Kombinierte Optische und FLUGHANDBUCH-Darstellung von Zellen Unter Verwendung des AtomKraft-Mikroskops NanoWizard von JPK-Instrumenten

Themen Umfaßt

Einleitung
MausMelanom-Zellen Beschriftet mit YFP
Fibroblasten
Behandelte Fibroblasten
Zusammenfassung

Einleitung

Optische und FLUGHANDBUCH-Darstellung Kombination die von Zellen erschließen viele Möglichkeiten für die Übereinstimmung von strukturellen Informationen über die Zelloberfläche mit der Funktionskennzeichnung von bestimmten Bauteilen. In diesem Bericht werden Beispiele von FLUGHANDBUCH gezeigt, das mit optischer Mikroskopie für Phasenkontrast, DIC kombiniert wird und Epifluoreszenz unter Verwendung eines JPK NanoWizard® FLUGHANDBUCHS, das an einem Zeiss Axiovert 200 montiert wurde, wandelte optisches Mikroskop um.

Als bestimmte Anwendung wurden Zellen mit Wasserstoffperoxid behandelt, um das apoptotic Blebbing zu verursachen. Die Kombination der optischer und FLUGHANDBUCH-Darstellung erlaubt bessere Interpretation der Links zwischen den Änderungen in der Membranoberfläche, während Bäschen sich bilden, und der Zelle des Actin Cytoskeleton unter ihnen.

MausMelanom-Zellen Beschriftet mit YFP

Im ersten Beispiel wurde eine Mäusemelanomsekundärzellform (B16) verwendet. In dieser Zellform wurde das Actin mit gelb-Leuchtstoffprotein beschriftet (YFP). Die Zellen waren ein nettes Geschenk von Dr. Clemens Franz (Zelluläre Maschinen-Gruppe, Biotechnologisches Zentrum, TU Dresden).

Die Zellen in dieser Zellform sind besonders beweglich und befolgen nicht gut, da sie wachsen, also waren sie vor Darstellung örtlich festgelegt. Die Zellen wurden mit 2% Glutaraldehyd für nur 45 Sekunden behandelt, um den Fluoreszenzbeitrag vom Glutaraldehyd herabzusetzen, und die Zellen wurden dann für 20 Minuten in 4% Paraformaldehyd geregelt.

Optische Bilder einer Zelle B16 werden in Abbildung 1. gezeigt. Das obere Panel ist ein Phasenkontrastbild, das unter Verwendung eines Immersionslernziels des Wassers 20x erhalten wird. Die Unterschale zeigt die YFP-Fluoreszenz einer Region nahe dem Zellrand und wurde unter Verwendung eines Ölkapselungsobjektivs 63x (NA 1,2) erreicht. Das YFP beschriftet die Actinmonomeren, so gibt es irgendeinen Beitrag zum Leuchtstoffsignal vom Zytoplasma sowie von den Actinfäden.

Abbildung 1. Optische Bilder von einer Mäusemelanomzelle. Oberes Bild - teilen Sie Kontrast, Immersionsobjektiv des Wassers 20x in Phasen ein. Senken Sie Bild - Fluoreszenz von YFP-beschriftetem Actin, Ölkapselungsobjektiv 63x. Die Region, die durch das Fluoreszenzbild abgedeckt wird, wird mit einem Kasten im oberen Bild markiert.

FLUGHANDBUCH-Darstellung der Zellen wurde in Dulbeccos PBS-Lösung durchgeführt. Für FLUGHANDBUCH-Darstellung wurde zeitweiliger Kontaktmodus, mit dreieckigen Silikonnitridkragbalken verwendet, die eine Federkonstante von herum 0,3 N/m. hatten. Im zeitweiligen Kontaktmodus oszilliert der FLUGHANDBUCH-Fühler über der Oberfläche der Probe, und die Amplitude der Oszillation wird verwendet, um den Scanner zu steuern. Dieser Modus gibt Topographiebilder der Zelloberfläche und Bilder vom Amplitudensignal, die die feineren Details der Zelloberfläche markieren.

Abbildung 2 zeigt einen Vergleich von optischen und FLUGHANDBUCH-Bildern des Melanom-Zellrandes der Maus B16. Das obere Panel ist ein YFP-Fluoreszenzbild, wie in Abbildung 1, und die Unterschale ist eine Montage von zwei FLUGHANDBUCH-Amplitudensignalbildern. Das FLUGHANDBUCH-Amplitudensignal hängt mit der Steigung der Topographie zusammen, während die Spitze über der Oberfläche scannt. Dies heißt, dass die Bilder beschattet aussehen, als ob die Topographie von der Seite beleuchtet wird, und die kleineren Details der Oberfläche werden besonders offenbar gesehen. Die Versuchsfläche ist, wie in Abbildung 1 markiert, aber das Fluoreszenzbild ist für einfacheren Vergleich mit den FLUGHANDBUCH-Bildern rotiert worden. Der Maßstabsbalken ist µm 2 in beiden Panels.

Abbildung 2. Melanomzelle die Maus B16, die unter Verwendung JPK NanoWizard® montiert wurde an Zeis Axiovert 200 abgebildet ist, wandelte optisches Mikroskop um. Oberes Panel - YFP-Fluoreszenz. Unterschale - Montage von zwei FLUGHANDBUCH-Amplitudensignalbildern der gleichen Region. Pfeilspitzen - Beispiele von den Actinfäden gesehen in beiden Panels. Ring - Beispiel von aufgerundeten Merkmalen auf der Zelloberfläche, gesehen nur in den FLUGHANDBUCH-Bildern. Maßstabsbalken 2 µm in beiden Panels.

Da das YFP alles Actin (Monomeren und Fäden) beschriftet, wird der Zytoplasma schwach im Fluoreszenzbild sowie in den Actinfäden beschriftet. Die größeren Actinfäden können im FLUGHANDBUCH und in den optischen Fluoreszenzbildern (zwei Beispiele werden in Abbildung 2 mit Pfeilspitzen markiert) gesehen werden. Die FLUGHANDBUCH-Bilder zeigen andere Details der Zelloberfläche jedoch die nicht im Fluoreszenzbild erscheinen, wie der Gruppe von den aufgerundeten Merkmalen, die mit einem weißen Ring in Abbildung 2. markiert werden. Die linke Seite des FLUGHANDBUCH-Panels zeigt besonders Oberflächenzelle, die zu dem Muster des zugrunde liegenden Actin Cytoskeleton ziemlich unterschiedlich ist.

Fibroblasten

Mäusehautfibroblasten wurden auf Glasdeckgläsern gewachsen. Die Zellen wurden mit 2% Glutaraldehyd für 45 Sekunden und dann 4% Paraformaldehyd für 20 Minuten, was die Mäusemelanomzellen anbetrifft geregelt. Die Actinfäden wurden Leuchtstoff beschriftet, indem man über Nacht die Zellen an 4°C mit phalloidin-FITC, gemäß der Herstellerausbildung ausbrütete. Die Zellen waren in Dulbeccos PBS-Lösung abgebildet. Fluoreszenzbilder wurden montiert, wie, unter Verwendung eines Ölkapselungssets des objektivs 63x und FITC-Filters oben beschrieben.

Abbildung 3 zeigt ein optisches Bild eines getrennten Fibroblasts. Das Bild zeigt die Fluoreszenz von den beschrifteten Actinfäden. Das Actin wird stärker als für das YFP in Abbildung 1 und den Cytoskeleton des Fibroblasts beschriftet, der als für die Melanomzelle entwickelt wird, also stehen die Actinkabel heraus offenbar im Fluoreszenzbild.

Abbildung 3. Optisches Bild von einer Mäusehautfibroblastzelle. Fluoreszenz von FITC-phalloidin beschriftete Actin. Der Bereich, der mit dem weißen Kasten markiert wird, wird in Abbildung 4. gezeigt.

Die Bilder in Abbildung 4 alle zeigen die Region des Zellrandes, der mit einem Kasten in Abbildung 3. markiert wird. Das optische Fluoreszenzbild (a) ist rotiert worden, um Vergleich mit den FLUGHANDBUCH-Bildern (B, Montage von zwei Amplitudensignalbildern und von C, Montage von zwei Topographiebildern) des gleichen Bereiches zu ermöglichen.

Abbildung 4. Vergleich von optischen und FLUGHANDBUCH-Bildern eines Fibroblasts unter Verwendung JPK NanoWizard®. A: Leuchtstoff beschriftetes Actin (phalloidin-FITC). B: Montage von zwei FLUGHANDBUCH-Amplitudensignalbildern. C: Montage von zwei FLUGHANDBUCH-Topographiebildern. Maßstabsbalken 2 µm in allen, Höhenreichweite von FLUGHANDBUCH-Bild ist µm 1,8.

Die feinen Vorsprünge am Zellenrand (markiert mit weißen Pfeilspitzen) sind schwach im Fluoreszenzbild (a) sichtbar, aber können in den FLUGHANDBUCH-Bildern (B, C) offenbar gelöst werden. Andere getrennte Merkmale an der Zelloberfläche sind- in den FLUGHANDBUCH-Bildern nur sichtbar (zum Beispiel, das große Merkmal markiert mit einer schwarzen Pfeilspitze).

Das FLUGHANDBUCH und die optischen Bilder hier geben ergänzende Informationen über die Oberfläche der Zelle und die submembranous Zellen. Die FLUGHANDBUCH-Bilder geben wirkliche 3-D Informationen über die Zellform (vom Topographiesignal) und einen Eindruck der Feinstrukturen an der Zelloberfläche (vom Amplitudensignal). Die Kombination von optischen und strukturellen Informationen erlaubt das Kennzeichen der zugrunde liegenden bestimmten Zellmembranzellen der zellulären Bauteile.

Behandelte Fibroblasten

Um eine Anwendung zu der unterschiedlichen Information zu zeigen die von dieser Kombination von Mikroskopietechniken erhältlich ist, wird eine kurze Studie der apoptotic Effekte des Wasserstoffperoxids (22HO) auf die Fibroblastzellen hier dargestellt.

Die Mäusehautfibroblasten wurden mit niedrigen Konzentrationen des Wasserstoffperoxids behandelt, um ein Zelltodschubumkehrgitter zu initialisieren. Die behandelten Zellen wurden mit 100 µM Wasserstoffperoxid entweder 30 Minuten oder eine Stunde lang ausgebrütet, vor Sein örtlich festgelegt und dem faserigen Actin, das Leuchtstoff beschriftet wurde, wie für die Standarddarstellung oben beschrieben.

Ein Überblick über die Ergebnisse wird in Abbildung 5 für Steuerzellen (keine Behandlung, Bildserie WECHSELSTROM) und die Zellen, die mit Wasserstoffperoxid für 15 Minuten behandelt werden (Bildserie DF) oder 30 Minuten (G-I) gegeben. Die Bilder entlang jeder Reihe zeigen verschiedene Abbildungstechniken für die gleiche Zellprobe. Der Phasenkontrast (A, D, G) und epi-flurorescence (B, E, H) Bilder zeigen die gleiche Versuchsfläche. Die Region für die FLUGHANDBUCH-Topographiebilder (C, F, I) wird in den optischen Bildern mit einem Kasten markiert. Der Scan-Bereich für die FLUGHANDBUCH-Bilder war µm 20 µm x 20 in jedem Fall.

Abbildung 5. Kombination von optischen und FLUGHANDBUCH-Bildern von Fibroblasten behandelte mit Wasserstoffperoxid. Bildserie WECHSELSTROM zeigt ntrol Zellen (keine HO22 Behandlung), DF zeigt Zellen, die mit µM 100 HO für 3022 Minuten vor Fixierung behandelt worden sind, und - I zeigt Zellen, die eine Stunde lang vor Fixierung behandelt worden sind. Phasenkontrastbilder (A, D, G) und Epifluoreszenz von TC-phalloidin beschrifteten Actinfäden (B, E, H) Show die selben scannen Bereich auf jeden Fall. FLUGHANDBUCH-Topographiebilder (C, F, I) sind 20 m x 20 µm Scans in jedem Fall, denn die Region, die mit einem Kasten in den vorangehenden optischen Bildern markiert wird. Die Gesamthöhenschuppe für C d F ist µm 2,3 in beiden Fällen, und die Gesamthöhenschuppe herein I ist µm 9. FLUGHANDBUCH-Darstellung wurde im Kontaktmodus unter Verwendung geschärfter DNP-Kragbalken mit Federkonstante 0,06 N/m. durchgeführt.

Vorstehende Actinkabel können in allen drei Bildern (WS) für die unbehandelten Steuerzellen gesehen werden. Darüber hinaus können Bäschen im Phasenkontrastbild gesehen werden, die mit Vorsprüngen auf der Zelloberfläche in den FLUGHANDBUCH-Topographiebildern aufeinander beziehen (zum Beispiel, das- eingekreist in C).

Nach Behandlung für 30 Minuten mit dem µM 100 HO22, haben die Actinfäden begonnen, von den Rändern der Zellen einzufahren. Das Fluoreszenzbild in E zeigt das schwache Beflecken an der Peripherie der Zelle, aber die Sonderkommandos können im entsprechenden FLUGHANDBUCH-Bild (f) offenbar gesehen werden. Eine Region der verhältnismäßig flachen Membran wird an der Peripherie gelassen (markiert mit einem Pfeil in F) die eine feinmaschige Zelle hat, sie zu unterstützen, aber die vorstehenden Actinfasern dehnen nicht mehr sich auf den Rand der Zelle aus.

Die Zellen behandelt mit HO22 für eine Stundenshow eine dramatische Veränderung in der Zellmorphologie und eine komplette Neuordnung des Actin Cytoskeleton. Die Zellen haben eingefahren und werden runder, werden die Actinkabel verringert und Blebs haben begonnen, sich auf der Oberfläche zu bilden.

Die großen dreidimensionalen Zellen des Blebsformulars - die Gesamthöhenschuppe für die FLUGHANDBUCH-Bilder in beiden C und F ist µm 2,3, während die Höhenreichweite für das letzte Bild (i) µm 9 ist. Die FLUGHANDBUCH-Maße erlauben eine quantitative Maßnahme der Änderung in der Zellhöhe, während sie oben aufrundet, und die Oberflächenblebs konnten auf Größe, Form, Zahl oder Volumen analysiert werden. Vergleich mit dem Fluoreszenzbild in H zeigt den Actin Cytoskeleton, welche den Blebzellen zugrunde liegt.

Zusammenfassung

Dieser Bericht hat einige der Möglichkeiten der Kombination von verschiedenen optischen Abbildungstechniken mit FLUGHANDBUCH für das Studieren von von Zellmorphologie und -antworten eingeführt. Die Kombination von Techniken verbreitert den Informationsumfang, der über Zellzelle und -funktion erfasst werden kann. Spezifische Moleküle auf der Zelloberfläche oder in den zugrunde liegenden Teilen der Zelle können beschriftet und abgebildet sein, um ihr Verhältnis zur Morphologie der Zelloberfläche und der bestimmten Zellen zu erforschen. Diese Untersuchungen können unter physiologischen Bedingungen oder sogar auf lebenden Zellen und anwesenden neuen Gelegenheiten erfolgt sein, das Verhältnis zwischen körperlichen Zellen und zellulärer Funktion zu analysieren.

Quelle: JPK-Instrumente

Zu mehr Information über diese Quelle besuchen Sie bitte JPK-Instrumente

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:59

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