Совмещенное Воображение Оптически и AFM Клеток Используя Микроскоп Усилия NanoWizard Атомный от Аппаратур JPK

Покрытые Темы

Введение
Клетки Меланомы Мыши Обозначенные с YFP
Фиброциты
Обработанные Фиброциты
Сводка

Введение

Совмещать оптически и воображение AFM клеток раскрывает вверх по много возможностей для сопоставлять структурную информацию о поверхности клетки с функциональный обозначать некоторых компонентов. В этом рапорте, примеры показаны AFM совмещенного с оптически микроскопией для контраста участка, DIC и epi-флуоресцирование используя JPK NanoWizard® AFM установленное на Zeiss Axiovert 200 перевернуло оптически микроскоп.

Как определенное применение, клетки были обработаны с перекисью водопода для того чтобы навести apoptotic blebbing. Сочетание из оптически и воображение AFM позволяет более лучшему толкованию соединений между изменениями в поверхности мембраны по мере того как vesicles формируют, и структурой цитоскелета актина под ими.

Клетки Меланомы Мыши Обозначенные с YFP

В первом примере, была использована линия вторичной клетки меланомы мыши (B16). В этой линии клетки, актин был обозначен с желт-дневным протеином (YFP). Клетки был добросердечным подарком от Др. Clemens Frantz (Клетчатой Группы Машин, Biotechnologisches Zentrum, TU Дрездена).

Клетки в этой линии клетки в частности передвижны и не придерживаются хорошо по мере того как они растут, поэтому они были фикчированы перед воображением. Клетки были обработаны с глютаральдегидом 2% на только 45 секунд, для того чтобы уменьшить вклад флуоресцирования от глютаральдегида, и клетки после этого были зафиксированы на 20 минут в параформальдегиде 4%.

Оптически изображения клетки B16 показаны в Диаграмме 1. Верхняя панель изображение контраста участка полученное используя задачу погружения воды 20x. Более низкая панель показывает флуоресцирование YFP зоны около края клетки и была получена используя объектив погружения масла 63x (NA 1.2). YFP обозначает мономеры актина, настолько некоторый вклад к дневному сигналу от цитоплазмы так же, как от нитей актина.

Диаграмма 1. Оптически изображения клетки меланомы мыши. Верхнее изображение - фазируйте контраст, объектив погружения воды 20x. Понизьте изображение - флуоресцирование от YFP-обозначенного актина, объектива погружения масла 63x. Зона предусматриванная изображением флуоресцирования маркирована с коробкой в верхнем изображении.

Воображение AFM клеток было унесено в разрешении PBS Dulbecco. Для воображения AFM, прерывистый режим контакта был использован, с триангулярными cantilevers нитрида кремния которые имели константу весны вокруг 0,3 N/m. В прерывистом режиме контакта, датчик AFM осциллирует над поверхностью образца, и амплитуда колебания использована для того чтобы контролировать блок развертки. Этот режим дает и изображения топографии поверхности клетки и изображения от сигнала амплитуды, которые выделяют более точные детали поверхности клетки.

На Диаграмму 2 показано сравнение изображений оптически и AFM края клетки меланомы мыши B16. Верхняя панель изображение флуоресцирования YFP, как в Диаграмме 1, и более низкая панель монтаж 2 изображений сигнала амплитуды AFM. Сигнал амплитуды AFM отнесен к градиенту топографии по мере того как подсказка просматривает над поверхностью. Это значит что изображения кажутся затеняемыми, если топография освещена от стороны, а более малые детали поверхности увидены в частности ясно. Зона образца как маркировано в Диаграмме 1, но изображение флуоресцирования было вращано для более легкого сравнения с изображениями AFM. Адвокатское сословие маштаба µm 2 в обеих панелях.

Диаграмма 2. клетка меланомы мыши B16 imaged используя JPK NanoWizard® установленное на Zeis Axiovert 200 перевернула оптически микроскоп. Верхняя панель - флуоресцирование YFP. Понизьте панель - монтаж 2 изображений сигнала амплитуды AFM такой же зоны. Наконечникы - примеры нитей актина увиденных в обеих панелях. Кольцо - пример округленных характеристик на поверхности клетки, увиденный только в изображениях AFM. Μm адвокатского сословия 2 Маштаба в обеих панелях.

В Виду Того Что YFP обозначает весь актин (мономеры и нити), цитоплазма слабо обозначена в изображении флуоресцирования, так же, как нитях актина. Более большие нити актина можно увидеть как в AFM, так и в оптически изображениях флуоресцирования (2 примера маркированы в Диаграмме 2 с наконечниками). Изображения AFM показывают другие детали поверхности клетки, однако, которые не появляются в изображение флуоресцирования, как группа в составе округленные характеристики маркированные с белым кольцом в Диаграмме 2. Сторона левой руки панели AFM в частности показывает поверхностную структуру которая отличал довольно картина основного цитоскелета актина.

Фиброциты

Росли фиброциты Мыши дермальные на стеклянных coverslips. Клетки были зафиксированы с глютаральдегидом 2% на 45 секунд и после этого параформальдегидом 4% на 20 минут, как для клеток меланомы мыши. Нити актина дневно были обозначены путем инкубировать клетки всю ночь на 4°C с phalloidin-FITC, согласно инструкциям изготовлений. Клетки были imaged в разрешении PBS Dulbecco. Изображения Флуоресцирования были собраны как описано выше, используя комплект объектива погружения масла 63x и фильтра FITC.

На Диаграмму 3 показано оптически изображение изолированного фиброцита. Изображение показывает флуоресцирование от обозначенных нитей актина. Актин более сильно обозначен чем для YFP в Диаграмме 1, и цитоскелета фиброцита более начинать чем для клетки меланомы, поэтому кабели актина стоят вне ясно в изображении флуоресцирования.

Диаграмма 3. Оптически изображение клетки фиброцита мыши дермальной. Флуоресцирование от FITC-phalloidin обозначило актин. Область маркированная с белой коробкой показана в Диаграмме 4.

Изображения в Диаграмме 4 все показывают зону края клетки который маркирован с коробкой в Диаграмме 3. Оптически изображение флуоресцирования (A) было вращано для того чтобы облегчить сравнение с изображениями AFM (B, монтажом 2 изображений сигнала амплитуды и C, монтажом 2 изображений топографии) такой же области.

Диаграмма 4. Сравнение изображений оптически и AFM фиброцита используя JPK NanoWizard®. A: дневно обозначенный актин (phalloidin-FITC). B: монтаж 2 изображений сигнала амплитуды AFM. C: монтаж 2 изображений топографии AFM. Вычислите По Маштабу µm в всех, ряд адвокатского сословия 2 высоты изображения AFM µm 1,8.

Точные выступания на границе клетки (маркированной с белыми наконечниками) faintly видимы в изображении флуоресцирования (A), но могут ясно быть разрешены в изображениях AFM (B, C). Другие изолированные характеристики на поверхности клетки только видимы в изображениях AFM (например, большой характеристике маркированной с черным наконечником).

AFM и оптически изображения здесь дают комплементарную информацию как о поверхности клетки, так и о submembranous структурах. Изображения AFM дают и реальную 3-D информацию о форме клетки (от сигнала топографии) и впечатление тонких структур на поверхности клетки (от сигнала амплитуды). Данные по сочетание из оптически и структурные позволяют идентификации структур мембраны клетки клетчатых компонентов основных определенных.

Обработанные Фиброциты

Для того чтобы продемонстрировать применение для различной информации которая доступна от методов этой микроскопии сочетание из, кратко изучение apoptotic влияний перекиси водопода (HO22) на клетках фиброцита здесь.

Обработали с низкой концентрацией перекиси водопода для того чтобы начать фиброциты мыши дермальные каскад смерти клетки. Обработанные клетки были инкубированы с перекисью водопода 100 µM на или 30 минут или один час, перед быть фикчированы и filamentous актином дневно обозначенным как описано выше для стандартного воображения.

Обзор результатов уступан Диаграмма 5 для клеток управления (отсутствие обработки, A.C. серии изображения) и клеток обработанных с перекисью водопода на 15 минут (серия D-F изображения) или 30 минут (G-I). Изображения вдоль каждого рядка показывают различные методы воображения для такого же образца клетки. Контраст участка (A, D, G) и изображения epi-flurorescence (B, E, H) показывают такую же зону образца. Зона для изображений топографии AFM (C, F, I) маркирована в оптически изображениях с коробкой. Зона развертки для изображений AFM было 20 µm µm x 20 в каждом случае.

Диаграмма 5. Сочетание из оптически и изображения AFM фиброцитов обработала с перекисью водопода. A.C. серии Изображения показывает клетки ntrol (отсутствие HO22 обработки), D-F показывает клетки которые обработаны с µM 100 HO22 на 30 минут перед фиксированием, и - I показывает клетки которые обработаны на один час перед фиксированием. Фазируйте изображения контраста (A, D, G) и epi-флуоресцирование от обозначенной TC-phalloidin выставки нитей актина (B, E, H) эти же зона развертки в каждый случай. Изображения топографии AFM (C, F, I) 20 m x 20 разверток µm в каждом случае, ибо зона маркированная с коробкой в предшествующих оптически изображениях. Полный масштаб высоты для C d F µm 2,3 в оба случая, и полный масштаб высоты внутри I µm 9. Воображение AFM было унесено в режиме контакта используя заточенные cantilevers DNP с константой 0,06 N/m. весны.

Видно кабели актина можно увидеть в всех 3 изображениях (AC) для необработанных клеток управления. В добавлении, vesicles можно увидеть в изображении контраста участка, которые сопоставляют с выступаниями на поверхности в изображениях топографии AFM (например, одном клетки объезжанном в C).

После обработки на 30 минут с µM 100 HO22, нити актина начинали вытянуть от краев клеток. Изображение флуоресцирования в E показывает слабый пятнать на периферии клетки, но детали можно ясно увидеть в соответствуя изображении AFM (F). Зона относительно плоской мембраны выйдена на периферию (маркированную с стрелкой в F) которая имеет мелкосеточную структуру поддержать ее, но видно волокна актина больше не не удлиняют к краю клетки.

Клетки обработанные с HO22 для одной выставки часа огромное изменение в словотолковании клетки, и полное перераспределение цитоскелета актина. Клетки втягивали и будут кругле, кабели актина уменьшены и blebs начинали сформировать на поверхности.

Структуры формы blebs большие трехмерные - полный масштаб высоты для изображений AFM в обоих C AND F µm 2,3, пока ряд высоты для последнего изображения (I) µm 9. Измерения AFM позволяют количественному измерению изменения в высоте клетки по мере того как она округляет вверх, и поверхностные blebs смогли быть проанализированы для размера, формируют, номер или том. Сравнение с изображением флуоресцирования в H показывает цитоскелет актина кладя структуры в основу bleb.

Сводка

Этот рапорт ввел некоторые из возможностей совмещать различные оптически методы воображения с AFM для изучать словотолкование и реакции клетки. Совмещать методы расширяет ряд информации который можно собрать о структуре и функции клетки. Специфические молекулы на поверхности клетки или в основных частях клетки могут быть обозначены и imaged исследовать их отношение к словотолкованию поверхности клетки и определенных структур. Эти исследования можно сделать под физиологопсихологическими условиями, или даже на живущих клетках, и присутствующих новых возможностях проанализировать отношение между физическими структурами и клетчатой функцией.

Источник: Аппаратуры JPK

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Аппаратуры JPK

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:23

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit