Représentation Combinée Optique et d'AFM des Cellules Utilisant le Microscope Atomique de Force de NanoWizard des Instruments de JPK

Sujets Couverts

Introduction
Cellules de Mélanome de Souris Étiquetées avec le YFP
Fibroblastes
Fibroblastes Traités
Résumé

Introduction

La Combinaison optique et représentation d'AFM des cellules ouvrent beaucoup de possibilités pour marquer des informations structurelles sur la surface de cellules avec l'écriture de labels fonctionnelle de certains composants. Dans cet état, des exemples sont affichés de l'AFM combiné avec la microscopie optique pour le contraste de phase, DIC et l'epi-fluorescence utilisant un JPK NanoWizard® AFM monté sur Zeiss Axiovert 200 a inversé le microscope optique.

Comme application particulière, des cellules ont été traitées avec du peroxyde de hydrogène pour induire l'apoptotique blebbing. La combinaison de la représentation optique et d'AFM permet une meilleure traduction des barrettes entre les changements de la surface de la membrane pendant que les vésicules forment, et la structure du cytosquelette d'actine sous eux.

Cellules de Mélanome de Souris Étiquetées avec le YFP

Dans le premier cas, une lignée cellulaire secondaire de mélanome de souris (B16) a été utilisée. Dans cette lignée cellulaire, l'actine a été étiquetée avec la protéine jaune-fluorescente (YFP). Les cellules étaient un don aimable de M. Clemens Franz (Groupe Cellulaire de Machines, Biotechnologisches Zentrum, TURQUIE Dresde).

Les cellules dans cette lignée cellulaire sont particulièrement mobiles et n'adhèrent pas bien car elles se développent, ainsi elles étaient fixes avant la représentation. Les cellules ont été traitées avec du glutaraldéhyde de 2% pendant seulement 45 secondes, pour réduire à un minimum la cotisation de fluorescence du glutaraldéhyde, et les cellules ont été alors fixées pendant 20 mn en paraformaldéhyde de 4%.

Des images Optiques d'une cellule B16 sont affichées sur le Schéma 1. La Commission supérieure est une image de contraste de phase obtenue utilisant un objectif de submersion de l'eau 20x. La Commission inférieure affiche la fluorescence de YFP d'une région près de l'arête de cellules et a été obtenue utilisant une lentille 63x à immersion dans l'huile (NA 1,2). Le YFP étiquette les monomères d'actine, tellement il y a une certaine cotisation au signe fluorescent du cytoplasme ainsi que des filaments d'actine.

Le Schéma 1. images Optiques d'une cellule de mélanome de souris. Image Supérieure - mettez le contraste en phase, lentille de submersion de l'eau 20x. Abaissez l'image - fluorescence d'actine YFP-étiquetée, la lentille 63x à immersion dans l'huile. La région couverte par l'image de fluorescence est par un cadre dans l'image supérieure.

La représentation d'AFM des cellules a été effectuée dans la solution du PBS de Dulbecco. Pour la représentation d'AFM, le mode de contact intermittent a été utilisé, avec les encorbellements triangulaires de nitrure de silicium qui ont eu une constante de source d'environ 0,3 N/m. En mode de contact intermittent, le senseur d'AFM oscille au-dessus de la surface de l'échantillon, et l'amplitude de la vibration est employée pour régler le balayeur. Ce mode donne des images de topographie de la surface de cellules et des images du signe d'amplitude, qui mettent en valeur les détails plus fins de la surface de cellules.

Le Schéma 2 affiche une comparaison des images optiques et d'AFM de l'arête de cellules de mélanome de la souris B16. La Commission supérieure est une image de fluorescence de YFP, comme sur le Schéma 1, et la Commission inférieure est un montage de deux images de signe d'amplitude d'AFM. Le signe d'amplitude d'AFM est lié au gradient de la topographie comme échographies d'extrémité au-dessus de la surface. Ceci signifie que les images semblent ombragées, comme si la topographie est allumée du côté, et les détails plus petits de la surface sont vus particulièrement clair. La zone d'échantillon est comme marquée sur le Schéma 1, mais l'image de fluorescence a été tournée pour une comparaison plus facile avec les images d'AFM. La barre d'échelle est le µm 2 dans les deux Commissions.

Le Schéma 2. cellule de mélanome de la souris B16 imagée utilisant JPK NanoWizard® monté sur Zeis Axiovert 200 a inversé le microscope optique. Commission Supérieure - fluorescence de YFP. Commission Inférieure - montage de deux images de signe d'amplitude d'AFM de la même région. Pointes De Flèche - exemples des filaments d'actine vus dans les deux Commissions. Sonnerie - exemple des caractéristiques techniques arrondies sur la surface de cellules, vu seulement dans les images d'AFM. Μm de la barre 2 d'Échelle dans les deux Commissions.

Puisque le YFP étiquette toute l'actine (des monomères et des filaments), le cytoplasme est faible étiqueté dans l'image de fluorescence, ainsi que les filaments d'actine. Les filaments plus grands d'actine peuvent être vus dans l'AFM et les images optiques de fluorescence (deux exemples sont marqués sur le Schéma 2 avec des pointes de flèche). Les images d'AFM affichent d'autres détails de la surface de cellules, cependant, qui n'apparaissent pas dans l'image de fluorescence, telle que le groupe de caractéristiques techniques arrondies par une sonnerie blanche sur le Schéma 2. Le côté gauche de la Commission d'AFM affiche en particulier la structure extérieure qui est très différente de la configuration du cytosquelette fondamental d'actine.

Fibroblastes

Des fibroblastes cutanés de Souris ont été développés sur les lamelles en verre. Les cellules ont été fixées avec du glutaraldéhyde de 2% pendant 45 secondes et puis le paraformaldéhyde de 4% pendant 20 mn, quant aux cellules de mélanome de souris. Les filaments d'actine ont été fluorescent étiquetés en incubant les cellules du jour au lendemain à 4°C avec le phalloidin-FITC, selon des directives de constructeurs. Les cellules étaient imagées dans la solution du PBS de Dulbecco. Des images de Fluorescence ont été rassemblées comme décrit ci-dessus, utilisant un positionnement à immersion dans l'huile de la lentille 63x et du filtre de FITC.

Le Schéma 3 affiche une image optique d'un fibroblaste d'isolement. L'image affiche la fluorescence des filaments étiquetés d'actine. L'actine plus fortement est étiquetée que pour le YFP sur le Schéma 1, et le cytosquelette du fibroblaste plus développé que pour la cellule de mélanome, ainsi les câbles d'actine restent à l'extérieur de manière dégagée dans l'image de fluorescence.

Le Schéma 3. image Optique d'une cellule cutanée de fibroblaste de souris. La Fluorescence de FITC-phalloidin a étiqueté l'actine. La zone par le boîtier blanc est affichée sur le Schéma 4.

Les images sur le Schéma 4 tous affichent la région de l'arête de cellules qui est par un cadre sur le Schéma 3. L'image optique de fluorescence (a) a été tournée pour faciliter la comparaison avec les images d'AFM (B, montage de deux images de signe d'amplitude et C, montage de deux images de topographie) de la même zone.

Le Schéma 4. Comparaison des images optiques et d'AFM d'un fibroblaste utilisant JPK NanoWizard®. A : actine fluorescent étiquetée (phalloidin-FITC). B : montage de deux images de signe d'amplitude d'AFM. C : montage de deux images de topographie d'AFM. Évaluez le µm de la barre 2 en tout, domaine de hauteur d'image d'AFM est le µm 1,8.

Les protrusions fines à la borne de cellules (par les pointes de flèche blanches) sont faiblement visibles dans l'image de fluorescence (a), mais peuvent être de manière dégagée résolues dans les images d'AFM (B, C). D'Autres caractéristiques techniques d'isolement sur la surface de cellules sont seulement visibles dans les images d'AFM (par exemple, la grande caractéristique technique par une pointe de flèche noire).

L'AFM et les images optiques ici fournissent les informations complémentaires au sujet de la surface de la cellule et des structures submembranous. Les images d'AFM donnent des informations à trois dimensions réelles sur la forme de cellules (du signe de topographie) et une impression des structures fines sur la surface de cellules (du signe d'amplitude). La combinaison d'information optique et structurelle permet l'identification des structures particulières fondamentales de membrane cellulaire d'éléments cellulaires.

Fibroblastes Traités

Pour expliquer une demande d'information différente qui est fournie par cette combinaison des techniques de microscopie, une brève étude des effets d'apoptotique du peroxyde de hydrogène (HO22) sur les cellules de fibroblaste est présentée ici.

Les fibroblastes cutanés de souris ont été traités avec des concentrations faibles de peroxyde de hydrogène pour initier une cascade de mort cellulaire. Les cellules traitées ont été incubées avec du peroxyde de hydrogène de 100 µM pour 30 mn ou une heure, avant d'être fixes et l'actine filamenteuse fluorescent étiquetée comme décrit ci-dessus pour la représentation normale.

Une synthèse des résultats est donnée sur le Schéma 5 pour des cellules de contrôle (aucune demande de règlement, COURANT ALTERNATIF de suite d'image) et des cellules traitées avec du peroxyde de hydrogène pour 15 mn (suite DF d'image) ou 30 mn (G-I). Les images le long de chaque ligne affichent différentes techniques d'imagerie pour le même échantillon de cellules. Le contraste de phase (A, D, G) et epi-flurorescence (B, E, H) des images affichent la même zone d'échantillon. La région pour les images de topographie d'AFM (C, F, I) est marqué dans les images optiques avec un cadre. La zone d'échographie pour les images d'AFM était 20 le µm du µm X 20 dans chaque cas.

Le Schéma 5. Combinaison des images optiques et d'AFM des fibroblastes a traité avec du peroxyde de hydrogène. Le COURANT ALTERNATIF de suite d'Image affiche des cellules de ntrol (aucune HO22 demande de règlement), DF affiche les cellules qui ont été traitées avec le µM 100 HO22 pendant 30 mn avant la fixation, et - I affiche les cellules qui ont été traitées pendant une heure avant la fixation. Images de contraste de Phase (A, D, G) et epi-fluorescence des filaments d'actine étiquetés par Comité technique-phalloidin (B, E, H) exposition les mêmes balayent la zone pour chaque cas. Images de topographie d'AFM (C, F, I) sont de 20 m X 20 échographies de µm dans chaque point de droit, pour la région par un cadre dans les images optiques précédentes. Toute l'échelle de hauteur pour C d F est le µm 2,3 dans les deux cas, et toute l'échelle dedans I de hauteur est le µm 9. La représentation d'AFM était en contact mode effectué utilisant les encorbellements affilés de DNP avec la constante 0,06 N/m. de source.

Des câbles Importants d'actine peuvent être vus dans chacune des trois images (COURANT ALTERNATIF) pour les cellules non traitées de contrôle. De plus, des vésicules peuvent être vues dans l'image de contraste de phase, qui marquent avec des protrusions sur la surface de cellules dans les images de topographie d'AFM (par exemple, celle cerclée en C).

Après demande de règlement pendant 30 mn avec le µM 100 HO22, les filaments d'actine ont commencé à se rétracter à partir des arêtes des cellules. L'image de fluorescence dans E affiche la souillure faible à la périphérie de la cellule, mais les petits groupes peuvent plus clair être vus dans l'image correspondante d'AFM (f). Une région de membrane relativement plate est laissée à la périphérie (par une flèche dans F) qui a une structure à maille fine la supporter, mais par les fibres importantes d'actine n'étendez plus à l'arête de la cellule.

Les cellules ont traité avec HO22 pour une exposition d'heure un changement spectaculaire dans la morphologie de cellules, et un réarrangement complet du cytosquelette d'actine. Les cellules se sont rétractées et deviennent plus rondes, les câbles d'actine sont réduits et les ampoules ont commencé à former sur la surface.

Structures en trois dimensions de forme d'ampoules les grandes - toute l'échelle de hauteur pour les images d'AFM dans les les deux C et F est le µm 2,3, alors que le domaine de hauteur pour la dernière image (i) est le µm 9. Les mesures d'AFM permettent une mesure quantitative du changement de la hauteur de cellules pendant qu'elle arrondit, et les ampoules extérieures pourraient être analysées la taille, la forme, le numéro ou le volume. La Comparaison avec l'image de fluorescence dans H affiche le cytosquelette d'actine étant à la base des structures d'ampoule.

Résumé

Cet état a introduit certaines des possibilités de combiner différentes techniques d'imagerie optiques avec l'AFM pour étudier la morphologie et les réactions de cellules. La Combinaison des techniques élargit la gamme d'information qui peut être recueillie au sujet de la structure cellulaire et du fonctionnement. Les molécules Particulières sur la surface de cellules ou dans les parties fondamentales de la cellule peuvent être étiquetées et imagées pour explorer leur relation à la morphologie de la surface de cellules et des structures particulières. Ces investigations peuvent être faites dans des conditions physiologiques, ou même sur les cellules vivantes, et les opportunités neuves actuelles d'analyser la relation entre les structures matérielles et la fonction cellulaire.

Source : Instruments de JPK

Pour plus d'informations sur cette source visitez s'il vous plaît les Instruments de JPK

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:56

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