:: AZoNanotechnology artigo
.jpg)
Temas Abordados
Introdução
Rato células de melanoma Rotulados com YFP
Fibroblastos
Os fibroblastos tratados
Sumário
Introdução
Combinando ópticas e AFM imagens de células abre muitas possibilidades para correlacionar informações estruturais sobre a superfície da célula com rotulagem funcional de determinados componentes. Neste relatório, os exemplos são mostrados de AFM combinado com microscopia óptica de contraste de fase, DIC e epi-fluorescência utilizando um JPK NanoWizard ® AFM montado em um Axiovert 200 microscópio invertido Zeiss ópticas.
Como uma aplicação particular, as células foram tratadas com peróxido de hidrogênio para induzir a apoptose blebbing. A combinação de sensores ópticos e de imagem AFM permite uma melhor interpretação das ligações entre as mudanças na superfície da membrana como forma vesículas, ea estrutura do citoesqueleto de actina abaixo deles.
Rato células de melanoma Rotulados com YFP
No primeiro exemplo, um mouse melanoma linhagem de células secundárias (B16) foi usado. Nesta linha de células, a actina foi marcado com amarelo-fluorescente proteína (YFP). As células foram um presente amável do Dr. Clemens Franz (Cellular Grupo Machines, Biotechnologisches Zentrum, TU Dresden).
As células desta linhagem celular são particularmente móveis e não adere bem à medida que crescem, então eles foram corrigidos antes de imagem. As células foram tratadas com glutaraldeído a 2% para apenas 45 segundos, para minimizar a contribuição de fluorescência do glutaraldeído, e as células foram então fixadas por 20 minutos em paraformaldeído 4%.
Imagens ópticas de uma célula B16 são mostrados na Figura 1. O painel superior é uma imagem de contraste de fase obtidas por meio de 20x objetivo imersão em água. O painel inferior mostra a fluorescência YFP de uma região perto da borda da célula e foi obtida usando uma lente de imersão 63x de petróleo (NA 1.2). Os rótulos YFP os monômeros de actina, para que haja alguma contribuição para o sinal fluorescente do citoplasma, bem como de filamentos de actina.
.jpg)
Figura 1. Imagens ópticas de uma célula de melanoma mouse. Imagem superior - contraste de fase, 20x imersão em água. De imagem mais baixa - de fluorescência de YFP marcado actina, lente de imersão 63x de petróleo. A região coberta pela imagem de fluorescência é marcado com uma caixa na imagem superior.
AFM das células foi realizada em solução Dulbecco PBS. Por AFM, modo de contato intermitente foi usado, com vigas de silício triangular nitreto de que havia uma fonte constante de cerca de 0,3 N / m. No modo de contato intermitente, o sensor AFM oscila sobre a superfície da amostra, ea amplitude da oscilação é usado para controlar o scanner. Este modo proporciona imagens tanto da topografia da superfície celular e as imagens a partir do sinal de amplitude, que destacam os detalhes mais finos da superfície da célula.
A Figura 2 mostra uma comparação de imagens ópticas e AFM da célula B16 ponta do mouse melanoma. O painel superior é uma imagem YFP de fluorescência, como na Figura 1, eo painel inferior é uma montagem de duas imagens AFM sinal de amplitude. O AFM sinal de amplitude está relacionada com o gradiente da topografia como a ponta varreduras sobre a superfície. Isto significa que as imagens aparecem sombreados, como se a topografia é acesa do lado, e os pequenos detalhes da superfície são vistos de forma particularmente clara. A área da amostra é tão marcada na Figura 1, mas a imagem de fluorescência foi girado para facilitar a comparação com as imagens AFM. A barra de escala é 2 m em ambos os painéis.
.jpg)
Figura 2. B16 de células de melanoma rato fotografada usando JPK NanoWizard ® montado em Zeis Axiovert 200 microscópio invertido óptica. Painel superior - YFP fluorescência. Painel inferior - montagem de duas imagens AFM sinal de amplitude da mesma região. Setas - exemplos de filamentos de actina visto em ambos os painéis. Anel - Exemplo de características arredondadas na superfície da célula, visto apenas nas imagens AFM. Barra de escala 2 m em ambos os painéis.