Kombinierte optische und AFM Imaging von Zellen mit NanoWizard Atomic Force Microscope von JPK Instruments

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Einführung
Maus-Melanom-Zellen mit YFP Labelled
Fibroblasten
Behandelte Fibroblasten
Zusammenfassung

Einführung

Die Kombination optischer und AFM Bildgebung von Zellen eröffnet viele Möglichkeiten zur Korrelation strukturelle Informationen über die Zelloberfläche mit funktionellen Kennzeichnung bestimmter Komponenten. In diesem Bericht Beispiele für AFM mit optischer Mikroskopie für Phasenkontrast kombiniert werden gezeigt, DIC und Auflicht-Fluoreszenz mit einem JPK NanoWizard ® AFM montiert auf einem Zeiss Axiovert 200 invertierten optischen Mikroskop.

Da eine bestimmte Anwendung, wurden die Zellen mit Wasserstoffperoxid behandelt, um Apoptose zu induzieren blebbing. Die Kombination von optischen und AFM ermöglicht eine bessere Interpretation der Zusammenhänge zwischen den Veränderungen in der Membran-Oberfläche wie Bläschen bilden, und die Struktur des Aktin-Zytoskeletts unter ihnen.

Maus-Melanom-Zellen mit YFP Labelled

Im ersten Beispiel wurde ein Maus-Melanom sekundäre Zelllinie (B16) verwendet. In dieser Zelllinie wurde die Aktin mit gelb-fluoreszierenden Protein (YFP) markiert. Die Zellen wurden freundlicherweise von Dr. Clemens Franz (Cellular Machines Group, Biotechnologisches Zentrum, TU Dresden).

Die Zellen in dieser Zelllinie sind besonders mobil und nicht gut haften, wie sie wachsen, so waren sie vor dem bildgebenden fixiert. Die Zellen wurden mit 2% Glutaraldehyd für nur 45 Sekunden behandelt, zur Minimierung der Fluoreszenz-Beitrag aus dem Glutaraldehyd, und die Zellen wurden dann für 20 Minuten in 4% Paraformaldehyd fixiert.

Optische Bilder eines B16-Zelle sind in Abbildung 1 dargestellt. Der obere Teil ist eine Phasenkontrast-Bild unter Verwendung eines 20x Wasserimmersionsobjektiv. Das untere Feld zeigt die YFP-Fluoreszenz einer Region in der Nähe der Zelle Rand und wurde unter Verwendung einer 63x Ölimmersion (NA 1,2). Die YFP-Etiketten die Aktin-Monomeren, so gibt es einen Beitrag zum Fluoreszenzsignal aus dem Zytoplasma sowie aus Aktin-Filamenten.

Abbildung 1. Optische Bilder von einem Maus-Melanom-Zellen. Bild oben - Phasenkontrast, 20x Wasser Immersionslinse. Unteres Bild - Fluoreszenz von YFP-markierten Aktin, 63x Ölimmersion. Die Region von der Fluoreszenz-Bild bedeckt ist mit einer Box im oberen Bild markiert.

AFM der Zellen erfolgte in Dulbecco PBS-Lösung durchgeführt. Für AFM wurde Wackelkontakt Modus verwendet, mit dreieckigen Siliziumnitrid Ausleger, die eine Federkonstante von etwa 0,3 N / m. hatte In Wackelkontakt Modus schwingt der AFM-Sensor auf der Oberfläche der Probe, und die Amplitude der Schwingung wird verwendet, um den Scanner zu steuern. Dieser Modus gibt sowohl Topographie Bilder von der Zelloberfläche und Bilder aus dem Amplitudensignal, die die feineren Details der Zelloberfläche zu markieren.

Abbildung 2 zeigt einen Vergleich der optischen und AFM-Aufnahmen von der B16 Maus-Melanom-Zellen Kante. Der obere Teil ist ein YFP-Fluoreszenz Bild, wie in Abbildung 1 und die untere Platte ist eine Montage aus zwei AFM Amplitudensignal Bilder. Die AFM Amplitudensignal ist die Steigung der Topographie Zusammenhang als die Spitze Scans über die Oberfläche. Dies bedeutet, dass die Bilder im Schatten erscheinen, als ob die Topographie von der Seite beleuchtet wird, und die kleineren Details der Oberfläche sind besonders deutlich zu erkennen. Der Probenraum ist wie in Abbildung 1 markiert, aber die Fluoreszenz-Bild gedreht hat zur leichteren Vergleich mit den AFM-Aufnahmen gewesen. Der Maßstab ist 2 pm in beiden Panels.

Abbildung 2. B16 Maus-Melanom-Zellen aufgenommen mit JPK NanoWizard ® auf Zeis Axiovert 200 invertierten optischen Mikroskop montiert. Oberes Feld - YFP-Fluoreszenz. Das untere Feld - Montage von zwei AFM Amplitudensignal Bilder von der gleichen Region. Pfeilspitzen - Beispiele von Aktin-Filamenten in beiden Panels gesehen. Ring - beispielsweise von gerundeten Merkmale auf der Zelloberfläche, sondern nur in den AFM-Aufnahmen zu sehen. Maßstab 2 um in beiden Panels.

Da die YFP Etiketten aller Aktin (Monomere und Filamente), ist das Zytoplasma schwach in der Fluoreszenz-Bild, sowie die Aktin-Filamenten versehen. Die größeren Aktin-Filamente können sowohl im AFM und die optische Fluoreszenz-Bildern (zwei Beispiele sind in Abbildung 2 mit Pfeilspitzen markiert) zu sehen. Die AFM-Bilder zeigen weitere Details der Zelloberfläche, jedoch tun, die nicht in der Fluoreszenz-Bild, wie die Gruppe der abgerundeten Funktionen mit einem weißen Ring in Abbildung 2 markiert erscheinen. Die linke Seite der AFM-Panel zeigt insbesondere Oberflächenstruktur, die ganz anders als das Muster des zugrunde liegenden Aktin-Zytoskelett ist.

Fibroblasten

Maus Hautfibroblasten wurden auf Deckgläschen gewachsen. Die Zellen wurden mit 2% Glutaraldehyd für 45 Sekunden und dann 4% Paraformaldehyd für 20 Minuten fixiert, wie für die Maus-Melanomzellen. Die Aktin-Filamente wurden Fluoreszenz durch Inkubation der Zellen über Nacht bei 4 ° C mit Phalloidin-FITC markiert, wie pro Anweisungen des Herstellers. Die Zellen wurden in Dulbecco PBS-Lösung abgebildet. Fluoreszenz-Bilder wurden gesammelt, wie oben beschrieben, mit einem 63x Ölimmersion und FITC-Filter eingestellt.

Abbildung 3 zeigt ein optisches Bild eines isolierten Fibroblasten. Das Bild zeigt die Fluoreszenz von markierten Aktin-Filamente. Die Aktin stärker ist als für die YFP in Abbildung 1 gekennzeichnet, und das Zytoskelett der Fibroblasten mehr als für die Melanomzellen entwickelt, so dass die Aktin-Kabel zeichnen sich deutlich in der Fluoreszenz-Bild.

Abbildung 3. Optische Aufnahme einer Maus Hautfibroblasten Zelle. Fluoreszenz von FITC-Phalloidin markiertes Aktin. Der Bereich mit dem weißen Feld markiert ist in Abbildung 4 dargestellt.

Die Bilder in Abbildung 4 zeigen alle im Bereich der Zell-Kante, die mit einem Kasten in Abbildung 3 angegeben ist. Die optische Fluoreszenz-Bild (A) gedreht wurde zum Vergleich mit den AFM-Aufnahmen (B, Montage von zwei Amplitudensignal Bilder und C, Montage von zwei Topographie Bilder) aus dem gleichen Bereich zu erleichtern.

Abbildung 4. Vergleich von optischen und AFM-Aufnahmen eines Fibroblasten mit JPK NanoWizard ®. A: fluoreszenzmarkierten Aktin (Phalloidin-FITC). B: Montage von zwei AFM Amplitudensignal Bilder. C: Montage von zwei AFM Bilder. Maßstab 2 um in allem ist Höhenbereich von AFM-Bild 1,8 um.

Die feinen Vorsprünge an der Zellgrenze (markiert mit weißen Pfeilspitzen) sind schwach sichtbar in der Fluoreszenz-Bild (A), kann aber deutlich in der AFM-Bilder aufgelöst werden (B, C). Andere isolierte Merkmale auf der Zelloberfläche sind nur in den AFM-Aufnahmen (z. B. die große Funktion mit einem schwarzen Pfeil markiert).

Die AFM-und optische Bilder hier geben ergänzende Informationen sowohl über die Oberfläche der Zelle und submembranous Strukturen. Die AFM-Aufnahmen geben auch echte 3-D Informationen über die Zellform (von der Topographie-Signal) und einen Eindruck von den feinen Strukturen an der Zelloberfläche (aus dem Amplitudensignal). Die Kombination von optischen und strukturellen Informationen ermöglicht die Identifizierung der zugrunde liegenden zellulären Komponenten insbesondere Zellmembran Strukturen.

Behandelte Fibroblasten

Um zu demonstrieren, eine Anwendung für die verschiedenen Informationen, die aus dieser Kombination von Mikroskopie-Techniken, eine kurze Studie über die apoptotische Wirkung von Wasserstoffperoxid (H ₂ O ₂₎ auf die Fibroblasten-Zellen wird hier vorgestellt.

Die Maus Fibroblasten wurden mit geringen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid zu einem Zelltod-Kaskade initiieren behandelt. Die behandelten Zellen wurden mit 100 uM Wasserstoffperoxid entweder für 30 Minuten oder eine Stunde, bevor sie fixiert und die filamentösen Aktin fluoreszenzmarkierten wie oben für die Standard-Bildgebung beschrieben inkubiert.

Eine Übersicht der Ergebnisse ist in Abbildung 5 für Kontroll-Zellen (keine Behandlung, Bildserien AC) und Zellen mit Wasserstoffperoxid für 15 Minuten (Bildserien DF) oder 30 Minuten (GI) behandelt gegeben. Die Bilder entlang jeder Reihe zeigen verschiedene bildgebende Verfahren für die gleiche Zelle Probe. Die Phasenkontrast-(A, D, G) und epi-flurorescence (B, E, H) Bilder zeigen die gleiche Probe-Bereich. Die Region für die AFM Bilder (C, F, I) ist in der optischen Bilder mit einem Kasten markiert. Der Scan-Bereich für die AFM-Aufnahmen wurden 20 um x 20 um in jedem Fall.