Imagem Lactente Combinada Óptica e do AFM das Pilhas Usando o Microscópio Atômico da Força de NanoWizard dos Instrumentos de JPK

Assuntos Cobertos

Introdução
Pilhas da Melanoma do Rato Etiquetadas com YFP
Fibroblasto
Fibroblasto Tratados
Sumário

Introdução

Combinar óptica e imagem lactente do AFM das pilhas abre muitas possibilidades para correlacionar a informação estrutural sobre a superfície da pilha com a rotulagem funcional de determinados componentes. Neste relatório, os exemplos são mostrados do AFM combinado com a microscopia óptica para o contraste da fase, DIC e a epi-fluorescência que usa um JPK NanoWizard® AFM montado em um Zeiss Axiovert 200 inverteu o microscópio óptico.

Como uma aplicação particular, as pilhas foram tratadas com a água oxigenada para induzir blebbing apoptotic. A combinação de imagem lactente óptica e do AFM permite a melhor interpretação das relações entre as mudanças na superfície da membrana como as vesículas formam, e a estrutura do cytoskeleton do actínio abaixo delas.

Pilhas da Melanoma do Rato Etiquetadas com YFP

No primeiro exemplo, uma linha celular secundária da melanoma do rato (B16) foi usada. Nesta linha celular, o actínio foi etiquetado com proteína amarelo-fluorescente (YFP). As pilhas eram um presente amável do Dr. Clemens Franz (Grupo Celular das Máquinas, Biotechnologisches Zentrum, a TURQUIA Dresden).

As pilhas nesta linha celular são particularmente móbil e não aderem bem porque crescem, assim que eram fixas antes da imagem lactente. As pilhas foram tratadas com o glutaraldehyde de 2% por somente 45 segundos, para minimizar a contribuição da fluorescência do glutaraldehyde, e as pilhas foram fixadas então por 20 minutos no paraformaldehyde de 4%.

As imagens Ópticas de uma pilha B16 são mostradas em Figura 1. O painel superior é uma imagem do contraste da fase obtida usando um objetivo de imersão da água 20x. O painel mais baixo mostra a fluorescência de YFP de uma região perto da borda da pilha e foi obtido usando uma lente da imersão do petróleo 63x (NA 1,2). O YFP etiqueta os monómeros do actínio, tão há alguma contribuição para o sinal fluorescente do citoplasma assim como dos filamentos do actínio.

Figura 1. imagens Ópticas de uma pilha da melanoma do rato. Imagem Superior - põe em fase o contraste, lente da imersão da água 20x. Abaixe a imagem - fluorescência do actínio YFP-etiquetado, lente da imersão do petróleo 63x. A região coberta pela imagem da fluorescência é identificada por meio de uma caixa na imagem superior.

A imagem lactente do AFM das pilhas foi realizada na solução do PBS de Dulbecco. Para a imagem lactente do AFM, o modo de contacto intermitente foi usado, com os modilhões triangulares do nitreto de silicone que tiveram uma constante da mola de ao redor 0,3 N/m. No modo de contacto intermitente, o sensor do AFM oscila sobre a superfície da amostra, e a amplitude da oscilação é usada para controlar o varredor. Este modo dá ambas as imagens da topografia da superfície da pilha e as imagens da amplitude sinalizam, que destacam os detalhes mais finos da superfície da pilha.

Figura 2 mostra uma comparação de imagens ópticas e do AFM da borda da pilha da melanoma do rato B16. O painel superior é uma imagem da fluorescência de YFP, como em Figura 1, e o painel mais baixo é uma montagem de duas imagens do sinal da amplitude do AFM. O sinal da amplitude do AFM está relacionado ao inclinação da topografia enquanto a ponta faz a varredura sobre a superfície. Isto significa que as imagens parecem sombreadas, como se a topografia é iluminada do lado, e os detalhes menores da superfície são considerados particularmente claramente. A área da amostra é como marcada em Figura 1, mas a imagem da fluorescência foi girada para uma comparação mais fácil com as imagens do AFM. A barra da escala é o µm 2 em ambos os painéis.

A Figura 2. pilha JPK de utilização imaged NanoWizard® da melanoma do rato B16 montado em Zeis Axiovert 200 inverteu o microscópio óptico. Painel Superior - fluorescência de YFP. Abaixe o painel - montagem de duas imagens do sinal da amplitude do AFM da mesma região. Setas - exemplos dos filamentos do actínio vistos em ambos os painéis. Anel - exemplo de características arredondadas na superfície da pilha, visto somente nas imagens do AFM. Μm da barra 2 da Escala em ambos os painéis.

Desde Que o YFP etiqueta todo o actínio (monómeros e filamentos), o citoplasma é etiquetado fraca na imagem da fluorescência, assim como nos filamentos do actínio. Os filamentos maiores do actínio podem ser vistos no AFM e nas imagens ópticas da fluorescência (dois exemplos são marcados em Figura 2 com setas). As imagens do AFM mostram outros detalhes da superfície da pilha, contudo, que não aparecem na imagem da fluorescência, tal como o grupo de características arredondadas identificadas por meio de um anel branco em Figura 2. O lado de mão esquerda das mostras do painel do AFM particularmente surge a estrutura que é bastante diferente do teste padrão do cytoskeleton subjacente do actínio.

Fibroblasto

Os fibroblasto cutâneos do Rato foram crescidos nas lamelas de vidro. As pilhas foram fixadas com glutaraldehyde de 2% por 45 segundos e então paraformaldehyde de 4% por 20 minutos, quanto para às pilhas da melanoma do rato. Os filamentos do actínio foram etiquetados fluorescente incubando as pilhas durante a noite em 4°C com phalloidin-FITC, conforme instruções dos fabricantes. As pilhas eram imaged na solução do PBS de Dulbecco. As imagens da Fluorescência foram recolhidas como descrito acima, usando um grupo da lente da imersão do petróleo 63x e do filtro de FITC.

Figura 3 mostra uma imagem óptica de um fibroblasto isolado. A imagem mostra a fluorescência dos filamentos etiquetados do actínio. O actínio é etiquetado mais fortemente do que para o YFP em Figura 1, e o cytoskeleton do fibroblasto mais desenvolvido do que para a pilha da melanoma, assim que os cabos do actínio estão para fora claramente na imagem da fluorescência.

Figura 3. imagem Óptica de uma pilha cutânea do fibroblasto do rato. A Fluorescência de FITC-phalloidin etiquetou o actínio. A área identificada por meio da caixa branca é mostrada em Figura 4.

As imagens em Figura 4 todos mostram a região da borda da pilha que é identificada por meio de uma caixa em Figura 3. A imagem óptica da fluorescência (a) foi girada para facilitar a comparação com as imagens do AFM (B, montagem de dois imagens do sinal da amplitude e C, montagem de duas imagens da topografia) da mesma área.

Figura 4. Comparação de imagens ópticas e do AFM de um fibroblasto usando JPK NanoWizard®. A: actínio fluorescente etiquetado (phalloidin-FITC). B: montagem de duas imagens do sinal da amplitude do AFM. C: montagem de duas imagens da topografia do AFM. Escale o µm em tudo, escala da barra 2 da altura da imagem do AFM é o µm 1,8.

As saliências finas no limite de pilha (identificado por meio de setas brancas) são fraca visíveis na imagem da fluorescência (a), mas podem claramente ser resolvidas nas imagens do AFM (B, C). Outras características isoladas na superfície da pilha são somente visíveis nas imagens do AFM (por exemplo, a grande característica identificada por meio de uma seta preta).

O AFM e as imagens ópticas aqui dão a informação complementar sobre ambos a superfície da pilha e das estruturas submembranous. As imagens do AFM dão a informação 3-D real sobre a forma da pilha (do sinal da topografia) e uma impressão das estruturas finas na superfície da pilha (do sinal da amplitude). A combinação de informação óptica e estrutural permite a identificação das estruturas particulares subjacentes da membrana de pilha dos componentes celulares.

Fibroblasto Tratados

Para demonstrar um pedido para a informação diferente que está disponível desta combinação de técnicas da microscopia, um breve estudo dos efeitos apoptotic da água oxigenada (HO22) nas pilhas do fibroblasto é apresentado aqui.

Os fibroblasto cutâneos do rato foram tratados com as baixas concentrações de água oxigenada para iniciar uma cascata da morte celular. As pilhas tratadas foram incubadas com a água oxigenada de 100 µM para 30 minutos ou uma hora, antes de ser fixas e do actínio filamentous etiquetado fluorescente como descrito acima para a imagem lactente padrão.

Uma vista geral dos resultados é dada em Figura 5 para pilhas do controle (nenhum tratamento, CORRENTE ALTERNADA da série da imagem) e pilhas tratadas com a água oxigenada para 15 minutos (série D-F da imagem) ou 30 minutos (SOLDADO). As imagens ao longo de cada fileira mostram técnicas de imagem lactente diferentes para a mesma amostra da pilha. O contraste da fase (A, D, G) e epi-flurorescence (B, E, H) imagens mostra a mesma área da amostra. A região para as imagens da topografia do AFM (C, F, I) é marcado nas imagens ópticas com uma caixa. A área da varredura para as imagens do AFM era 20 o µm do µm x 20 em cada caso.

A Figura 5. Combinação de imagens ópticas e do AFM dos fibroblasto tratou com a água oxigenada. A CORRENTE ALTERNADA da série da Imagem mostra pilhas do ntrol (nenhum HO22 tratamento), D-F mostra as pilhas que foram tratadas com o µM 100 HO22 por 30 minutos antes da fixação, e - I mostra as pilhas que foram tratadas para uma hora antes da fixação. Imagens do contraste da Fase (A, D, G) e epi-fluorescência dos filamentos etiquetados TC-phalloidin do actínio (B, E, H) mostra o mesmos faz a varredura da área para cada caso. Imagens da topografia do AFM (C, F, I) é 20 m x 20 varreduras do µm em cada caso, porque a região identificada por meio de uma caixa nas imagens ópticas precedentes. A escala total da altura para C d F é o µm 2,3 em ambos os casos, e a escala total da altura dentro Eu sou o µm 9. A imagem lactente do AFM foi realizada no modo de contacto usando modilhões apontados de DNP com constante 0,06 N/m. da mola.

Os cabos Proeminentes do actínio podem ser vistos em todas as três imagens (C.A.) para as pilhas não tratadas do controle. Além, as vesículas podem ser vistas na imagem do contraste da fase, que correlacionam com as saliências na superfície da pilha nas imagens da topografia do AFM (por exemplo, essa circundada em C).

Após o tratamento por 30 minutos com o µM 100 HO22, os filamentos do actínio começaram retrair das bordas das pilhas. A imagem da fluorescência em E mostra a mancha fraca na periferia da pilha, mas os detalhes podem mais claramente ser considerados na imagem correspondente do AFM (f). Uma região de membrana relativamente lisa é deixada na periferia (identificada por meio de uma seta em F) que tenha uma multa - engrene a estrutura que apoia a, mas as fibras proeminentes do actínio já não estendem à borda da pilha.

As pilhas tratadas com HO22 para uma mostra da hora uma mudança dramática na morfologia da pilha, e um rearranjo completo do cytoskeleton do actínio. As pilhas retraíram e tornam-se mais redondas, os cabos do actínio são reduzidos e os blebs começaram formar na superfície.

Estruturas tridimensionais do formulário dos blebs as grandes - a escala total da altura para as imagens do AFM nos ambos C AND F é o µm 2,3, quando a escala da altura para a última imagem (i) for o µm 9. As medidas do AFM permitem uma medida quantitativa da mudança na altura da pilha enquanto se arredonda acima, e os blebs de superfície poderiam ser analisados para o tamanho, a forma, o número ou o volume. A Comparação com a imagem da fluorescência em H mostra o cytoskeleton do actínio que é a base das estruturas do bleb.

Sumário

Este relatório introduziu algumas das possibilidades de combinar técnicas de imagem lactente ópticas diferentes com o AFM para estudar a morfologia e as respostas da pilha. Combinar técnicas alarga o conjunto de informações que pode ser recolhido sobre a estrutura e a função de pilha. As moléculas Específicas na superfície da pilha ou nas partes subjacentes da pilha podem ser etiquetadas e imaged para explorar seu relacionamento à morfologia das estruturas de superfície e particulares da pilha. Estas investigações podem ser feitas sob circunstâncias fisiológicos, ou mesmo em pilhas vivas, e nas oportunidades novas actuais analisar o relacionamento entre estruturas físicas e a função celular.

Source: Instrumentos de JPK

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Instrumentos de JPK

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:20

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