NanoWizard JPK 계기에서 원자 군대 현미경을 사용하는 세포의 결합된 광학 적이고와 AFM 화상 진찰

커버되는 토픽

소개
YFP로 레테르를 붙이는 마우스 흑색종 세포
섬유아세포
취급된 섬유아세포
개요

소개

세포의 광학 AFM 화상 진찰 결합은 특정 분대의 기능적인 레테르를 붙이기 세포 표면에 관하여 구조상 정보 상관을 위한 많은 가능성을 엽니다. 이 보고에서는, 보기는 단계 대조, DIC를 위한 광학적인 현미경 검사법과 결합된 AFM의 보이고 Zeiss Axiovert 200에 거치된 JPK NanoWizard® AFM를 사용하여 epi 형광은 광학적인 현미경을 거꾸로 했습니다.

특정한 응용으로, 세포는 과산화 수소로 apoptotic blebbing를 유도하기 위하여 취급되었습니다. 광학 적이고와 AFM 화상 진찰의 조합은 소포가 형성하는 때 막 표면에 있는 변경, 와 그(것)들 아래에 악틴 세포 뼈대의 구조물 사이 링크의 더 나은 해석을 허용합니다.

YFP로 레테르를 붙이는 마우스 흑색종 세포

첫번째 보기에서는, 마우스 흑색종 이차 세포 선 (B16)는 이용되었습니다. 이 세포 선에서는, 악틴은 노랗 형광성 단백질로 레테르를 붙였습니다 (YFP). 세포는 박사 Clemens 프란츠 (셀 방식 기계 단, Biotechnologisches Zentrum, TU 드레스덴)에게서 친절한 선물이었습니다.

이 세포 선에 있는 세포는 증가하기 때문에 특히 이동할 수 있고 잘 고착하지 않습니다, 그래서 화상 진찰의 앞에 조정 이었습니다. 세포는 단지 45 초 동안 2% glutaraldehyde로, glutaraldehyde에서 형광 기여금을 극소화하기 위하여 취급되고, 세포는 4% paraformaldehyde에 있는 20 분 동안 그 때 고쳐졌습니다.

B16 세포의 광학적인 심상은 숫자 1.에서 보입니다. 위 위원회는 20x 근해 침수 목적을 사용하여 장악된 단계 대조 심상입니다. 더 낮은 위원회는 세포 가장자리의 가까이에 지구의 YFP 형광을 보여주고 63x 기름 침수 렌즈 (NA 1.2)를 사용하여 장악되었습니다. 악틴 단위체가 YFP에 의하여 레테르를 붙입니다, 이렇게 세포질에서 뿐 아니라 악틴 필라멘트에서 형광성 신호에 어떤 기여금이 있습니다.

숫자 1. 마우스 흑색종 세포의 광학적인 심상. 위 심상 - 대조, 20x 근해 침수 렌즈를 실행하십시오. 심상 - YFP 레테르를 붙인 악틴, 63x 기름 침수 렌즈에서 형광을 낮추십시오. 형광 심상에 의해 포함된 지구는 위 심상에 있는 상자로 표를 합니다.

세포의 AFM 화상 진찰은 Dulbecco의 PBS 해결책에서 실행되었습니다. AFM 화상 진찰을 위해, 간헐적인 접촉형은 약 0.3 N/m.의 봄 불변의 것이 있던 삼각형 실리콘 질화물 외팔보에는 함께, 사용되었습니다. 간헐적인 접촉형에서는, AFM 센서는 견본의 표면에 전류를 고주파로 변환시키고, 진동의 진폭은 스캐너를 통제하기 위하여 이용됩니다. 이 최빈값은 세포 표면의 지세 둘 다 심상 및 세포 표면의 더 정밀한 세부사항을 강조하는 진폭 신호에서 심상을 줍니다.

숫자 2는 B16 마우스 흑색종 세포 가장자리의 광학 적이고와 AFM 심상의 비교를 보여줍니다. 위 위원회는 숫자 1에서 것과 같이 YFP 형광 심상, 이고, 더 낮은 위원회는 2개의 AFM 진폭 신호 심상의 몽타주입니다. AFM 진폭 신호는 지세의 기온변화도와 끝이 표면에 검사하는 때 관련있습니다. 이것은 지세가 측에서 점화하다 처럼 심상이 그늘지게 해 나타난다는 것을 의미합니다, 표면의 더 작은 세부사항은 특히 명확하게 보이고. 견본 지역은 숫자 1에서 표를 하는 것과 같이 입니다, 그러나 형광 심상은 AFM 심상을 가진 더 쉬운 비교를 위해 자전했습니다. 가늠자 바는 두 위원회 전부에 있는 2 µm입니다.

Zeis Axiovert 200에 거치된 JPK NanoWizard®를 사용하여 imaged 숫자 2. B16 마우스 흑색종 세포는 광학적인 현미경을 거꾸로 했습니다. 위 위원회 - YFP 형광. 위원회 - 동일 지구의 2개의 AFM 진폭 신호 심상의 몽타주를 낮추십시오. 활촉 - 두 위원회 전부에서 보이는 악틴 필라멘트의 보기. 반지 - AFM 심상에서서만 보이는 세포 표면에 돌린 특징의 보기. 두 위원회 전부에 있는 가늠자 바 2 µm.

모든 악틴이 YFP에 의하여 (단위체와 필라멘트) 레테르를 붙이기 때문에, 세포질은 형광 심상, 뿐 아니라 악틴 필라멘트에서 약하게 레테르를 붙입니다. 더 큰 악틴 필라멘트는 AFM 및 광학적인 형광 심상 둘 다 (2개의 보기는 활촉을 가진 숫자 2에서 표를 합니다)에서 보일 수 있습니다. AFM 심상은 숫자 2.에 있는 형광 심상에서 나타나지 않는 백색 반지로 표를 한 돌린 특징의 단과 같은 세포 표면의 그밖 세부사항을, 그러나 보여줍니다. AFM 위원회의 좌측은 특히 근본적인 악틴 세포 뼈대의 패턴과 확실히 다른 지상 구조물을 보여줍니다.

섬유아세포

마우스 피부 섬유아세포는 유리제 coverslips에 증가되었습니다. 세포는 45 초 동안 2% glutaraldehyde 및 그 후에 마우스 흑색종 세포에 관해서는 20 분 동안 4% paraformaldehyde로, 고쳐졌습니다. 악틴 필라멘트는 제조자 명령에 의하여 phalloidin-FITC를 가진 4°C에 세포를 밤새껏 잠복해서 형광성으로, 레테르를 붙였습니다. 세포는 Dulbecco의 PBS 해결책에서 imaged 이었습니다. 형광 심상은 63x 기름 침수 렌즈와 FITC 필터 세트를 사용하여, 위에 기술한 대로 집합되었습니다.

숫자 3은 고립된 섬유아세포의 광학적인 심상을 보여줍니다. 심상은 레테르를 붙인 악틴 필라멘트에서 형광을 보여줍니다. 악틴은 숫자 1에 있는 YFP, 및 흑색종 세포 보다 개발된 섬유아세포의 세포 뼈대 더 강하게 레테르를 붙입니다, 그래서 악틴 케이블은 형광 심상 에서 명확하게 우수합니다.

숫자 3. 마우스 피부 섬유아세포 세포의 광학적인 심상. 악틴이 FITC-phalloidin에서 형광에 의하여 레테르를 붙였습니다. 백색 상자로 표를 한 지역은 숫자 4.에서 보입니다.

숫자 4 전부에 있는 심상은 숫자 3.에 있는 상자로 표를 하는 세포 가장자리의 지구를 보여줍니다. 광학적인 형광 심상 (a)는 동일 지역의 AFM 심상 (B, 몽타주, 2개의 지세 심상의 2 진폭 신호 심상 및 C의 몽타주)를 가진 비교를 촉진하기 위하여 자전했습니다.

JPK NanoWizard®를 사용하는 섬유아세포의 광학 적이고와 AFM 심상의 숫자 4. 비교. A: 형광성으로 레테르를 붙인 악틴 (phalloidin-FITC). B: 2개의 AFM 진폭 신호 심상의 몽타주. C: 2개의 AFM 지세 심상의 몽타주. 모두에 있는 바 2 µm, AFM 심상의 고도 범위를입니다 1.8 µm 오르십시오.

(백색 활촉으로 표를 하는) 셀 경계에 정밀한 돌출은 감도불량하게 형광 심상 (a)에서 눈에 보이고, 그러나 AFM 심상 (B 의 C)에서 명확하게 해결될 수 있습니다. 세포 표면에 그밖 고립된 특징은 AFM 심상 (예를 들면, 까만 활촉으로 표를 하는 큰 특징)에서서만 눈에 보입니다.

여기에서 AFM 및 광학적인 심상은 세포의 표면 및 submembranous 구조물 둘 다에 관하여 무료한 정보를 제공합니다. AFM 심상은 세포 표면에 세포 모양에 관하여 실제적인 3번째 정보 (지세 신호에서) 및 미세 구조의 느낌을 모두 줍니다 (진폭 신호에서). 광학과 구조상 정보의 조합은 셀 방식 분대 근본적인 특정한 세포막 구조물의 식별을 허용합니다.

취급된 섬유아세포

현미경 검사법 기술의 이 조합에서 가능한 다른 정보를 위한 응용을 설명하기 위하여는, 섬유아세포 세포에 대한 과산화 수소의 apoptotic 효력의22 짧은 연구 결과는 (HO) 여기에서 제출됩니다.

마우스 피부 섬유아세포는 과산화 수소의 낮은 사격량으로 세포 죽음 연결 메시지를 개시하기 위하여 취급되었습니다. 취급된 세포는 조정 이곤과 표준 화상 진찰을 위해 위에 기술한 대로 레테르를 붙인 실같은 형광성으로 악틴의 앞에 30 분 1 시간 동안 100개의 µM 과산화 수소로, 잠복했습니다.

결과의 개관은 통제 세포 (처리 없음, 심상 시리즈 A.C.)와 15 분 (심상 시리즈 D-F) 또는 30 분 (GI) 동안 과산화 수소로 취급된 세포를 위한 숫자 5에 나타납니다. 각 줄에 따라서 심상은 동일 세포 견본을 위한 다른 화상 기술을 보여줍니다. 단계 대조 (A, D, G) 및 epi-flurorescence (B, E는, H) 심상 동일 견본 지역을 보여줍니다. AFM 지세 심상을 위한 지구 (C, F 의 I)는 상자를 가진 광학적인 심상에서 표를 합니다. AFM 심상을 위한 검사 지역은 각 케이스에 있는 20 µm x 20 µm이었습니다.

섬유아세포의 광학 적이고와 AFM 심상의 숫자 5. 조합은 과산화 수소로 취급했습니다. 심상 시리즈 A.C.는 ntrol 세포를 (HO 처리 없음22 ), D-F 보여줍니다 기정의 앞에 30 분 동안 100 µM로22 HO 취급된 세포를, - 보여주고 I는 기정의 앞에 1 시간 동안 취급된 세포를 보여줍니다. 단계 대조 심상 (A, D, G) 및 TC에 의하여 레테르를 붙이는 악틴 필라멘트에서 epi 형광 (B, E는 각 케이스를 위해, H) 쇼 동일 지역을 검사합니다. AFM 지세 심상 (C, F 의 I)는 20 m x 각 케이스에 있는 20의 µm 검사, 왜냐하면 선행하는 광학적인 심상에 있는 상자로 표를 한 지구입니다. C d F를 위한 총 고도 가늠자 양쪽의 경우에 2.3 µm이고, 총 고도 가늠자 안으로 I 9 µm입니다. AFM 화상 진찰은 봄 불변의 것 0.06 N/m.를 가진 날카롭게 한 DNP 외팔보를 사용하여 접촉형에서 실행되었습니다.

탁월한 악틴 케이블은 모든 3개의 심상 (AC)에서 치료되지 않는 통제 세포를 위해 보일 수 있습니다. 추가적으로, AFM 지세 심상에 있는 세포 표면에 돌출과 상관하는 소포는 단계 대조 심상에서 보일 수 있습니다, (예를 들면, C)에서 도는 것.

100 µM를 가진 30 분 동안 처리 후에 HO22, 악틴 필라멘트는 세포의 가장자리에서 끌어 넣는 것을 시작했습니다. E에 있는 형광 심상은 세포의 주변에 감도불량한 얼룩이 지기 보여줍니다, 그러나 세부사항은 대응 AFM 심상 (f)에서 더 명확하게 보일 수 있습니다. 상대적으로 편평한 막의 지구는 고운 망사 구조물이 그것을 지원하는 있는 화살에서 F), 그러나 탁월한 악틴 섬유에는으로 표를 한 주변에 남겨둡니다 (더 이상 세포의 가장자리까지 미치지 마십시오.

1개 시간 쇼를 위해로22 HO 취급되는 세포 세포 형태학에 있는 극적인 변화, 및 악틴 세포 뼈대의 완전한 재배열. 세포는 더 둥글게 끌어 넣고 됩니다, 악틴 케이블은 감소되고 blebs는 표면에 형성하는 것을 시작했습니다.

마지막 심상 (i)를 위한 고도 범위는 9 µm인 그러나, blebs 양식 큰 3차원 구조물 - 두에 있는 AFM 심상을 위한 총 고도 가늠자 C and F 2.3 µm입니다. AFM 측정은 위로 돌 때 세포 고도 변경의 양이 많은 측정을 허용합니다, 지상 blebs는 규모, 모양, 수 또는 양을 위해 분석되고. H에 있는 형광 심상을 가진 비교는 bleb 구조물을 밑에 있는 악틴 세포 뼈대를 보여줍니다.

개요

이 보고는 몇몇을의 세포 형태학과 반응 공부를 위한 AFM와 다른 광학적인 화상 기술 결합의 가능성 소개했습니다. 기술을 결합하는 것은 세포 구조물과 기능에 관하여 모일 수 있는 정보 범위를 넓힙니다. 세포 표면에 또는 세포의 근본적인 부분에서 특정 분자는 세포 표면 및 특정한 구조물의 형태학에 그들 관계를 탐구하기 위하여 레테르를 붙이고 imaged 일 수 있습니다. 이 수사는 생리적인 조건 하에서, 또는 물리 구조와 셀 방식 기능 사이 관계를 분석하는 생세포 및 존재하는 새로운 기회에 끝날 수 있습니다.

근원: JPK 계기

이 근원에 추가 정보를 위해 JPK 계기를 방문하십시오

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:09

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit