NanoWizard JPK の器械からの原子力の顕微鏡を使用してセルの結合された光学および AFM イメージ投射

カバーされるトピック

導入
YFP と分類されるマウスメラノーマのセル
繊維芽細胞
扱われた繊維芽細胞
概要

導入

セルの光学そして AFM イメージ投射結合はある特定のコンポーネントの機能分類にセル表面についての構造的情報を関連させるための多くの可能性を開発します。 このレポートでは、例は AFM の段階の対照、 DIC のための光学顕微鏡検査と結合される示され、ツァイス Axiovert 200 に取付けられた JPK NanoWizard® AFM を使用して epi 蛍光性は光学顕微鏡を逆にしました。

特定アプリケーションとして apoptotic blebbing を誘導するために、セルは過酸化水素と扱われました。 光学および AFM イメージ投射の組合せは小胞が形作る、とそれらの下のアクチン細胞骨格の構造可能にしますと同時に膜の表面の変更間のリンクのよりよい解釈を。

YFP と分類されるマウスメラノーマのセル

最初の例では、マウスメラノーマの二次セルライン (B16) は使用されました。 このセルラインでは、アクチンは黄色蛍光蛋白質と分類されました (YFP)。 セルは先生 Clemens フランツ (細胞機械グループ、 Biotechnologisches Zentrum、 TU ドレスデン) からの親切なギフトでした。

このセルラインのセルは育つ、従ってイメージ投射の前に固定でしたので特に移動式で、よく付着しません。 セルは 45 秒だけの 2% のグルタルアルデヒトと、グルタルアルデヒトからの蛍光性の貢献を最小化するために扱われセルは 4% のパラホルムアルデヒドの 20 分の間それから固定されました。

B16 セルの光学画像は図 1. で示されています。 上部のパネルは 20x 水液浸対物レンズを使用して得られる段階の対照の画像です。 より低いパネルはセル端の近くで領域の YFP の蛍光性を示し、 63x オイルの液浸レンズ (NA 1.2) を使用して得られました。 YFP はアクチン単量体を分類します、そう細胞質からの、またアクチンフィラメントからの蛍光シグナルへの貢献があります。

図 1. マウスメラノーマのセルの光学画像。 上部の画像 - 対照、 20x 水液浸レンズを段階的に行なって下さい。 画像 - YFP 分類されたアクチン、 63x オイルの液浸レンズからの蛍光性 -- を下げて下さい。 蛍光性の画像によってカバーされる領域は上部の画像のボックスによってマークされます。

セルの AFM イメージ投射は Dulbecco の PBS の解決で遂行されました。 AFM イメージ投射のために、断続的な接触モードはおよそ 0.3 N/m. のばねの定数があった三角の窒化珪素の片持梁によって、使用されました。 断続的な接触モードでは、 AFM センサーはサンプルの表面に振動し、スキャンナーを制御するのに振動の振幅は使用されています。 このモードはセル表面の地形の両方セル表面のより良い細部を強調する画像および振幅のシグナルからの画像を与えます。

図 2 は B16 マウスメラノーマのセル端の光学および AFM の画像の比較を示します。 上部のパネルは図 1 のように YFP の蛍光性の画像、であり、より低いパネルは 2 つの AFM の振幅のシグナルの画像のモンタージュです。 AFM の振幅のシグナルは地形の勾配と先端が表面にスキャンすると同時に関連しています。 これは地形が側面からついている、表面のより小さい細部は特にはっきり見られますように画像が尾行されてようであることを意味し。 サンプル領域は図 1 でマークされるようにありますが、蛍光性の画像は AFM の画像のより容易な比較のために回りました。 スケール棒は両方のパネルの 2 µm です。

Zeis Axiovert 200 に取付けられた JPK NanoWizard® を使用して視覚化された図 2. B16 マウスメラノーマのセルは光学顕微鏡を逆にしました。 上部のパネル - YFP の蛍光性。 パネル - 同じ領域の 2 つの AFM の振幅のシグナルの画像のモンタージュ -- を下げて下さい。 矢印 - 両方のパネルで見られるアクチンフィラメントの例。 リング - AFM の画像でだけ見られるセル表面の四捨五入された機能の例。 両方のパネルのスケール棒 2 µm。

YFP がすべてのアクチンを (単量体およびフィラメント) 分類するので、細胞質は蛍光性の画像、またアクチンフィラメントで弱く分類されます。 より大きいアクチンフィラメントは AFM および光学蛍光性の画像両方 (2 つの例は矢印が付いている図 2 でマークされます) で見ることができます。 しかし AFM の画像は図 2. で蛍光性の画像で現われない白いリングとマークされる四捨五入された機能のグループのようなセル表面の他の細部を示します。 AFM のパネルの左側は特に根本的なアクチン細胞骨格のパターンとかなり異なっている表面の構造を示します。

繊維芽細胞

マウス皮膚繊維芽細胞はガラス coverslips で育ちました。 次にセルは 45 秒の 2% のグルタルアルデヒトおよびマウスメラノーマのセルに関しては 20 分の 4% のパラホルムアルデヒドと、固定されました。 アクチンフィラメントは製造業者命令によって phalloidin-FITC との 4°C のセルを夜通し孵化させることによって蛍光に、分類されました。 セルは Dulbecco の PBS の解決で視覚化されていました。 蛍光性の画像は 63x オイルの液浸レンズおよび FITC フィルターセットを使用して、上記されているように集められました。

図 3 は隔離された繊維芽細胞の光学画像を示します。 画像は分類されたアクチンフィラメントからの蛍光性を示します。 アクチンは図 1 の YFP、およびメラノーマのセルより開発される繊維芽細胞の細胞骨格より強く分類されます従ってアクチンケーブルは蛍光性の画像ではっきり際立っています。

図 3. マウス皮膚繊維芽細胞のセルの光学画像。 FITC-phalloidin からの蛍光性はアクチンを分類しました。 ホワイトボックスによってマークされる領域は図 4. で示されています。

図 4 すべての画像は図 3. のボックスによってマークされるセル端の領域を示します。 光学蛍光性の画像 (a) は同じ領域の AFM の画像 (B、モンタージュ、 2 つの地形の画像の 2 振幅のシグナルの画像および C のモンタージュ) の比較を促進するために回りました。

JPK NanoWizard® を使用して繊維芽細胞の光学および AFM の画像の図 4. 比較。 A: 蛍光に分類されたアクチン (phalloidin-FITC)。 B: 2 つの AFM の振幅のシグナルの画像のモンタージュ。 C: 2 つの AFM の地形の画像のモンタージュ。 すべての棒 2 µm、 AFM の画像の高さの範囲をです 1.8 µm 位取りして下さい。

セル境界の良い突起は (白い矢印とマークされる) 蛍光性の画像 (a) でかすかに目に見えましたり、しかし AFM の画像 (B の C) ではっきり解決することができます。 セル表面の他の隔離された機能は AFM の画像 (例えば、黒い矢印とマークされる大きい機能) だけで目に見えます。

ここの AFM および光学画像はセルの表面および submembranous 構造両方についての補足情報を与えます。 AFM の画像はセル表面でセル形についての実質の 3D 情報 (地形のシグナルから) および微細構造の印象を両方与えます (振幅のシグナルから)。 光学および構造的情報の組合せは細胞コンポーネントの根本的な特定の細胞膜の構造の識別を可能にします。

扱われた繊維芽細胞

顕微鏡検査の技術のこの組合せから使用できる別の情報のためのアプリケーションを示すためには、繊維芽細胞のセルに対する過酸化水素の apoptotic 効果の22短い調査は (HO) ここに示されます。

マウス皮膚繊維芽細胞は過酸化水素の低い集中と細胞死のカスケードを始めるために扱われました。 扱われたセルは固定ですことおよび標準イメージ投射のために上記されているように分類された糸状の蛍光にアクチンの前の 30 分または 1 時間の 100 つの µM の過酸化水素と、孵化しました。

結果の概要は制御 15 分 (画像シリーズ D-F) または 30 分 (GI) の過酸化水素と扱われるセル (処置無し、画像シリーズ A.C.) およびセルのための図 5 に示されています。 各列に沿う画像は同じセルサンプルのための異なった映像技術を示します。 段階の対照 (A、 D、 G) および epi-flurorescence (B、 E は、 H) 画像同じサンプル領域を示します。 AFM の地形の画像のための領域 (C、 F の I) はボックスとの光学画像でマークされます。 AFM の画像のためのスキャン領域は各ケースの 20 µm X の 20 µm でした。

繊維芽細胞の光学および AFM の画像の図 5. 組合せは過酸化水素と扱いました。 画像シリーズ A.C. は ntrol のセルを (HO 処置無し22 )、 D-F 示します固定の前の 30 分の 100 µM と22 HO 扱われた、示しセルを - I は固定の前の 1 時間扱われたセルを示します。 段階の対照の画像 (A、 D、 G) および TCphalloidin によって分類されるアクチンフィラメントからの epi 蛍光性 (B、 E は各ケースのために、 H) ショー同じ領域をスキャンします。 AFM の地形の画像 (C、 F の I) は 20 の m X 各ケースの 20 の µm スキャン、なぜなら先行する光学画像のボックスによってマークされる領域です。 C d F のための総高さのスケールはいずれの場合も 2.3 µm であり、総高さのスケール I は 9 µm です。 AFM イメージ投射はばねの定数 0.06 N/m. の削られた DNP の片持梁を使用して接触モードで遂行されました。

顕著なアクチンケーブルはすべての 3 つの画像 (AC) で未処理制御セルについては見ることができます。 さらに、 AFM の地形の画像のセル表面の突起に関連する小胞は段階の対照の画像で見ることができます (例えば、 C) で一周されるもの。

100 µM との 30 分の処置の後で HO22、アクチンフィラメントはセルの端から引き込み始めました。 E の蛍光性の画像はセルの周囲でかすかな汚損を示します、細部は対応する AFM の画像 (f) でもっとはっきり見ることができます。 比較的平らな膜の領域は周囲で残っています (細かい網の構造がそれをサポートすることをある矢の F) しかし顕著なアクチンファイバーはともはやセルの端に伸ばさないで下さいマークされる。

1 つの時間ショーのためにと22 HO 扱われるセルセル形態の劇的な変化、およびアクチン細胞骨格の完全な語順換え。 セルは円形に引き込み、なります、アクチンケーブルは減り、 blebs は表面で形作り始めました。

blebs 形式の大きい三次元構造 - 両方の AFM の画像のための総高さのスケールは C and F 最後の画像 (i) のための高さの範囲は 9 µm であるが、 2.3 µm です。 AFM の測定は四捨五入する、表面の blebs はサイズ、形、番号またはボリュームのために分析できますと同時にセル高さの変更の量的な測定を可能にし。 H の蛍光性の画像の比較は bleb の構造の下にあるアクチン細胞骨格を示します。

概要

このレポートはセル形態および応答を調査するための AFM と異なった光学映像技術を結合する可能性のいくつかをもたらしました。 技術を結合することはセル構造および機能について集めることができる情報の範囲を広げます。 セル表面のまたはセルの根本的な部分の特定の分子はセル表面および特定の構造の形態への関係を探索するために分類され、視覚化されます。 これらの調査は生理学的な条件の下で、また更に生体細胞および現在の新しい機会で物理構造と細胞機能間の関係を分析するすることができます。

ソース: JPK の器械

このソースのより多くの情報のために JPK の器械を訪問して下さい

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:06

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