:: AZoNanotechnology Pasal
.jpg)
Topik Covered
Pengenalan
Melanoma Sel Tikus Dicap dengan YFP
Fibroblast
Diobati Fibroblast
Ringkasan
Pengenalan
Menggabungkan optik dan AFM pencitraan sel membuka banyak kemungkinan untuk menghubungkan informasi tentang struktur permukaan sel dengan label fungsional komponen-komponen tertentu. Dalam laporan ini, diperlihatkan contoh AFM dikombinasikan dengan mikroskop optik untuk fase kontras, DIC dan epi-fluoresensi menggunakan JPK NanoWizard ® AFM dipasang pada mikroskop optik 200 Axiovert Zeiss terbalik.
Sebagai aplikasi tertentu, sel-sel diobati dengan hidrogen peroksida untuk menginduksi apoptosis blebbing. Kombinasi optik dan pencitraan AFM memungkinkan interpretasi yang lebih baik dari link antara perubahan di permukaan membran sebagai bentuk vesikel, dan struktur sitoskeleton aktin di bawah mereka.
Melanoma Sel Tikus Dicap dengan YFP
Dalam contoh pertama, melanoma tikus garis sel sekunder (B16) digunakan. Dalam baris ini sel, aktin itu dilabeli dengan kuning fluorescent protein (YFP). Sel-sel semacam hadiah dari Dr Clemens Franz (Seluler Mesin Group, Biotechnologisches Zentrum, TU Dresden).
Sel-sel dalam baris sel sangat mobile dan tidak melekat dengan baik saat mereka tumbuh, sehingga mereka tetap sebelum pencitraan. Sel diobati dengan glutaraldehid 2% hanya 45 detik, untuk meminimalkan kontribusi fluoresensi dari glutaraldehida, dan sel-sel kemudian tetap selama 20 menit dalam paraformaldehyde 4%.
Gambar optik dari sel B16 yang ditunjukkan pada Gambar 1. Panel atas adalah fase kontras gambar yang diperoleh dengan menggunakan tujuan 20x air perendaman. Panel bawah menunjukkan fluoresensi YFP dari daerah dekat tepi sel dan diperoleh dengan menggunakan lensa minyak imersi 63x (NA 1.2). Para YFP monomer aktin label, sehingga ada beberapa kontribusi terhadap sinyal neon dari sitoplasma serta dari filamen aktin.
.jpg)
Gambar 1. Optik gambar sel melanoma tikus. Atas gambar - fase kontras, lensa 20x air perendaman. Turunkan - fluoresensi dari YFP berlabel aktin, lensa minyak imersi 63x. Wilayah yang dicakup oleh gambar fluoresensi ditandai dengan kotak di gambar atas.
AFM pencitraan sel dilakukan dalam larutan PBS Dulbecco itu. Untuk AFM pencitraan, modus kontak intermiten digunakan, dengan cantilevers silikon nitrida segitiga yang memiliki konstanta pegas sekitar 0,3 N / m. Dalam mode kontak intermiten, sensor AFM berosilasi di atas permukaan sampel, dan amplitudo osilasi yang digunakan untuk mengendalikan pemindai. Mode ini memberikan gambar topografi kedua permukaan sel dan gambar dari sinyal amplitudo, yang menyoroti perincian yang lebih bagus dari permukaan sel.
Gambar 2 menunjukkan perbandingan gambar optik dan AFM dari tepi B16 melanoma tikus sel. Panel atas adalah gambar fluoresensi YFP, seperti dalam Gambar 1, dan panel bawah montase dari dua amplitudo sinyal gambar AFM. AFM amplitudo sinyal berkaitan dengan gradien topografi sebagai ujung scan atas permukaan. Ini berarti bahwa gambar muncul gelap, seolah-olah topografi menyala dari samping, dan rincian lebih kecil dari permukaan terlihat sangat jelas. Daerah sampel adalah sebagai ditandai pada Gambar 1, tetapi citra fluoresensi telah diputar untuk perbandingan lebih mudah dengan gambar AFM. Bar skala 2 pM dalam kedua panel.
.jpg)
Gambar 2. B16 sel melanoma tikus dicitrakan menggunakan JPK NanoWizard ® dipasang pada Zeis 200 mikroskop optik Axiovert terbalik. Panel Atas - YFP fluoresensi. Rendah Panel - montase dari dua gambar sinyal amplitudo AFM dari daerah yang sama. Panah - contoh filamen aktin terlihat pada kedua panel. Cincin - contoh fitur bulat pada permukaan sel, hanya dilihat pada gambar AFM. Skala bar 2 pM dalam kedua panel.
Sejak YFP label semua aktin (monomer dan filamen), sitoplasma yang lemah diberi label dalam gambar fluoresensi, serta filamen aktin. Filamen aktin yang lebih besar dapat dilihat baik di AFM dan gambar fluoresensi optik (dua contoh ditandai pada Gambar 2 dengan panah). Gambar AFM menunjukkan rincian lain dari permukaan sel, bagaimanapun, bahwa tidak muncul dalam citra fluoresensi, seperti kelompok fitur bulat ditandai dengan cincin putih pada Gambar 2. Sisi kiri panel AFM terutama menunjukkan struktur permukaan yang cukup berbeda dari pola yang mendasari sitoskeleton aktin.
Fibroblast
Dermal fibroblast tikus ditumbuhkan pada coverslips kaca. Sel-sel tetap dengan glutaraldehid 2% selama 45 detik dan kemudian paraformaldehyde 4% selama 20 menit, seperti untuk sel-sel melanoma tikus. Filamen aktin yang fluorescently berlabel dengan menginkubasi sel semalam pada 4 ° C dengan phalloidin-FITC, sebagai instruksi produsen per. Sel-sel yang dicitrakan dalam larutan PBS Dulbecco itu. Gambar fluoresensi dikumpulkan seperti dijelaskan di atas, menggunakan lensa minyak imersi 63x dan FITC mengatur filter.
Gambar 3 menunjukkan gambar optik dari fibroblast terisolasi. Gambar menunjukkan fluoresensi dari filamen aktin berlabel. Aktin adalah lebih kuat dari label untuk YFP pada Gambar 1, dan fibroblast sitoskeleton yang lebih maju daripada sel melanoma, sehingga kabel aktin menonjol jelas dalam gambar fluoresensi.
.jpg)
Gambar 3. Optik citra sel fibroblast tikus dermal. Fluoresensi dari FITC-phalloidin aktin berlabel. Daerah ditandai dengan kotak putih ditunjukkan pada Gambar 4.
Gambar dalam Gambar 4 semua menunjukkan wilayah tepi sel yang ditandai dengan kotak pada Gambar 3. Gambar fluoresensi optik (A) telah diputar untuk memfasilitasi perbandingan dengan gambar AFM (B, montase dari dua gambar amplitudo sinyal dan C, montase dari dua gambar topografi) dari daerah yang sama.
.jpg)
Gambar 4. Perbandingan gambar optik dan AFM dari fibroblast menggunakan JPK NanoWizard ®. J: aktin fluorescently berlabel (phalloidin-FITC). B: montase dari dua amplitudo sinyal gambar AFM. C: montase dari dua gambar topografi AFM. Skala bar 2 pM dalam semua, tinggi kisaran AFM gambar 1,8 pM.
Para tonjolan halus pada batas sel (ditandai dengan panah putih) terlihat samar-samar pada gambar fluoresensi (A), tetapi dapat dengan jelas diselesaikan dalam gambar AFM (B, C). Fitur terisolasi lain di permukaan sel yang hanya terlihat di gambar AFM (misalnya, fitur yang besar ditandai dengan panah hitam).
AFM dan gambar optik sini memberikan informasi pelengkap tentang kedua permukaan sel dan struktur submembranous. Gambar AFM memberikan baik informasi 3-D yang nyata tentang bentuk sel (dari sinyal topografi) dan kesan dari struktur halus pada permukaan sel (dari sinyal amplitudo). Kombinasi informasi optik dan struktural memungkinkan identifikasi komponen selular yang mendasari struktur membran sel tertentu.
Diobati Fibroblast
Untuk menunjukkan aplikasi untuk informasi yang berbeda yang tersedia dari kombinasi teknik mikroskopi, sebuah studi singkat tentang efek apoptosis hidrogen peroksida (H 2 O 2) pada sel fibroblast yang disajikan di sini.
Fibroblas mouse dermal diobati dengan konsentrasi rendah peroksida hidrogen untuk memulai kaskade kematian sel. Sel diobati diinkubasi dengan 100 pM hidrogen peroksida baik untuk 30 menit atau satu jam, sebelum tetap dan filamen aktin fluorescently berlabel seperti yang dijelaskan di atas untuk pencitraan standar.
Suatu ikhtisar hasil diberikan pada Gambar 5 untuk sel kontrol (tanpa pengobatan, gambar seri AC) dan sel-sel diperlakukan dengan hidrogen peroksida selama 15 menit (gambar seri DF) atau 30 menit (GI). Gambar-gambar sepanjang setiap baris menampilkan teknik pencitraan yang berbeda untuk sampel sel yang sama. Kontras fase (A, D, G) dan epi-flurorescence (B, E, H) gambar menunjukkan area sampel yang sama. Daerah untuk gambar topografi AFM (C, F, I) adalah ditandai dalam gambar optik dengan kotak. Daerah memindai gambar AFM adalah 20 pM x 20 pM dalam setiap kasus.
.jpg)
Gambar 5. Kombinasi optik dan gambar AFM dari fibroblast diperlakukan dengan hidrogen peroksida. Gambar seri AC menunjukkan sel ntrol (tidak ada H 2 O 2 pengobatan), DF menunjukkan sel-sel yang telah diobati dengan 100 pM H 2 O 2 selama 30 menit sebelum fiksasi, dan-I menunjukkan sel-sel yang telah dirawat selama satu jam sebelum fiksasi. Fase kontras gambar (A, D, G) dan epi-fluoresensi dari TC-phalloidin filamen aktin berlabel (B, E, H) menunjukkan area scan yang sama untuk setiap kasus. AFM topografi gambar (C, F, I) adalah 20 mx 20 scan pM dalam setiap kasus, untuk wilayah yang ditandai dengan kotak dalam gambar optik sebelumnya. Skala tinggi total untuk C d F adalah 2,3 pM dalam kedua kasus, dan skala tinggi total dalam I adalah 9 pM. AFM pencitraan dilakukan dalam modus kontak menggunakan cantilevers DNP diasah dengan konstanta pegas 0,06 N / m.
Kabel aktin yang menonjol dapat dilihat di semua tiga gambar (AC) untuk sel kontrol tidak diobati. Selain itu, vesikel dapat dilihat pada gambar fase kontras, yang berkorelasi dengan tonjolan pada permukaan sel dalam gambar topografi AFM (misalnya, satu dilingkari di C).
Setelah pengobatan selama 30 menit dengan pM 100 H 2 O 2, filamen aktin sudah mulai menarik kembali dari tepi sel. Gambar fluoresensi dalam E menunjukkan pewarnaan samar di pinggiran sel, namun rincian lebih jelas dapat dilihat pada gambar AFM yang sesuai (F). Sebuah daerah membran yang relatif datar yang tersisa di pinggiran (ditandai dengan panah di F) yang memiliki struktur mesh halus mendukungnya, tetapi serat aktin terkemuka tidak lagi memperpanjang ke tepi sel.
Sel diobati dengan H 2 O 2 selama satu jam menunjukkan perubahan dramatis dalam morfologi sel, dan penataan ulang lengkap dari sitoskeleton aktin. Sel-sel telah ditarik dan menjadi bulat, kabel aktin berkurang dan blebs sudah mulai terbentuk pada permukaan.
Para blebs bentuk besar tiga-dimensi struktur - skala tinggi total untuk gambar AFM di kedua C dan F adalah 2,3 pM, sedangkan rentang ketinggian untuk gambar terakhir (saya) adalah 9 pM. Pengukuran AFM memungkinkan ukuran kuantitatif dari perubahan sel tinggi seperti putaran atas, dan permukaan blebs dapat dianalisis untuk ukuran, jumlah bentuk, atau volume. Perbandingan dengan gambar fluoresensi di H menunjukkan sitoskeleton aktin yang mendasari struktur lepuh.
Ringkasan
Laporan ini telah memperkenalkan beberapa kemungkinan menggabungkan teknik yang berbeda pencitraan optik dengan AFM untuk mempelajari morfologi sel dan tanggapan. Menggabungkan teknik memperluas jangkauan informasi yang dapat dikumpulkan tentang struktur sel dan fungsi. Molekul tertentu pada permukaan sel atau di bagian yang mendasari sel dapat diberi label dan dicitrakan untuk mengeksplorasi hubungan mereka dengan morfologi permukaan sel dan struktur tertentu. Penyelidikan ini dapat dilakukan dalam kondisi fisiologis, atau bahkan pada sel-sel hidup, dan kesempatan baru hadir untuk menganalisis hubungan antara struktur fisik dan fungsi selular.
Sumber: Instrumen JPK
Untuk informasi lebih lanjut tentang sumber ini silakan kunjungi Instrumen JPK