Rappresentazione Combinata del AFM ed Ottica delle Celle Facendo Uso del Microscopio Atomico della Forza di NanoWizard dagli Strumenti di JPK

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Introduzione
Celle del Melanoma del Mouse Contrassegnate con YFP
Fibroblasti
Fibroblasti Trattati
Riassunto

Introduzione

La Combinazione ottica e la rappresentazione del AFM delle celle apre molte possibilità per la correlazione delle informazioni strutturali sulla superficie delle cellule con il contrassegno funzionale di componenti determinate. In questo rapporto, gli esempi sono indicati del AFM combinato con microscopia ottica per contrasto di fase, DIC e la epi-fluorescenza facendo uso di un JPK NanoWizard® AFM montato su Zeiss Axiovert 200 ha invertito il microscopio ottico.

Come applicazione particolare, le celle sono state curate con il perossido di idrogeno per indurre blebbing apoptotic. La combinazione di rappresentazione del AFM ed ottica permette la migliore interpretazione dei collegamenti fra i cambiamenti nella superficie della membrana mentre le vescicole si formano e la struttura del citoscheletro dell'actina sotto loro.

Celle del Melanoma del Mouse Contrassegnate con YFP

Nel primo esempio, una linea cellulare secondaria del melanoma del mouse (B16) è stata usata. In questa linea cellulare, l'actina è stata contrassegnata con proteina giallo-fluorescente (YFP). Le celle erano un regalo gentile dal Dott. Clemens Franz (Gruppo Cellulare dei Commputer, Biotechnologisches Zentrum, TU Dresda).

Le celle in questa linea cellulare sono particolarmente mobili e non aderiscono bene poichè si sviluppano, in modo da erano fisse prima della rappresentazione. Le celle sono state curate con la glutaraldeide di 2% per soltanto 45 secondi, per minimizzare il contributo della fluorescenza dalla glutaraldeide e le celle poi sono state fissate per 20 minuti in paraformaldeide di 4%.

Le immagini Ottiche di una cella B16 sono indicate nella Figura 1. Il comitato superiore è un'immagine di contrasto di fase ottenuta facendo uso di un obiettivo di immersione dell'acqua 20x. Il pannello inferiore mostra la fluorescenza di YFP di una regione vicino alla barriera delle cellule ed è stato ottenuto facendo uso 63x di una lente d'immersione in olio (NA 1,2). Il YFP contrassegna i monomeri dell'actina, così c'è un certo contributo al segnale fluorescente dal citoplasma come pure dai filamenti dell'actina.

Figura 1. immagini Ottiche di una cella del melanoma del mouse. Immagine Superiore - sincronizzi il contrasto, lente di immersione dell'acqua 20x. Abbassi l'immagine - la fluorescenza da actina YFP-contrassegnata, la lente d'immersione in olio 63x. La regione coperta dall'immagine della fluorescenza è segnata con una casella nell'immagine superiore.

La rappresentazione del AFM delle celle è stata effettuata nella soluzione del PBS di Dulbecco. Per la rappresentazione del AFM, il modo di contatto intermittente è stato usato, con le travi a mensola triangolari del nitruro di silicio che hanno avute una costante della sorgente di circa 0,3 N/m. Nel modo di contatto intermittente, il sensore del AFM oscilla sopra la superficie del campione e l'ampiezza dell'oscillazione è usata per gestire lo scanner. Questo modo dà sia le immagini della topografia della superficie delle cellule che le immagini dal segnale di ampiezza, che evidenziano i dettagli più fini della superficie delle cellule.

Figura 2 mostra un confronto delle immagini del AFM ed ottiche della barriera delle cellule del melanoma del mouse B16. Il comitato superiore è un'immagine della fluorescenza di YFP, come nella Figura 1 ed il pannello inferiore è un montaggio di due immagini del segnale di ampiezza del AFM. Il segnale di ampiezza del AFM è collegato con il gradiente della topografia come le scansioni del suggerimento sopra la superficie. Ciò significa che le immagini sembrano ombreggiate, come se la topografia sia accesa dal lato ed i più piccoli dettagli della superficie sono veduti particolarmente chiaro. L'area del campione è come tracciata nella Figura 1, ma l'immagine della fluorescenza è stata girata per il confronto più facile con le immagini del AFM. La barra del disgaggio è µm 2 in entrambi i comitati.

La Figura 2. cella del melanoma del mouse B16 imaged facendo uso di JPK NanoWizard® montato su Zeis Axiovert 200 ha invertito il microscopio ottico. Comitato Superiore - fluorescenza di YFP. Pannello inferiore - un montaggio di due immagini del segnale di ampiezza del AFM della stessa regione. Sagittarie - esempi dei filamenti dell'actina veduti in entrambi i comitati. Anello - esempio delle funzionalità arrotondate sulla superficie delle cellule, veduto soltanto nelle immagini del AFM. Μm della barra 2 del Disgaggio in entrambi i comitati.

Poiché il YFP contrassegna tutta l'actina (monomeri e filamenti), il citoplasma è contrassegnato debolmente nell'immagine della fluorescenza come pure nei filamenti dell'actina. I più grandi filamenti dell'actina possono essere veduti sia nel AFM che nelle immagini ottiche della fluorescenza (due esempi sono tracciati nella Figura 2 con le sagittarie). Le immagini del AFM mostrano altri dettagli della superficie delle cellule, tuttavia, che non compaiono nell'immagine della fluorescenza, quale il gruppo di funzionalità arrotondate segnate con un anello bianco nella Figura 2. La sinistra del comitato del AFM mostra specialmente la struttura di superficie che è abbastanza differente dal reticolo del citoscheletro di fondo dell'actina.

Fibroblasti

I fibroblasti cutanei del Mouse si sono sviluppati sulle lamelle di vetro. Le celle sono state fissate con la glutaraldeide di 2% per 45 secondi e poi il paraformaldeide di 4% per 20 minuti, per quanto riguarda le celle del melanoma del mouse. I filamenti dell'actina fluorescente sono stati contrassegnati incubando le celle durante la notte a 4°C con phalloidin-FITC, secondo le istruzioni dei produttori. Le celle erano imaged nella soluzione del PBS di Dulbecco. Le immagini della Fluorescenza sono state raccolte come precedentemente descritto, facendo uso di un insieme d'immersione in olio della lente 63x e del filtro da FITC.

Figura 3 mostra un'immagine ottica di un fibroblasto isolato. L'immagine mostra la fluorescenza dai filamenti contrassegnati dell'actina. L'actina è contrassegnata più forte che per il YFP nella Figura 1 ed il citoscheletro del fibroblasto sviluppato di per la cella del melanoma, in modo dai cavi dell'actina stanno chiaramente fuori nell'immagine della fluorescenza.

Figura 3. immagine Ottica di una cella cutanea del fibroblasto del mouse. La Fluorescenza da FITC-phalloidin ha contrassegnato l'actina. L'area segnata con la casella bianca è indicata nella Figura 4.

Le immagini nella Figura 4 tutti mostrano la regione della barriera delle cellule che è segnata con una casella nella Figura 3. L'immagine ottica della fluorescenza (A) è stata girata per facilitare il confronto con le immagini del AFM (B, un montaggio di due immagini del segnale di ampiezza e C, un montaggio di due immagini di topografia) della stessa area.

Figura 4. Confronto delle immagini del AFM ed ottiche di un fibroblasto facendo uso di JPK NanoWizard®. A: actina fluorescente contrassegnata (phalloidin-FITC). B: un montaggio di due immagini del segnale di ampiezza del AFM. C: un montaggio di due immagini di topografia del AFM. Riporti In Scala il µm in tutto, intervallo della barra 2 di altezza dell'immagine del AFM è µm 1,8.

Le sporgenze fini al limite delle cellule (segnato con le sagittarie bianche) sono debole visibili nell'immagine della fluorescenza (A), ma possono essere chiaramente risolte nelle immagini del AFM (B, C). Altre funzionalità isolate alla superficie delle cellule sono soltanto visibili nelle immagini del AFM (per esempio, la grande funzionalità segnata con una sagittaria nera).

Il AFM e le immagini ottiche qui forniscono le informazioni complementari sia sulla superficie della cella che sulle strutture submembranous. Le immagini del AFM danno sia le informazioni 3-D reali sulla forma delle cellule (dal segnale di topografia) che un'impressione delle strutture fini alla superficie delle cellule (dal segnale di ampiezza). La combinazione di informazioni ottiche e strutturali permette l'identificazione delle strutture particolari di fondo della membrana cellulare delle componenti cellulari.

Fibroblasti Trattati

Per dimostrare una domanda di informazioni differenti che sono disponibili da questa combinazione di tecniche di microscopia, un breve studio sugli effetti apoptotic del perossido di idrogeno (NOIOSO22) sulle celle del fibroblasto è presentato qui.

I fibroblasti cutanei del mouse sono stati trattati con le concentrazioni basse di perossido di idrogeno per iniziare una cascata di morte delle cellule. Le celle curate sono state incubate con il perossido di idrogeno di 100 µM per 30 minuti o un'ora, prima essere fisse e dell'actina filamentosa fluorescente contrassegnata come precedentemente descritto per la rappresentazione standard.

Una generalità dei risultati si arrende Figura 5 per le celle di controllo (nessun trattamento, CORRENTE ALTERNATA di serie di immagine) e le celle curate con il perossido di idrogeno per 15 minuti (serie D-F di immagine) o 30 minuti (G-I). Le immagini lungo ogni riga mostrano le tecniche di rappresentazione differenti per lo stesso campione delle cellule. Il contrasto di fase (A, D, G) e epi-flurorescence (B, E, H) immagini mostra la stessa area del campione. La regione per le immagini di topografia del AFM (C, la F, I) è tracciata nelle immagini ottiche con una casella. L'area di scansione per le immagini del AFM era 20 µm del µm x 20 in ogni caso.

La Figura 5. Combinazione delle immagini del AFM ed ottiche dei fibroblasti ha trattato con il perossido di idrogeno. La CORRENTE ALTERNATA di serie di Immagine mostra le celle di ntrol (nessun trattamento22 NOIOSO), D-F mostra le celle che sono state curate con µM 100 UFF22 per 30 minuti prima della fissazione e - la I mostra le celle che sono state curate per un'ora prima della fissazione. Immagini di contrasto di Fase (A, D, G) e epi-fluorescenza dai filamenti dell'actina contrassegnati TC-phalloidin (B, E, H) manifestazione lo stessi scandisce l'area per ogni caso. Immagini di topografia del AFM (C, la F, I) è di 20 m. x 20 scansioni del µm in ogni caso, dato che la regione segnata con una casella nelle immagini ottiche precedenti. Il disgaggio totale di altezza per la C la d F è µm 2,3 in entrambi i casi ed il disgaggio totale dentro I di altezza è µm 9. La rappresentazione del AFM è stata effettuata nel modo di contatto facendo uso delle travi a mensola affilate di DNP con la costante 0,06 N/m. della sorgente.

I cavi Prominenti dell'actina possono essere veduti in tutte e tre le immagini (CA) per le celle non trattate di controllo. Inoltre, le vescicole possono essere vedute nell'immagine di contrasto di fase, che correlano con le sporgenze sulla superficie delle cellule nelle immagini della topografia del AFM (per esempio, quella circondata da C).

Dopo il trattamento per 30 minuti con il µM 100 UFF22, i filamenti dell'actina hanno cominciato ritirare dalle barriere delle celle. L'immagine della fluorescenza nella E mostra la macchiatura debole alla periferia della cella, ma i dettagli possono essere veduti più chiaro nell'immagine corrispondente del AFM (F). Una regione di membrana relativamente piana è lasciata alla periferia (segnata con una freccia in F) che ha una struttura a maglia fine supportarla, ma le fibre prominenti dell'actina più non non estendere alla barriera della cella.

Le celle hanno trattato con UFF22 per una manifestazione di ora un cambio spettacolare nella morfologia delle cellule e una riorganizzazione completa del citoscheletro dell'actina. Le celle hanno ritirato e diventano più rotonde, i cavi dell'actina sono diminuiti e le vescichette hanno cominciato formarsi sulla superficie.

Strutture tridimensionali del modulo di vescichette le grandi - il disgaggio totale di altezza per le immagini del AFM in entrambi C AND F è µm 2,3, mentre l'intervallo di altezza per l'ultima immagine (i) è µm 9. Le misure del AFM permettono una misura quantitativa del cambiamento dell'altezza delle cellule mentre arrotonda per eccesso e le vescichette di superficie potrebbero essere analizzate per la dimensione, la forma, il numero o il volume. Il Confronto con l'immagine della fluorescenza nella H mostra il citoscheletro dell'actina che è alla base delle strutture di vescichetta.

Riassunto

Questo rapporto ha introdotto alcune delle possibilità di combinazione delle tecniche di rappresentazione ottiche differenti con il AFM per lo studio la morfologia e delle risposte delle cellule. La Combinazione delle tecniche allarga l'intervallo di informazioni che può essere riunitoe circa la struttura della cellula e la funzione. Le molecole Specifiche sulla superficie delle cellule o nelle parti di fondo della cella possono essere contrassegnate ed imaged per esplorare la loro relazione alla morfologia della superficie delle cellule e delle strutture particolari. Queste indagini possono essere fatte nelle circostanze fisiologiche, o persino sulle celle viventi e sulle nuove opportunità attuali analizzare la relazione fra le strutture fisiche e la funzione cellulare.

Sorgente: Strumenti di JPK

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego gli Strumenti di JPK

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:03

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