Gecombineerde Optisch en Weergave AFM van Cellen die de AtoomMicroscoop van de Kracht NanoWizard van Instrumenten JPK Gebruiken

Besproken Onderwerpen

Inleiding
Melanoma van de Muis de Cellen Etiketteerden met YFP
Fibroblasten
Behandelde Fibroblasten
Samenvatting

Inleiding

Optisch Combineren en weergave AFM van cellen biedt vele mogelijkheden voor correlerende structurele informatie over de celoppervlakte met functionele etikettering van bepaalde componenten. In dit rapport dat, worden de voorbeelden van AFM getoond met de optische microscopie voor fasecontrast, DIC en epi-fluorescentie wordt gecombineerd gebruikend een JPK NanoWizard® AFM opgezet op Zeiss Axiovert 200 omgekeerde optische microscoop.

Als bepaalde toepassing, werden de cellen behandeld met waterstofperoxyde om het apoptotic blebbing te veroorzaken. De combinatie van optisch en weergave AFM staat betere interpretatie van het verband tussen de veranderingen in de membraanoppervlakte aangezien toe de blaasjes zich, en de structuur van actin cytoskeleton onder hen vormen.

Melanoma van de Muis de Cellen Etiketteerden met YFP

In het eerste voorbeeld, werd een muismelanoma secundaire cellenvariëteit (B16) gebruikt. In deze cellenvariëteit, werd actin geëtiketteerd met geel-fluorescente proteïne (YFP). De cellen waren een vriendelijke gift van Dr. Clemens Franz (de Cellulaire Groep van Machines, Biotechnologisches Zentrum, TURKIJE Dresden).

De cellen in deze cellenvariëteit zijn bijzonder mobiel en hangen niet goed aan aangezien zij groeien, zodat werden zij bevestigd vóór weergave. De cellen werden behandeld met 2% glutaraldehyde slechts 45 seconden, om de fluorescentiebijdrage van glutaraldehyde te minimaliseren, en de cellen werden toen bevestigd 20 minuten in 4% paraformaldehyde.

De Optische beelden van een B16 cel worden getoond in Figuur 1. Het hogere paneel is een verkregen beeld die van het fasecontrast een 20x doelstelling van de wateronderdompeling gebruiken. Het lagere paneel toont de fluorescentie YFP van een gebied dichtbij de celrand en gebruikend een 63x lens van de olieonderdompeling (NA 1.2) verkregen. YFP etiketteert de actin monomeren, zodat is er één of andere bijdrage tot het fluorescente signaal van het cytoplasma evenals van actin gloeidraden.

Figuur 1. Optische beelden van een muismelanoma cel. Hoger beeld - fasecontrast, 20x de lens van de wateronderdompeling. Lager beeld - fluorescentie van YFP-Geëtiketteerde actin, 63x de lens van de olieonderdompeling. Het gebied omvat door het fluorescentiebeeld is duidelijk met een doos in het hogere beeld.

De weergave AFM van de cellen werd uitgevoerd in de oplossing van PBS van Dulbecco. Voor weergave AFM, werd de intermitterende contactwijze gebruikt, met de driehoekige cantilevers van het siliciumnitride die de lente constant van rond 0.3 N/m. hadden. Op intermitterende contactwijze, oscilleert de sensor AFM over de oppervlakte van de steekproef, en de omvang van de schommeling wordt gebruikt om de scanner te controleren. Deze wijze geeft zowel topografiebeelden van de celoppervlakte als beelden van het omvangsignaal, die de fijnere details van de celoppervlakte benadrukken.

Figuur 2 toont een vergelijking van optisch en beelden AFM van de B16 muismelanoma celrand. Het hogere paneel is een YFP fluorescentiebeeld, zoals in Figuur 1, en het lagere paneel is een montering van twee AFM beelden van het omvangsignaal. Het AFM omvangsignaal is verwant met de gradiënt van de topografie als uiteindeaftasten over de oppervlakte. Dit betekent dat de beelden in de schaduw gesteld lijken, alsof de topografie van de kant wordt aangestoken, en de kleinere details van de oppervlakte worden bijzonder duidelijk gezien. Het steekproefgebied is zoals duidelijk in Figuur 1, maar het fluorescentiebeeld is geroteerd voor gemakkelijkere vergelijking met de beelden AFM. De schaalbar is 2 µm in beide panelen.

Figuur 2. B16 muismelanoma cel het imaged zette gebruiken JPK NanoWizard® op Zeis Axiovert 200 omgekeerde optische microscoop op. Hoger paneel - fluorescentie YFP. Lager paneel - montering van twee AFM beelden van het omvangsignaal van het zelfde gebied. Pijlpunten - voorbeelden van actin gloeidraden in beide panelen worden gezien dat. Ring - voorbeeld van rond gemaakte die eigenschappen op de celoppervlakte, slechts in de beelden AFM wordt gezien. Bar 2 µm van de Schaal in beide panelen.

Aangezien YFP al actin (monomeren en gloeidraden) etiketteert, wordt het cytoplasma zwak geëtiketteerd in het fluorescentiebeeld, evenals de actin gloeidraden. De grotere actin gloeidraden kunnen in zowel AFM als de optische fluorescentiebeelden (twee voorbeelden zijn duidelijk in Figuur 2 met pijlpunten) worden gezien. De beelden AFM tonen andere details van de celoppervlakte, echter, die niet in het fluorescentiebeeld verschijnen, zoals de groep rond gemaakte eigenschappen duidelijk met een witte ring in Figuur 2. De linkerpartij van het paneel AFM toont in het bijzonder oppervlaktestructuur die van het patroon van onderliggende actin cytoskeleton vrij verschillend is.

Fibroblasten

Werden de huidfibroblasten van de Muis gekweekt op glascoverslips. De cellen werden bevestigd met 2% glutaraldehyde voor 45 seconden en toen 4% paraformaldehyde 20 minuten, zoals voor de muismelanoma cellen. De actin gloeidraden werden fluorescently geëtiketteerd door de cellen bij 4°C met phalloidin-FITC, vanaf fabrikanteninstructies 's nachts uit te broeden. De cellen waren imaged in de oplossing van PBS van Dulbecco. Beelden van de Fluorescentie werden verzameld zoals hierboven beschreven, gebruikend een 63x de lens en FITC de filterreeks van de olieonderdompeling.

Figuur 3 toont een optisch beeld van een geïsoleerde fibroblast. Het beeld toont de fluorescentie van de geëtiketteerde actin gloeidraden. Actin wordt sterker geëtiketteerd dan voor YFP in Figuur 1, en cytoskeleton van de fibroblast dan voor de melanoma cel wordt ontwikkeld, zodat komen de actin kabels duidelijk in het fluorescentiebeeld dat duidelijk uit.

Figuur 3. Optisch beeld van een cel van de muis huidfibroblast. Fluorescentie van FITC -FITC-phalloidin geëtiketteerde actin. Het gebied duidelijk met de witte doos wordt getoond in Figuur 4.

De beelden in Figuur 4 allen tonen het gebied van de celrand die met een doos in Figuur 3 duidelijk is. Het optische fluorescentiebeeld (a) is geroteerd om vergelijking met de beelden AFM (B, montering van de beelden van het twee omvangsignaal en C, montering van twee topografiebeelden) van het zelfde gebied te vergemakkelijken.

Figuur 4. Vergelijking van optisch en beelden AFM van een fibroblast die JPK NanoWizard® gebruiken. A: fluorescently geëtiketteerde actin (phalloidin-FITC). B: montering van twee AFM beelden van het omvangsignaal. C: montering van twee AFM topografiebeelden. Bar 2 µm van de Schaal over het geheel genomen, hoogtewaaier van beeld AFM is 1.8 µm.

De fijne uitsteeksels bij de celgrens (duidelijk met witte pijlpunten) zijn flauw zichtbaar in het fluorescentiebeeld (a), maar kunnen duidelijk in de beelden AFM (B, C) worden opgelost. Andere geïsoleerde eigenschappen aan de celoppervlakte zijn slechts zichtbaar in de beelden AFM (bijvoorbeeld, de grote eigenschap duidelijk met een zwarte pijlpunt).

AFM en de optische beelden geven hier bijkomende informatie over zowel de oppervlakte van de cel als submembranous structuren. De beelden AFM geven zowel echte 3-D informatie over de celvorm (van het topografiesignaal) en een indruk van de fijne structuren aan de celoppervlakte (van het omvangsignaal). De combinatie van optische en structurele informatie staat de identificatie van de cellulaire het membraanstructuren van de componenten onderliggende bijzondere cel toe.

Behandelde Fibroblasten

Om een toepassing voor de verschillende informatie aan te tonen die bij deze combinatie de microscopietechnieken beschikbaar is, wordt een korte studie van de apoptotic gevolgen van waterstofperoxyde (HO22) voor de fibroblastcellen hier voorgesteld.

De muis huidfibroblasten werden behandeld met lage concentraties van waterstofperoxyde om een cascade van de celdood in werking te stellen. De behandelde cellen werden uitgebroed met waterstofperoxyde 100 µM of 30 minuten of één uur, alvorens wordt bevestigd en draderige actin geëtiketteerd fluorescently zoals die hierboven voor de standaardweergave wordt beschreven.

Een overzicht van de resultaten wordt gegeven in Figuur 5 voor controlecellen (geen die behandeling, beeldreeks A.C.) en cellen met waterstofperoxyde 15 minuten (beeldreeks D-F) worden behandeld of 30 minuten (G-I). De beelden langs elke rij tonen verschillende weergavetechnieken voor de zelfde celsteekproef. Het fasecontrast (A, D, G) en de epi-flurorescence (B, E, H) beelden tonen het zelfde steekproefgebied. Het gebied voor de AFM topografiebeelden (C, F, I) is duidelijk in de optische beelden met een doos. Het aftastengebied voor de beelden AFM was 20 µm x 20 µm in elk geval.

Figuur 5. Combinatie van optisch en beelden AFM van fibroblasten met waterstofperoxyde worden behandeld die. De reeks A.C. van het Beeld toont ntrolcellen (geen behandeling22 HO), toont D-F cellen die met 100 µM HO 22 30 minuten vóór bevestiging zijn behandeld, en - I toont cellen die één uur vóór bevestiging zijn behandeld. Faseer contrastbeelden (A, D, G) en de epi-fluorescentie van TC -TC-phalloidin geëtiketteerde actin gloeidraden (B, E, H) toont het zelfde aftastengebied voor elk geval. AFM de topografiebeelden (C, F, I) zijn 20 m x 20 aftasten µm in elk geval, voor het gebied duidelijk met een doos in de voorafgaande optische beelden. De totale hoogteschaal voor C D F is 2.3 µm in zowel gevallen, als de totale hoogteschaal in I is 9 µm. De weergave AFM werd uitgevoerd op contactwijze gebruikend gescherpte cantilevers DNP met de lenteconstante 0.06 N/m.

De Prominente actin kabels kunnen in alle drie beelden (AC) voor de onbehandelde controlecellen worden gezien. Bovendien kunnen de blaasjes in het beeld van het fasecontrast worden gezien, die met uitsteeksels op de celoppervlakte in de AFM topografiebeelden correleren (bijvoorbeeld, omcirkeld in C).

Na behandeling 30 minuten met 100 µM HO22, zijn de actin gloeidraden om van de randen van de cellen begonnen in te trekken. Het fluorescentiebeeld in E toont het vage bevlekken bij de periferie van de cel, maar de details kunnen duidelijker in het overeenkomstige AFM beeld (f) worden gezien. Een gebied van vrij vlak membraan wordt verlaten bij de periferie (duidelijk met een pijl in F) die een boete heeft - schakel structuur ondersteunend het in, maar de prominente actin vezels breiden zich niet meer tot de rand van de cel uit.

De cellen met HO 22 één uur worden behandeld tonen een dramatische verandering in de celmorfologie, en een volledige herschikking die van actin cytoskeleton. De cellen hebben ingetrokken en rounder geworden, worden de actin kabels verminderd en blebs zijn om zich op de oppervlakte begonnen te vormen.

Blebs vormen grote driedimensionele structuren - de totale hoogteschaal voor de beelden AFM in zowel C als F is 2.3 µm, terwijl de hoogtewaaier voor het laatste beeld (i) 9 µm is. De metingen AFM staan een kwantitatieve maatregel van de verandering in celhoogte aangezien toe het omhoog rond maakt, en oppervlakteblebs zouden voor grootte, vorm, aantal of volume kunnen worden geanalyseerd. De Vergelijking met het fluorescentiebeeld in H toont actin cytoskeleton die aan de bleb structuren ten grondslag liggen.

Samenvatting

Dit rapport heeft enkele mogelijkheden geïntroduceerd om verschillende optische weergavetechnieken met AFM te combineren voor het bestuderen van de celmorfologie en reacties. Het Combineren van technieken verwijdt de waaier van informatie die over celstructuur en functie kan worden verzameld. De Specifieke molecules op de celoppervlakte of in de onderliggende delen van de cel kunnen worden geëtiketteerd en imaged om hun verhouding aan de morfologie van de celoppervlakte en de bijzondere structuren te onderzoeken. Deze onderzoeken kunnen in de fysiologische omstandigheden, of zelfs op levende cellen worden gedaan, en bieden nieuwe kansen om het verband tussen fysieke structuren en cellulaire functie te analyseren.

Bron: Instrumenten JPK

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve Instrumenten JPK

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:52

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit