Yhdistetty optinen ja atomivoimamikroskoopilla Solujen käyttäminen NanoWizard atomivoimamikroskooppi mistä JPK Instruments

:: AZoNanotechnology artikla

Aiheet

Johdanto
Hiiri melanoomasoluihin Merkityt kanssa YFP
Fibroblasteista
Käsitelty fibroblasteista
Yhteenveto

Johdanto

Yhdistämällä optinen ja atomivoimamikroskoopilla solujen avaa monia mahdollisuuksia korreloivia rakenteellisia tietoa solun pinnalla ja funktionaaliset käyttöön tiettyjä osia. Tässä raportissa annetaan esimerkkejä AFM yhdistettynä optinen mikroskopia vaihe kontrasti, DIC ja epi-fluoresenssi käyttäen JPK NanoWizard ® AFM asennettu Zeiss Axiovert 200 käänteinen optisella mikroskoopilla.

Koska tietyn sovelluksen, solut hoidettiin vetyperoksidilla aiheuttaa apoptotic blebbing. Yhdistelmä optisen ja atomivoimamikroskoopilla mahdollistaa paremman tulkinnan välisistä yhteyksistä muutokset kalvon pintaan rakkulat muodossa ja rakenne aktiini tukirankansa niiden alla.

Hiiri melanoomasoluihin Merkityt kanssa YFP

Ensimmäisessä esimerkissä, hiiren melanooma toissijainen solulinjassa (B16) käytettiin. Tässä solulinja, aktiini oli merkitty keltaisella-fluoresoiva proteiini (YFP). Solut olivat eräänlainen lahja tohtori Clemens Franz (Cellular Machines Group, Biotechnologisches Zentrum, TU Dresden).

Solut tässä solulinjassa ovat erityisen liikkuvia eivätkä tartu hyvin kasvaessaan, joten ne vahvistetaan ennen kuvantaminen. Solut saivat 2% glutaraldehydiä vain 45 sekuntia, minimoida fluoresenssin panos glutaraldehydiä, ja solut olivat sitten vahvistettu 20 minuuttia 4% paraformaldehydi.

Optinen kuvia B16 solu on esitetty kuvassa 1. Yläosa on vaihe kontrasti kuva saadaan käyttämällä 20x vesiupotukseen tavoite. Alempi paneelissa näkyy YFP fluoresenssi alueen lähellä solun reunan ja saatiin käyttämällä 63x öljyssä linssi (NA 1,2). The YFP tarrat aktiini monomeerit, joten on jonkin verran osuutta fluoresenssisignaali päässä solulimassa samoin kuin aktiini hehkulankojen.

Kuva 1. Optinen kuvia hiiren melanooma solu. Ylä kuva - vaihe sijaan 20x vesiupotukseen linssi. Alempi kuva - fluoresenssi mistä YFP-merkittyä aktiini, 63x öljyssä linssi. Kattamalla alueella fluoresenssi kuva on merkitty laatikko yläkulmassa kuva.

Atomivoimamikroskoopilla solujen tehtiin Dulbecco n PBS ratkaisu. Saat atomivoimamikroskoopilla, ajoittaisen kosketuksen tila käytettiin, jossa kolmion piinitridin ulokkeet että oli jousivakio noin 0,3 N / m. Vuonna ajoittaisen kosketuksen tilassa AFM anturi värähtelee yli näytteen pinnan, ja amplitudin värähtely ohjataan skanneriin. Tämä tila antaa molemmille topografia kuvat solun pinnan ja kuvia amplitudi signaali, joka korostaa hienompaa yksityiskohtia solun pinnalla.

Kuva 2 esittää vertailun optinen ja AFM kuvia B16 hiiren melanoomaan solujen reuna. Yläosa on YFP fluoresenssi kuvan, kuten kuvassa 1, ja alaosan on montaasi kahden AFM amplitudi signaali kuvia. AFM amplitudi signaali liittyy kaltevuus topografia kuin kärki skannaa pinnalle. Tämä tarkoittaa, että kuvat näyttävät varjossa, kuin jos topografia on valaistu sivulta, ja pienempiin yksityiskohtiin pinnan nähdään erityisen selvästi. Näyte alue on merkitty kuvassa 1, mutta fluoresenssi kuva on kierretty helpompaa verrattuna AFM kuvia. Mittakaavapalkki on 2 mikrometriä molemmissa paneeleissa.

Kuva 2. B16 hiiren melanoomaan solujen mittausta käyttäen JPK NanoWizard ® asentaa Zeis Axiovert 200 käänteinen optisella mikroskoopilla. Ylähavas - YFP fluoresenssi. Alempi paneeli - montaasi kahden AFM amplitudi signaali kuvia samalla alueella. Nuolenkärkiä - esimerkkejä aktiini filamenteista nähdään molemmissa paneeleissa. Ring - esimerkki pyöristetty ominaisuuksia solun pinnalla, joka näkyy ainoastaan ​​AFM kuvia. Mittakaavapalkki 2 mikrometriä molemmissa paneeleissa.