Комбинированный оптический и АСМ изображений ячеек с помощью NanoWizard атомно-силовой микроскоп из инструментов JPK

:: AZoNanotechnology статьи

Рассматриваемые вопросы

Введение
Мышь клеток меланомы Маркируется YFP
Фибробласты
Обработанные Фибробласты
Резюме

Введение

Сочетание оптических и АСМ изображения клеток открывает много возможностей для корреляции структурную информацию о клеточной поверхности с функциональными маркировке определенных компонентов. В этом докладе примеры приведены АСМ в сочетании с оптической микроскопии для фазового контраста, DIC и эпи-флуоресценции с помощью JPK NanoWizard ® AFM установлен на Zeiss Axiovert 200 перевернутый оптический микроскоп.

В качестве конкретного приложения, клетки обрабатывали перекисью водорода, чтобы побудить апоптоза blebbing. Комбинации оптических и АСМ-изображения позволяет лучше интерпретация связи между изменениями в поверхности мембраны как форма пузырьков, и структура актина цитоскелета под ними.

Мышь клеток меланомы Маркируется YFP

В первом примере меланомы мыши вторичной клеточной линии (В16) была использована. В этой клеточной линии, актин был помечен желтым флуоресцентным белком (YFP). Клетки рода подарок от д-р Клеменс Франц (сотовых машины группы, Biotechnologisches Zentrum, ТУ Дрезден).

Клеток в этой клеточной линии, особенно подвижны и не придерживаются так, как они растут, так что они были исправлены прежде, чем изображения. Клетки обрабатывали 2% глутаральдегида только 45 секунд, чтобы свести к минимуму флуоресценции вклад глутаральдегида, и клетки были затем фиксировали в течение 20 минут в 4% параформальдегида.

Оптические изображения B16 ячейки показана на рисунке 1. Верхняя панель изображение фазового контраста получены с помощью 20-кратного погружения в воду цели. Нижняя панель показывает YFP флуоресценции области вблизи края ячейки и было получено при использовании 63x объектив иммерсионного масла (NA 1.2). YFP этикетки актиновых мономеров, так что определенный вклад в флуоресцентного сигнала от цитоплазмы, а также из актиновых филаментов.

Рисунок 1. Оптические изображения клеток меланомы мыши. Верхнее изображение - фазового контраста, погружения в воду 20-кратный объектив. Нижнее изображение - флуоресценции от YFP меченных актин, 63x объектив погружения нефти. Регионе, охваченном флуоресценции изображение помечается окно в верхнем изображении.

АСМ изображения клеток проводили в PBS решение Дульбеко. Для АСМ изображений, прерывистый режим контакт был использован, с треугольными консолями нитрида кремния, которые пружины около 0,3 Н / м. В режиме прерывистого контакта, датчика АСМ колеблется по поверхности образца, а амплитуда колебаний используется для управления сканером. Этот режим дает как топография изображений поверхности клетки и изображения с амплитудой сигнала, которые освещают тонкости поверхности клетки.

На рисунке 2 показано сравнение оптических и АСМ изображения B16 мыши края ячейки меланомы. Верхняя панель YFP флуоресценции изображение, как показано на рисунке 1, а нижняя панель монтаж двух изображений АСМ амплитуды сигнала. Сигнал АСМ амплитуды, связанные с градиентом рельефа, как кончик сканирует по поверхности. Это означает, что изображения появляются тени, как будто топографии горит со стороны, и мелкие детали поверхности видны особенно четко. Образец область как отмечено на рисунке 1, но флуоресценции изображение было поворачивать для удобства сравнения с АСМ-изображений. Шкалы составляет 2 мкм в обеих панелях.

Рисунок 2. B16 мыши клеток меланомы отображаемого использованием JPK NanoWizard ® монтируется на Zeis Axiovert 200 перевернутый оптический микроскоп. Верхняя панель - YFP флуоресценции. Нижняя панель - монтаж двух АСМ амплитуды сигнала изображения одного и того же региона. Стрелки - примеры актиновых нитей видели в обеих панелях. Кольцо - например округлых деталей на поверхности клетки, только в городе АСМ-изображений. Шкала бар 2 мкм в обеих панелях.