Proyección De Imagen Óptica y del AFM Combinada de Células Usando el Microscopio Atómico de la Fuerza de NanoWizard de los Instrumentos de JPK

Temas Revestidos

Introducción
Células del Melanoma del Ratón Etiqueta con YFP
Fibroblastos
Fibroblastos Tratados
Resumen

Introducción

El Combinar óptico y proyección de imagen del AFM de células abre muchas posibilidades de correlacionar la información estructural sobre la superficie de la célula con la etiqueta funcional de ciertos componentes. En este parte, los ejemplos se muestran del AFM combinado con la microscopia óptica para el contraste de la fase, DIC y la epi-fluorescencia usando un JPK NanoWizard® AFM montado en un Zeiss Axiovert 200 invirtió el microscopio óptico.

Como aplicación determinada, las células fueron tratadas con el peróxido de hidrógeno para inducir blebbing apoptotic. La combinación de la proyección de imagen óptica y del AFM permite una mejor interpretación de las conexiones entre los cambios en la superficie de la membrana como las vesículas forman, y la estructura del citoesqueleto de la actinia debajo de ellos.

Células del Melanoma del Ratón Etiqueta con YFP

En el primer ejemplo, una variedad de células secundaria del melanoma del ratón (B16) fue utilizada. En esta variedad de células, la actinia etiqueta con la proteína amarillo-fluorescente (YFP). Las células eran un regalo bueno del Dr. Clemens Francisco (Grupo Celular de las Máquinas, Biotechnologisches Zentrum, TU Dresden).

Las células en esta variedad de células son determinado movibles y no se adhieren bien pues crecen, así que eran fijas antes de proyección de imagen. Las células fueron tratadas con el aldehído glutárico del 2% por solamente 45 segundos, para disminuir la contribución de la fluorescencia del aldehído glutárico, y las células entonces fueron reparadas por 20 minutos en paraformaldehido del 4%.

Las imágenes Ópticas de una célula B16 se muestran en el Cuadro 1. El panel superior es una imagen del contraste de la fase obtenida usando un objetivo de inmersión del agua 20x. El panel más inferior muestra la fluorescencia de YFP de una región cerca del borde de la célula y fue obtenido usando un lente de immersión en aceite 63x (NA 1,2). El YFP etiqueta los monómeros de la actinia, tan hay una cierta contribución a la señal fluorescente del citoplasma así como de filamentos de la actinia.

Cuadro 1. imágenes Ópticas de una célula del melanoma del ratón. Imagen Superior - organice el contraste, lente de la inmersión del agua 20x. Baje la imagen - fluorescencia de la actinia YFP-etiqueta, lente de immersión en aceite 63x. La región revestida por la imagen de la fluorescencia se marca con un rectángulo en la imagen superior.

La proyección de imagen del AFM de las células fue realizada en la solución del PBS de Dulbecco. Para la proyección de imagen del AFM, el modo de contacto intermitente fue utilizado, con los voladizos triangulares del nitruro de silicio que tenían un constante del muelle de alrededor 0,3 N/m. En modo de contacto intermitente, el sensor del AFM oscila sobre la superficie de la muestra, y la amplitud de la oscilación se utiliza para controlar el analizador. Este modo da las imágenes de la topografía de la superficie de la célula y las imágenes de la señal de la amplitud, que destacan los detalles más finos de la superficie de la célula.

El Cuadro 2 muestra una comparación de las imágenes ópticas y del AFM del borde de la célula del melanoma del ratón B16. El panel superior es una imagen de la fluorescencia de YFP, como en el Cuadro 1, y el panel más inferior es un montaje de dos imágenes de la señal de la amplitud del AFM. La señal de la amplitud del AFM se relaciona con el gradiente de la topografía mientras que la punta explora sobre la superficie. Esto significa que las imágenes aparecen sombreadas, como si la topografía se encienda de la cara, y los detalles más pequeños de la superficie se consideran determinado sin obstrucción. El área de la muestra está según lo marcado en el Cuadro 1, pero la imagen de la fluorescencia se ha girado para una comparación más fácil con las imágenes del AFM. La barra de la escala es el µm 2 en ambos paneles.

El Cuadro 2. célula del melanoma del ratón B16 reflejada usando JPK NanoWizard® montado en Zeis Axiovert 200 invirtió el microscopio óptico. Panel Superior - fluorescencia de YFP. Baje el panel - montaje de dos imágenes de la señal de la amplitud del AFM de la misma región. Puntas De Flecha - ejemplos de los filamentos de la actinia vistos en ambos paneles. Anillo - ejemplo de características redondeadas en la superficie de la célula, visto solamente en las imágenes del AFM. Μm de la barra 2 de la Escala en ambos paneles.

Puesto Que el YFP etiqueta toda la actinia (los monómeros y los filamentos), el citoplasma etiqueta débil en la imagen de la fluorescencia, así como los filamentos de la actinia. Los filamentos más grandes de la actinia se pueden ver en el AFM y las imágenes ópticas de la fluorescencia (dos ejemplos se marcan en el Cuadro 2 con las puntas de flecha). Las imágenes del AFM muestran otros detalles de la superficie de la célula, sin embargo, que no aparecen en la imagen de la fluorescencia, tal como el grupo de características redondeadas marcadas con un anillo blanco en el Cuadro 2. El lado izquierdo del panel del AFM muestra determinado la estructura superficial que es muy diferente del modelo del citoesqueleto subyacente de la actinia.

Fibroblastos

Los fibroblastos cutáneos del Ratón fueron crecidos en las tiras de cristal. Las células fueron reparadas con el aldehído glutárico del 2% por 45 segundos y entonces el paraformaldehido del 4% por 20 minutos, en cuanto a las células del melanoma del ratón. Los filamentos de la actinia fluorescente etiqueta incubando las células durante la noche en 4°C con el phalloidin-FITC, según instrucciones de los fabricantes. Las células eran reflejadas en la solución del PBS de Dulbecco. Las imágenes de la Fluorescencia cerco como se describe anteriormente, usando un conjunto de immersión en aceite del lente 63x y del filtro de FITC.

El Cuadro 3 muestra una imagen óptica de un fibroblasto aislado. La imagen muestra la fluorescencia de los filamentos etiqueta de la actinia. La actinia etiqueta más fuertemente que para el YFP en el Cuadro 1, y el citoesqueleto del fibroblasto desarrollado que para la célula del melanoma, así que los cables de la actinia se destacan sin obstrucción en la imagen de la fluorescencia.

Cuadro 3. imagen Óptica de una célula cutánea del fibroblasto del ratón. La Fluorescencia de FITC-phalloidin etiqueta la actinia. El área marcada con el rectángulo blanco se muestra en el Cuadro 4.

Las imágenes en el Cuadro 4 todos muestran la región del borde de la célula que se marca con un rectángulo en el Cuadro 3. La imagen óptica de la fluorescencia (a) se ha girado para facilitar la comparación con las imágenes del AFM (B, montaje de dos imágenes de la señal de la amplitud y C, montaje de dos imágenes de la topografía) de la misma área.

Cuadro 4. Comparación de las imágenes ópticas y del AFM de un fibroblasto usando JPK NanoWizard®. A: actinia fluorescente etiqueta (phalloidin-FITC). B: montaje de dos imágenes de la señal de la amplitud del AFM. C: montaje de dos imágenes de la topografía del AFM. Escale el µm en todos, rango de la barra 2 de la altura de la imagen del AFM es el µm 1,8.

Las protuberancias finas en el límite de célula (marcado con las puntas de flecha blancas) son débilmente visibles en la imagen de la fluorescencia (a), pero pueden ser sin obstrucción resueltas en las imágenes del AFM (B, C). Otras características aisladas en la superficie de la célula son solamente visibles en las imágenes del AFM (por ejemplo, la característica grande marcada con una punta de flecha negra).

El AFM y las imágenes ópticas aquí dan la información complementaria sobre la superficie de la célula y las estructuras submembranous. Las imágenes del AFM dan la información tridimensional real sobre la dimensión de una variable de la célula (de la señal de la topografía) y una impresión de las estructuras finas en la superficie de la célula (de la señal de la amplitud). La combinación de la información óptica y estructural permite la identificación de las estructuras determinadas subyacentes de la membrana celular de los componentes celulares.

Fibroblastos Tratados

Para demostrar una aplicación para la diversa información que está disponible de esta combinación de las técnicas de la microscopia, un estudio abreviado de los efectos apoptotic del peróxido de hidrógeno (HO22) sobre las células del fibroblasto se presenta aquí.

Los fibroblastos cutáneos del ratón fueron tratados con concentraciones inferiores de peróxido de hidrógeno para iniciar una cascada de la muerte celular. Las células tratadas fueron incubadas con el peróxido de hidrógeno de 100 µM para 30 minutos o una hora, antes de ser fijas y de la actinia filamentosa fluorescente etiqueta como se describe anteriormente para la proyección de imagen estándar.

Una reseña de los resultados se da en el Cuadro 5 para las células del mando (ningún tratamiento, A.C. de la serie de la imagen) y las células tratadas con el peróxido de hidrógeno para 15 minutos (serie D-F de la imagen) o 30 minutos (SOLDADO ENROLLADO EN EL EJÉRCITO). Las imágenes a lo largo de cada fila muestran diversas técnicas de proyección de imagen para la misma muestra de la célula. El contraste de la fase (A, D, G) y epi-flurorescence (B, E, H) las imágenes muestra la misma área de la muestra. La región para las imágenes de la topografía del AFM (C, F, I) se marca en las imágenes ópticas con un rectángulo. El área de la exploración para las imágenes del AFM era 20 el µm del µm x 20 en cada caso.

El Cuadro 5. Combinación de las imágenes ópticas y del AFM de fibroblastos trató con el peróxido de hidrógeno. El A.C. de la serie de la Imagen muestra las células del ntrol (ningún HO22 tratamiento), D-F muestra las células que se han tratado con el µM 100 HO22 por 30 minutos antes de la fijación, y - I muestra las células que se han tratado para una hora antes de la fijación. Imágenes del contraste de la Fase (A, D, G) y epi-fluorescencia de filamentos etiqueta TC-phalloidin de la actinia (B, E, H) demostración lo mismo explora el área para cada caso. Las imágenes de la topografía del AFM (C, F, I) son 20 m x 20 exploraciones del µm en cada caso, porque la región marcada con un rectángulo en las imágenes ópticas precedentes. La escala total de la altura para C d F es el µm 2,3 en ambos casos, y la escala total hacia adentro I de la altura es el µm 9. La proyección de imagen del AFM fue realizada en modo de contacto usando los voladizos afilados de DNP con el constante 0,06 N/m. del muelle.

Los cables Prominentes de la actinia se pueden ver en las tres imágenes (CA) para las células no tratadas del mando. Además, las vesículas se pueden ver en la imagen del contraste de la fase, que correlacionan con protuberancias en la superficie de la célula en las imágenes de la topografía del AFM (por ejemplo, la que está circundada en C).

Después del tratamiento por 30 minutos con el µM 100 HO22, los filamentos de la actinia han comenzado a retractarse de los bordes de las células. La imagen de la fluorescencia en E muestra la coloración débil en la periferia de la célula, pero los detalles pueden ser considerados más sin obstrucción en la imagen correspondiente del AFM (f). Una región de membrana relativamente plana se deja en la periferia (marcada con una flecha en F) que tenga una estructura de malla fina el utilizar de ella, solamente las fibras prominentes de la actinia extienda no más al borde de la célula.

Las células tratadas con HO22 para una demostración de la hora un cambio espectacular en morfología de la célula, y un cambio completo del citoesqueleto de la actinia. Las células se han retractado y llegan a ser más redondas, se reducen los cables de la actinia y las ampollas han comenzado a formar en la superficie.

Las estructuras tridimensionales grandes del formulario de las ampollas - la escala total de la altura para las imágenes del AFM en ambos C AND F es el µm 2,3, mientras que el rango de la altura para la imagen pasada (i) es el µm 9. Las mediciones del AFM permiten una dimensión cuantitativa del cambio en altura de la célula mientras que reúne, y las ampollas superficiales se podrían analizar para la talla, la dimensión de una variable, el número o el volumen. La Comparación con la imagen de la fluorescencia en H muestra el citoesqueleto de la actinia que es la base de las estructuras de la ampolla.

Resumen

Este parte ha introducido algunas de las posibilidades de combinar diversas técnicas de proyección de imagen ópticas con el AFM para estudiar morfología y reacciones de la célula. Combinar técnicas ensancha el rango de la información que se puede recolectar sobre la estructura y la función de célula. Las moléculas Específicas en la superficie de la célula o en las partes subyacentes de la célula pueden ser etiqueta y reflejadas para explorar su lazo a la morfología de la superficie de la célula y de las estructuras determinadas. Estas investigaciones se pueden hacer bajo condiciones fisiológicas, o aún en las células vivas, y las actuales nuevas oportunidades de analizar el lazo entre las estructuras físicas y la función celular.

Fuente: Instrumentos de JPK

Para más información sobre esta fuente visite por favor los Instrumentos de JPK

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:26

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