Combinato Optical Imaging e AFM di celle usando microscopio a forza atomica NanoWizard Instruments JPK

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Argomenti trattati

Introduzione
Topo le cellule di melanoma Etichettato con YFP
I fibroblasti
I fibroblasti trattati
Riassunto

Introduzione

La combinazione di ottica e AFM di imaging di cellule apre molte possibilità per correlare informazioni strutturali sulla superficie cellulare con etichettatura funzionale di alcuni componenti. In questo rapporto, vengono mostrati esempi di AFM combinato con microscopia ottica in contrasto di fase, DIC e epi-fluorescenza utilizzando un JPK NanoWizard ® AFM montato su Zeiss Axiovert 200 microscopio ottico invertito.

Come una particolare applicazione, le cellule sono state trattate con acqua ossigenata per indurre blebbing apoptotico. La combinazione di ottica e AFM di imaging consente una migliore interpretazione dei legami tra i cambiamenti nella superficie della membrana come forma vescicole, e la struttura del citoscheletro di actina sotto di loro.

Topo le cellule di melanoma Etichettato con YFP

Nel primo esempio, un melanoma secondario del mouse linea cellulare (B16) è stato utilizzato. In questa linea cellulare, l'actina è stato etichettato con il giallo-proteina fluorescente (YFP). Le celle erano un gentile dono del dottor Franz Clemens (Cellular Gruppo Macchine, Biotechnologisches Zentrum, TU Dresden).

Le cellule in questa linea cellulare sono particolarmente mobili e non aderire bene man mano che crescono, per cui sono stati fissati prima di imaging. Le cellule sono state trattate con il 2% glutaraldeide per soli 45 secondi, per ridurre al minimo il contributo fluorescenza da glutaraldeide, e le cellule sono state poi fissate per 20 minuti in paraformaldeide 4%.

Immagini ottiche di una cella B16 sono mostrati in figura 1. Il pannello superiore è una immagine a contrasto di fase ottenuti utilizzando un obiettivo 20x immersione in acqua. Il pannello inferiore mostra la fluorescenza YFP di una regione vicino al bordo delle cellule ed è stata ottenuta utilizzando un obiettivo 63x immersione in olio (NA 1.2). Le etichette YFP i monomeri di actina, quindi c'è qualche contributo al segnale fluorescente dal citoplasma e dai filamenti di actina.

Figura 1. Immagini ottiche di una cellula di melanoma mouse. Superiore dell'immagine - contrasto di fase, 20x immersione in acqua lente. Inferiore dell'immagine - fluorescenza da YFP marcato actina, 63x lente immersione in olio. La regione coperta da l'immagine di fluorescenza è contrassegnato con una scatola nell'immagine in alto.

AFM di imaging delle cellule è stata effettuata in soluzione PBS Dulbecco. Per AFM imaging, modalità di contatto intermittente è stato utilizzato, con cantilever triangolare nitruro di silicio che ha una molla costante di circa 0,3 N / m. Nella modalità di contatto intermittente, il sensore di AFM oscilla sopra la superficie del campione, e l'ampiezza dell'oscillazione viene utilizzato per controllare lo scanner. Questa modalità offre entrambe le immagini topografia della superficie cellulare e le immagini dal segnale di ampiezza, che evidenziano i dettagli più fini della superficie cellulare.

La Figura 2 mostra un confronto di immagini ottiche e AFM del bordo delle cellule di melanoma B16 del mouse. Il pannello superiore è un'immagine YFP fluorescenza, come in figura 1, e il pannello inferiore è un montaggio di due immagini AFM ampiezza del segnale. Il segnale AFM ampiezza è legato alla pendenza della topografia come la punta scansioni su tutta la superficie. Ciò significa che le immagini appaiono in ombra, come se la topografia è illuminato di lato, ed i dettagli più piccoli della superficie è particolarmente evidente. L'area campione è come indicato nella Figura 1, ma l'immagine di fluorescenza è stata ruotata per una più facile comparazione con le immagini AFM. La barra di scala è di 2 micron di entrambi i pannelli.

Figura 2. Cellulari di melanoma B16 del mouse ripreso con JPK NanoWizard ® montati su Zeis Axiovert 200 microscopio ottico invertito. Superiore del pannello - YFP fluorescenza. Pannello inferiore - montaggio di due immagini AFM ampiezza del segnale della stessa regione. Punte di freccia - esempi di filamenti di actina visto in entrambi i pannelli. Ring - esempio di funzioni arrotondate sulla superficie cellulare, visto solo nelle immagini AFM. Scala bar 2 micron di entrambi i pannelli.

Poiché il YFP etichette tutti actina (monomeri e filamenti), il citoplasma è debolmente etichettato nell'immagine fluorescenza, così come i filamenti di actina. I filamenti di actina più grandi possono essere visti sia nel AFM e le immagini ottiche di fluorescenza (due esempi sono contrassegnati nella figura 2 con punte di freccia). Le immagini AFM mostrano altri dettagli della superficie cellulare, tuttavia, che non appaiono nell'immagine fluorescenza, come il gruppo di funzioni arrotondati contrassegnati da un anello bianco nella Figura 2. Il lato sinistro del pannello di AFM mostra particolarmente struttura della superficie che è molto diverso dal modello del citoscheletro di actina sottostante.

I fibroblasti

Fibroblasti di topo cutanea sono stati coltivati ​​su coprioggetto di vetro. Le cellule sono state fissate con glutaraldeide al 2% per 45 secondi e poi il 4% paraformaldeide per 20 minuti, come per cellule di melanoma il mouse. I filamenti di actina sono stati fluorescente incubando le cellule notte a 4 ° C con falloidina-FITC, come da istruzioni del produttore. Le cellule sono state ripreso in soluzione PBS Dulbecco. Immagini di fluorescenza sono stati raccolti come descritto sopra, usando un obiettivo 63x ad immersione olio e set di filtri FITC.

La figura 3 mostra un'immagine ottica di fibroblasti isolati. L'immagine mostra la fluorescenza da filamenti di actina etichettati. L'actina è più fortemente marcato che per la YFP nella Figura 1, e il citoscheletro dei fibroblasti più sviluppato per la cellula di melanoma, per cui i cavi di actina distinguono chiaramente nell'immagine fluorescenza.

Figura 3. Immagine ottica di una cellula cutanea fibroblasti del mouse. Fluorescenza da FITC-falloidina actina etichettati. L'area contrassegnata con la scatola bianca è mostrata in Figura 4.

Le immagini in Figura 4 mostrano la regione del bordo cella che è contrassegnato da una scatola in Figura 3. L'immagine ottico a fluorescenza (A) è stata ruotata per facilitare il confronto con le immagini AFM (B, montaggio di immagini di ampiezza del segnale e due C, montaggio di due immagini topografia) della stessa area.

Figura 4. Confronto di immagini ottiche e AFM di un fibroblasto con JPK NanoWizard ®. R: actina fluorescente (falloidina-FITC). B: montaggio di due immagini AFM ampiezza del segnale. C: montaggio di due immagini topografia AFM. Bar Scala 2 micron di tutto, altezze di AFM immagine è di 1,8 micron.

Le sporgenze multa al confine cella (segnato con frecce bianche) sono debolmente visibili nell'immagine fluorescenza (A), ma può essere risolta in modo chiaro nelle immagini AFM (B, C). Altre caratteristiche isolati sulla superficie cellulare sono visibili solo nelle immagini AFM (ad esempio, la funzione di grande contrassegnato da una freccia nera).

L'AFM e le immagini ottiche qui fornire informazioni complementari su entrambi la superficie della cellula e strutture submembranous. Le immagini AFM dare sia reale in 3-D informazioni circa la forma delle cellule (dal segnale di topografia) e l'impressione delle strutture belle sulla superficie cellulare (dal segnale di ampiezza). La combinazione di informazioni ottiche e strutturali permette l'identificazione dei componenti cellulari alla base particolari strutture della membrana cellulare.

I fibroblasti trattati

Per dimostrare una richiesta di informazioni diverse che è disponibile da questa combinazione di tecniche di microscopia, un breve studio degli effetti apoptotici del perossido di idrogeno (H ₂ O ₂₎ sulle cellule di fibroblasti è presentato qui.

I fibroblasti di topo cutanea sono stati trattati con basse concentrazioni di perossido di idrogeno per avviare una cascata di morte cellulare. Le cellule trattate sono state incubate con 100 mM di perossido di idrogeno sia per 30 minuti o un'ora, prima di essere fisso e l'actina filamentosa fluorescente come descritto sopra per l'imaging standard.

Una panoramica dei risultati è data in Figura 5 per le cellule di controllo (no, di trattamento delle immagini della serie AC) e cellule trattate con perossido di idrogeno per 15 minuti (immagine di serie DF) o 30 minuti (GI). Le immagini lungo ogni riga mostrano diverse tecniche di imaging per il campione stessa cella. Il contrasto di fase (A, D, G) ed epi-flurorescence (B, E, H) immagini mostrano la stessa area del campione. La regione per la topografia AFM immagini (C, F, I) è segnato nelle immagini ottiche con una scatola. L'area di scansione delle immagini AFM è stato di 20 micron x 20 micron in ogni caso.

Figura 5. Combinazione di immagini ottiche e AFM dei fibroblasti trattati con perossido di idrogeno. Immagine serie AC mostra cellule ntrol (non H ₂ O ₂ trattamento), DF mostra le celle che sono stati trattati con 100 mM H ₂ O ₂ per 30 minuti prima di fissazione, e-I dimostra che le cellule sono state trattate per un'ora prima di fissazione. Immagini a contrasto di fase (A, D, G) ed epi-fluorescenza da TC-falloidina filamenti di actina etichettati (B, E, H) mostrano la stessa area di scansione per ciascun caso. AFM topografia immagini (C, F, I) sono 20 mx 20 micron scansioni in ogni caso, per la regione segnata con una scatola nelle immagini precedenti ottica. La scala di altezza totale di C d F è di 2,3 micron in entrambi i casi, e la scala di altezza totale in I è di 9 micron. Imaging AFM è stata effettuata in modalità di contatto con cantilever DNP affilato con costante elastica 0,06 N / m.

I cavi actina prominente può essere visto in tutte le tre immagini (AC) per le cellule di controllo non trattato. Inoltre, le vescicole si può vedere nell'immagine contrasto di fase, che corrispondono a sporgenze sulla superficie delle cellule nelle immagini topografia AFM (ad esempio, quello cerchiato in C).

Dopo il trattamento per 30 minuti con il mM 100 H ₂ O _2, i filamenti di actina hanno iniziato a ritirare dai bordi delle celle. L'immagine in fluorescenza E mostra una colorazione tenue alla periferia della cellula, ma i dettagli possono essere più chiaramente visto nella corrispondente immagine AFM (F). Una regione di membrana relativamente piatto è lasciato alla periferia (contrassegnati con una freccia in F) che ha una struttura a maglia fine che lo sostengono, ma le fibre di actina non è più prominente estende al bordo della cella.

Le cellule trattate con H ₂ O ₂ per un'ora mostrano un drastico cambiamento nella morfologia delle cellule, e una completa riorganizzazione del citoscheletro di actina. Le cellule hanno ritrattato e diventare più rotondo, i cavi di actina sono ridotti e vesciche hanno iniziato a formarsi sulla superficie.

Le vesciche forma grandi strutture tridimensionali - la scala di altezza totale per le immagini AFM sia in C e F è di 2,3 micron, mentre la gamma di altezza per l'ultima immagine (I) è di 9 micron. Le misure AFM permettono una misura quantitativa della variazione altezza della cella come si arrotonda, e la blebs superficie potrebbe essere analizzate per dimensione, forma, numero o il volume. Il confronto con l'immagine di fluorescenza in H mostra il citoscheletro di actina alla base delle strutture vescichetta.

Riassunto

Questa relazione ha introdotto alcune delle possibilità di combinare diverse tecniche di imaging ottico con AFM per lo studio della morfologia delle cellule e le risposte. Combinando tecniche amplia la gamma di informazioni che possono essere raccolte sulla struttura e funzione cellulare. Specifiche molecole sulla superficie delle cellule o nella parte sottostante della cella può essere etichettati e ripreso a esplorare la loro relazione con la morfologia della superficie delle cellule e delle strutture particolari. Queste indagini può essere fatto in condizioni fisiologiche, o anche su cellule viventi, e presentare le nuove opportunità di analizzare il rapporto tra strutture fisiche e le funzioni cellulari.

Fonte: Strumenti JPK

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