:: AZoNanotechnology Artikel
.jpg)
Besproken onderwerpen
Introductie
Muis melanoomcellen Gelabeld met YFP
Fibroblasten
Behandeld Fibroblasten
Overzicht
Introductie
Combining optische en AFM beeldvorming van cellen opent veel mogelijkheden voor het correleren van structurele informatie over het celoppervlak met functionele etikettering van bepaalde onderdelen. In dit rapport, voorbeelden worden getoond van de AFM in combinatie met optische microscopie voor fase contrast, DIC en epi-fluorescentie met behulp van een JPK NanoWizard ® AFM gemonteerd op een Zeiss Axiovert 200 omgekeerde optische microscoop.
Als een bepaalde toepassing, werden de cellen behandeld met waterstofperoxide om apoptotische blebbing induceren. De combinatie van optische en imaging AFM maakt een betere interpretatie van de verbanden tussen de veranderingen in het membraanoppervlak als blaasjes vormen, en de structuur van het actine cytoskelet onder hen.
Muis melanoomcellen Gelabeld met YFP
In het eerste voorbeeld, was een muis melanoom tweede cellijn (B16) gebruikt. In deze cellijn, was het actine gelabeld met geel-fluorescerend eiwit (YFP). De cellen werden een soort geschenk van Dr Clemens Franz (Cellular Machines Groep, Biotechnologisches Zentrum, TU Dresden).
De cellen in deze cellijn zijn bijzonder mobiel en niet goed hechten als ze groeien, dus ze waren vastgesteld voordat beeldvorming. De cellen werden behandeld met 2% glutaaraldehyde voor slechts 45 seconden, het minimaliseren van de fluorescentie bijdrage van de glutaaraldehyde, en de cellen werden vervolgens vastgesteld voor 20 minuten in 4% paraformaldehyde.
Optische beelden van een B16-cel zijn weergegeven in figuur 1. Het bovenste paneel is een fase-contrast verkregen beeld met een 20x water immersie objectief. Het onderste paneel toont de YFP fluorescentie van een regio in de buurt van de cel rand en werd verkregen met behulp van een 63x olie-immersie lens (NA 1.2). De YFP labels het actine monomeren, dus er is enige bijdrage aan het fluorescerende signaal van het cytoplasma als van actine filamenten.
.jpg)
Figuur 1. Optische beelden van een muis melanoom cel. Bovenste afbeelding - fasecontrast, 20x onderdompeling in water lens. Onderste afbeelding - fluorescentie van YFP-label actine, 63x olie-immersie lens. Het gebied valt onder de fluorescentie beeld is gemarkeerd met een doos in de bovenste afbeelding.
AFM beeldvorming van de cellen werd uitgevoerd in Dulbecco's PBS-oplossing. Voor de AFM beeldvorming, werd onderbroken contact-modus gebruikt, met driehoekige siliciumnitride uitkragingen dat een veerconstante van had ongeveer 0,3 N / m. In de intermitterende contact opnemen met de modus, de AFM sensor oscilleert over het oppervlak van het monster, en de amplitude van de trilling wordt gebruikt om de scanner te controleren. Deze modus geeft zowel topografie afbeeldingen van het celoppervlak en beelden uit de amplitude signaal, dat de fijnere details van het celoppervlak te markeren.
Figuur 2 toont een vergelijking van de optische en AFM beelden van de B16 melanoom muis cel rand. Het bovenste paneel is een YFP fluorescentie beeld, zoals in figuur 1, en het onderste paneel is een montage van twee AFM amplitudesignaal beelden. De AFM amplitude signaal is gerelateerd aan de helling van de topografie als de tip over het oppervlak scant. Dit betekent dat de afbeeldingen worden weergegeven schaduw, alsof de topografie is verlicht vanaf de zijkant, en de kleinere details van het oppervlak zijn bijzonder duidelijk te zien. Het monster gebied is, zoals aangegeven in figuur 1, maar de fluorescentie beeld is gedraaid voor eenvoudiger vergelijking met de AFM beelden. De schaal bar is 2 micrometer in beide panelen.
.jpg)
Figuur 2. B16 muis melanoomcellijnen beeld gebracht met behulp van JPK NanoWizard ® gemonteerd op Zeiss Axiovert 200 omgekeerde optische microscoop. Bovenste paneel - YFP fluorescentie. Onderste paneel - montage van de AFM twee amplitudesignaal beelden van hetzelfde gebied. Pijlpunten - voorbeelden van actine filamenten zien in beide panelen. Ring - voorbeeld van de afgeronde functies op het celoppervlak, en wel alleen in het AFM beelden. Schaalbalk 2 micrometer in beide panelen.
Sinds de YFP labels alle actine (monomeren en filamenten), is het cytoplasma zwak geëtiketteerd in de fluorescentie beeld, evenals de actine filamenten. De grotere actine filamenten is te zien in zowel de AFM en de optische fluorescentie beelden (twee voorbeelden zijn aangegeven in figuur 2 met pijlpunten). De AFM beelden tonen andere details van het celoppervlak, maar doen dat niet in de fluorescentie beeld, zoals de groep van de ronde heeft gemarkeerd met een witte ring in figuur 2. De linkerkant van de AFM paneel toont in het bijzonder oppervlaktestructuur die is heel anders dan het patroon van de onderliggende actine cytoskelet.
Fibroblasten
Muis dermale fibroblasten werden gekweekt op glas dekglaasjes. De cellen werden gefixeerd met 2% glutaaraldehyde gedurende 45 seconden en 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten, als voor de muis melanoom cellen. De actine filamenten werden fluorescent gelabelde door het incuberen van de cellen gedurende de nacht bij 4 ° C met phalloidin-FITC, volgens instructies van de fabrikant. De cellen werden afgebeeld in Dulbecco's PBS-oplossing. Fluorescentie beelden werden verzameld zoals hierboven beschreven, met behulp van een 63x olie-immersie lens en het FITC-filter in te stellen.
Figuur 3 toont een optisch beeld van een geïsoleerde fibroblasten. Het beeld toont de fluorescentie van het label actine filamenten. De actine is sterker gelabeld dan voor de YFP in figuur 1, en het cytoskelet van de fibroblast meer ontwikkeld dan voor de melanoom cel, zodat het actine kabels duidelijk afsteken in de fluorescentie beeld.
.jpg)
Figuur 3. Optisch beeld van een muis dermale fibroblasten cel. Fluorescentie van FITC-gelabeld phalloidin actine. Het gebied gemarkeerd met de witte doos is weergegeven in Figuur 4.
De beelden in figuur 4 alle tonen de regio van de cel rand die is gemarkeerd met een box in figuur 3. De optische fluorescentie beeld (A) is gedraaid om vergelijking met de AFM beelden (B, montage van twee amplitudesignaal beelden en C, montage van twee topografie afbeeldingen) van hetzelfde gebied te vergemakkelijken.
.jpg)
Figuur 4. Vergelijking van de optische en AFM beelden van een fibroblast met JPK NanoWizard ®. A: fluorescent gelabelde actine (phalloidin-FITC). B: montage van de AFM twee amplitudesignaal beelden. C: montage van de AFM twee topografie afbeeldingen. Schaalbalk 2 micrometer in alle, hoogtebereik van de AFM beeld is 1,8 micrometer.
De fijne uitsteeksels in de cel grens (gemarkeerd met witte pijlpunten) zijn vaag zichtbaar in de fluorescentie beeld (A), maar kan duidelijk worden opgelost in de AFM beelden (B, C). Andere geïsoleerde functies op het celoppervlak zijn alleen zichtbaar in de AFM-beelden (bijvoorbeeld de grote feature gemarkeerd met een zwarte pijl).
De AFM en optische beelden hier geven aanvullende informatie over zowel de oppervlakte van de cel en submembranous structuren. De AFM beelden geven zowel de echte 3-D informatie over de cel vorm (van de topografie signaal) en een indruk van de fijne structuren op het celoppervlak (van de amplitude-signaal). De combinatie van optische en structurele informatie maakt de identificatie van de cellulaire componenten ten grondslag liggen aan bepaalde cel membraan structuren.
Behandeld Fibroblasten
Om aan te tonen een aanvraag voor de verschillende informatie die beschikbaar is uit deze combinatie van microscopie technieken, een korte studie van de apoptotische effecten van waterstofperoxide (H 2 O 2) op de fibroblast cellen wordt hier gepresenteerd.
De muis dermale fibroblasten werden behandeld met lage concentraties van waterstofperoxide in een cel dood cascade initiëren. De behandelde cellen werden geïncubeerd met 100 uM waterstofperoxide voor zowel 30 minuten of een uur, voordat ze de vaste en de filamenteuze actine fluorescent gelabelde zoals hierboven beschreven voor de standaard beeldvorming.
Een overzicht van de resultaten is gegeven in figuur 5 voor controle cellen (geen behandeling, beeld-serie AC) en de cellen behandeld met waterstofperoxide gedurende 15 minuten (afbeelding series DF) of 30 minuten (GI). De beelden langs elke rij tonen verschillende beeldvormende technieken voor de dezelfde cel monster. De fase contrast (A, D, G) en epi-flurorescence (B, E, H) beelden tonen hetzelfde monster gebied. De regio voor de AFM topografie afbeeldingen (C, F, I) is aangegeven in de optische beelden met een doos. De scan gebied voor de AFM beelden was 20 micrometer x 20 micrometer in elk geval.
.jpg)
Figuur 5. Combinatie van optische en AFM beelden van fibroblasten behandeld met waterstofperoxide. Afbeelding serie AC toont ntrol cellen (geen H 2 O 2 behandeling), DF toont aan cellen die zijn met 100 uM H 2 O 2 behandeld gedurende 30 minuten voor fixatie, en ik laat zien cellen die zijn gedurende een uur behandeld voor fixatie. Fase contrastrijke beelden (A, D, G) en epi-fluorescentie van TC-phalloidin gelabeld actine filamenten (B, E, H) hetzelfde scangebied show voor elk geval. AFM topografie afbeeldingen (C, F, I) zijn 20 mx 20 um scans in elk geval voor de regio gemarkeerd met een doos in de voorgaande optische beelden. De totale hoogte schaal voor C d F is 2,3 micrometer in beide gevallen, en de totale hoogte schaal in I is 9 micrometer. AFM beeldvorming werd uitgevoerd in contact modus met behulp van geslepen DNP uitkragingen met veerconstante 0,06 N / m.
Prominente actine kabels zijn te zien in alle drie de beelden (AC) voor de onbehandelde controle cellen. Daarnaast kunnen blaasjes te zien in de fase contrastrijk beeld, die correleert met uitsteeksels op het celoppervlak van de AFM topografie afbeeldingen (bijvoorbeeld de een omcirkeld in C).
Na behandeling gedurende 30 minuten met de 100 uM H 2 O 2, zijn de actine filamenten begon terug te trekken van de randen van de cellen. De fluorescentie beeld in E shows zwakke vlekken in de periferie van de cel, maar de details kan meer duidelijk te zien in de overeenkomstige AFM afbeelding (F). Een gebied met relatief vlakke membraan wordt overgelaten aan de rand (aangeduid met een pijl in F), die een fijnmazige structuur die het heeft, maar de prominente actine vezels niet meer uit te breiden tot de rand van de cel.
De cellen behandeld met H 2 O 2 gedurende een uur laten een dramatische verandering in cel morfologie, en een complete herschikking van het actine cytoskelet. De cellen zijn ingetrokken en worden ronder, worden de actine kabels verkleind en blebs zijn begonnen te vormen op het oppervlak.
De blebs vormen grote drie-dimensionale structuren - de totale hoogte schaal voor de AFM afbeeldingen in zowel C en F is 2,3 micrometer, terwijl de hoogte bereik voor de laatste afbeelding (I) is 9 micrometer. De AFM metingen laten een kwantitatieve meting van de verandering in de cel de hoogte als het rondt, en het oppervlak blebs kan worden geanalyseerd voor grootte, vorm, aantal of volume. Vergelijking met de fluorescentie afbeelding in H toont het actine cytoskelet grondslag liggen aan de blaar structuren.
Overzicht
Dit rapport heeft een aantal van de mogelijkheden van het combineren van verschillende optische beeldvorming technieken met AFM voor het bestuderen van celmorfologie en reacties. De combinatie van technieken vergroot het bereik van de informatie die kan worden verzameld over cel-structuur en functie. Specifieke moleculen op het celoppervlak of in de onderliggende delen van de cel kan worden gelabeld en gescand om hun relatie te onderzoeken om de morfologie van het celoppervlak en bijzondere structuren. Deze onderzoeken kunnen worden gedaan onder fysiologische omstandigheden, of zelfs op levende cellen, en vormen nieuwe mogelijkheden om de relatie tussen fysieke structuren en cellulaire functie te analyseren.
Bron: JPK Instrumenten
Voor meer informatie over deze bron kunt u terecht op JPK Instruments