Kombinerad optisk och AFM avbildning av celler med NanoWizard Atomic Force Microscope från JPK Instruments

:: AZoNanotechnology Artikel

Ämnen som tas upp

Inledning
Mus melanomceller Märkta med YFP
Fibroblaster
Behandlade fibroblasts
Sammanfattning

Inledning

Kombinera optiska och AFM avbildning av celler öppnar många möjligheter för korrelera strukturell information om cellytan med funktionella märkning av vissa komponenter. I denna rapport är exempel visas av AFM i kombination med optisk mikroskopi för faskontrast, DIC och EPI-fluorescens med hjälp av en JPK NanoWizard ® AFM monterad på ett Zeiss Axiovert 200 inverterat ljusmikroskop.

Som ett visst program, var celler som behandlats med väteperoxid för att framkalla apoptotiska blebbing. Kombinationen av optisk och AFM bildbehandling ger bättre tolkning av sambanden mellan förändringar i membranets yta som blåsor form och struktur aktin cytoskelettet under dem.

Mus melanomceller Märkta med YFP

I det första exemplet var en mus melanom sekundär cellinje (B16) som används. I denna cellinje var aktin märkta med gul-fluorescerande protein (YFP). Cellerna var en slags gåva från Dr Clemens Franz (Cellular Machines Group, Biotechnologisches Zentrum, TU Dresden).

Cellerna i denna cellinje är särskilt rörliga och inte hålla sig väl när de växer, så de fastställts före avbildning. Cellerna behandlades med 2% glutaraldehyd för endast 45 sekunder, för att minimera fluorescens bidrag från glutaraldehyd, och cellerna har sedan fastställts för 20 minuter i 4% paraformaldehyd.

Optisk bilder av en B16 cell visas i figur 1. Den övre panelen är en fas kontrast bild erhålls med 20x objektiv nedsänkning i vatten. Den nedre panelen visar YFP fluorescens i en region i närheten av cellen kanten och erhölls genom att använda en 63x lins oljeimmersion (NA 1,2). Den YFP etiketter aktin monomerer, så det finns några bidrag till den fluorescerande signalen från cytoplasman samt från aktin filament.

Figur 1. Optisk bilder av en mus melanom cell. Övre bild - faskontrast, 20x nedsänkning i vatten lins. Nedre bild - fluorescens från YFP-märkt aktin, 63x oljeimmersion lins. Den region som omfattas av fluorescens bilden är markerad med en ruta i övre bilden.

AFM avbildning av celler utfördes i Dulbecco är PBS-lösning. För AFM bildbehandling, var intermittent kontakt läge som används, med triangulära utliggare kiselnitrid som hade en fjäderkonstant på ca 0,3 N / m. I intermittent kontakt läge oscillerar AFM sensorn över ytan av provet, och amplitud svängning används för att styra skannern. Detta läge ger både topografi bilder på cellytan och bilder från amplituden signalen, som belyser de finare detaljerna i cellytan.

Figur 2 visar en jämförelse av optiska och AFM bilder av B16 musen melanom cellkanten. Den övre panelen är en YFP fluorescens bild, som i figur 1 och den undre panelen är ett montage av två AFM amplitud signal bilder. AFM amplitud-signalen är relaterat till lutning topografi som spetsen skannar över ytan. Detta innebär att bilderna visas skuggade, som om topografin är tänd från sidan, och mindre detaljer på ytan syns särskilt tydligt. Provet området är markerat i figur 1, men fluorescens bilden har roterats för lättare jämförelse med AFM-bilder. Skalningsfält är 2 nm i båda panelerna.

Figur 2. B16 mus melanom cellen avbildas med JPK NanoWizard ® monterad på Zeis Axiovert 200 inverterat ljusmikroskop. Övre panel - YFP fluorescens. Nedre panelen - montage av två AFM amplitud signal bilder i samma region. Pilspetsar - exempel på aktin filament ses i båda panelerna. Ring - exempel på rundade funktioner på cellytan, bara sett i AFM bilderna. Skala bar 2 nm i båda panelerna.

Figur 5. Kombination av optisk och AFM bilder av fibroblaster som behandlats med väteperoxid. Bildserie AC visar ntrol celler (ingen H ₂ O ₂ behandling), visar DF celler som har behandlats med 100 mikroM H ₂ O ₂ i 30 minuter innan fixeringen, och jag visar celler som har behandlats för en timme före fixering. Faskontrast bilder (A, D, G) och epi-fluorescens från TC-phalloidin märkt aktin filament (B, E, H) visar samma skanningsområdet för varje fall. AFM topografi bilder (C, F, I) är 20 mx 20 m skannar i varje enskilt fall, för regionen markerad med en ruta i föregående optiska bilder. Den totala höjden skala för C d F är 2,3 mikrometer i båda fallen, och den totala höjden skala Jag är 9 ìm. AFM bildhantering genomfördes i kontakt läge med vässade DNP utliggare med fjäderkonstanten 0,06 N / m.

Framstående aktin kablar kan ses i alla tre bilder (AC) för den obehandlade kontrollgruppen celler. Dessutom kan blåsor ses i faskontrast bilden, som korrelerar med utskjutande delar på cellytan i AFM topografi bilder (till exempel cirklade den i C).

Efter behandling i 30 minuter med 100 mikroM H ₂ O ₂ har aktin filament började dra från kanterna av cellerna. Fluorescensen bilden i E visar svaga färgning i utkanten av cellen, men detaljerna kan vara mer tydligt i motsvarande AFM bild (F). En region med relativt platt membran som finns kvar i periferin (markerad med en pil i F) som har ett finmaskigt struktur som stöder det, men den framstående aktin fibrer inte längre utsträckas till kanten av cellen.

De celler som behandlats med H ₂ O ₂ i en timme visar en dramatisk förändring i cellmorfologin, och en fullständig ombildning av aktin cytoskelettet. Cellerna har indragen och blivit rundare, är aktin kablar minskas och blebs har börjat form på ytan.

Den blebs bildar stora tredimensionella strukturer - den totala höjden skala för AFM bilder i både C och F är 2,3 ìm, medan höjden intervallet för den sista bilden (I) 9 ìm. AFM mätningar möjliggör ett kvantitativt mått på förändringen i cellens höjd som det rundor upp och ytan blebs kunde analyseras för storlek, form, antal eller volym. Jämförelse med fluorescens bilden i H visar aktin cytoskelettet bakom Bleb strukturer.

Sammanfattning

Denna rapport har infört några av möjligheterna att kombinera olika optiska metoder för avbildning med AFM för att studera cellmorfologin och svar. Kombinera tekniker breddar utbudet av information som kan samlas om cellens struktur och funktion. Specifika molekyler på cellens yta eller i den underliggande delar av cellen kan märkas och avbildat för att utforska deras förhållande till morfologi av cellytan och särskilda strukturer. Dessa undersökningar kan göras under fysiologiska förhållanden, eller ens på levande celler, och presentera nya möjligheter att analysera förhållandet mellan fysiska strukturer och cellulär funktion.

Källa: JPK instrument

För mer information om den här källan besök JPK Instruments