي للصور في كل من فؤاد C و F هو 2.3 ميكرون ، بينما يتراوح ارتفاع للصورة الماضي (الأول) هو 9 ميكرومتر. قياسات AFM سماح قياس الكمي للتغيير في ارتفاع الخلايا كما تصل جولات ، ويمكن تحليل السطح لالفقاعات ، وحجم عدد أو شكل أو حجم. بالمقارنة مع الصورة في مضان H يبين الهيكل الخلوي أكتين الكامنة وراء هياكل فقاعة.

ملخص

وقد قدم هذا التقرير بعض الاحتمالات في الجمع بين مختلف تقنيات التصوير الضوئي مع فؤاد لدراسة مورفولوجية الخلية والردود. الجمع بين تقنيات يوسع نطاق المعلومات التي يمكن جمعها حول بنية الخلية ووظيفتها. يمكن أن يكون المسمى جزيئات محددة على سطح الخلية أو في الأجزاء الأساسية للخلية ، وتصوير لاستكشاف العلاقة بينهما إلى التشكل من سطح الخلية وهياكل معينة. ويمكن القيام بهذه التحقيقات في ظل الظروف الفسيولوجية ، أو حتى على الخلايا الحية ، والفرص الجديدة الحالية لتحليل العلاقة بين الهياكل المادية وظيفة الخلوية.

المصدر : آلات JPK

لمزيد من المعلومات عن هذا المصدر ، يرجى زيارة الآلات JPK