Kombinerat Optisk och för AFM Avbilda av Celler som Använder NanoWizard det Atom- StyrkaMikroskopet från JPK, Instrumenterar

Täckte Ämnen

Inledning
MusMelanomCeller som Märks med YFP
Fibroblasts
Behandlade Fibroblasts
Summariskt

Inledning

Kombination som är optisk och att avbilda för AFM av öppet övre för celler många möjligheter för att korrelera strukturell information om cellen, ytbehandlar med funktionellt märka av bestämda delar. I denna rapport visas exempel av AFM som kombineras med optisk microscopy för, arrangerar gradvis kontrast, DIC, och epi-fluorescence som använder en JPK NanoWizard® AFM som monterades på en Zeiss Axiovert 200, inverterade det optiska mikroskopet.

Som en särskild applikation behandlades celler med väteperoxiden för att framkalla apoptotic blebbing. Kombinationen av optisk och för AFM avbilda låter bättre tolkning av anknyter mellan ändringarna i membranet ytbehandlar, som vesicles bildar, och strukturera av actincytoskeletonen under dem.

MusMelanomCeller som Märks med YFP

I det första exemplet en musmelanom som den sekundära cellen fodrar (B16) användes. I denna cell fodra, actinen märktes med guling-fluorescerande protein (YFP). Cellerna var en snäll gåva från Dr Clemens Cell- Franz (Bearbetar med maskin Gruppen, Biotechnologisches Zentrum, TU Dresden).

Cellerna i denna cell fodrar är bestämt mobila och klibbar inte väl, som de växer, så de fixades, innan du avbildade. Cellerna behandlades med 2% glutaraldehyde för endast 45 understöder, för att minimera fluorescencebidraget från glutaraldehyden, och cellerna fixades därefter för 20 noterar i 4% paraformaldehyde.

Optiskt avbildar av en cell B16 visas in Figurerar 1. Övrepanelen är en arrangera gradviskontrast avbildar erhållande genom att använda en 20x bevattnar immersionmål. Den lägre panelen visar att YFP-fluorescencen av en region nära cellen kantar och erhölls genom att använda en immersionlins för olja 63x (NA 1,2). YFPEN märker actinmonomersna, så finns det något bidrag till det fluorescerande signalerar från cytoplasmen såväl som från actinglödtrådar.

Figurera 1. Optiskt avbildar av en musmelanomcell. Upperen avbildar - arrangera gradvis kontrast, 20x bevattnar immersionlinsen. Lägre avbilda - fluorescence från YFP-märkt actin, olje- lins för immersion 63x. Regionen som täckas av fluorescencen, avbildar markeras med en boxas i upperen avbildar.

Att avbilda för AFM av cellerna bars ut i Dulbeccos PBS-lösning. För AFM som avbildar, användes det intermittent kontaktfunktionsläget, med triangulära silikonnitridecantilevers som hade en fjädrakonstant av omkring 0,3 N/m. I intermittent kontaktfunktionsläge svänger AFM-avkännaren över ytbehandla av ta prov, och amplituden av svängningen är van vid kontrollerar bildläsaren. Detta funktionsläge ger både topografi avbildar av cellen ytbehandlar och avbildar från amplituden signalerar, som markerar det mer fin specificerar av cellen ytbehandlar.

Figurera 2 shows en jämförelse av optiskt, och AFM avbildar av melanomcellen för musen B16 kantar. Övrepanelen är en YFP-fluorescence avbildar, som Figurerar in 1, och den lägre panelen är en montage av två AFM-amplitud signalerar avbildar. AFM-amplituden signalerar förbinds till lutningen av topografin, som spetsen avläser över ytbehandla. Detta verkar hjälpmedlet, som avbildar, skuggat, som, om topografin tändas från sidan, och det mindre specificerar av ytbehandla ses bestämt klart. Ta provområdet är, som markerat in Figurera 1, men fluorescencen avbildar har roterats för lättare jämförelse med AFMEN avbildar. Fjäll bommar för är µm 2 i båda paneler.

Figurera 2. Den avbildade melanomcellen för musen B16 genom att använda JPK NanoWizard® som monterades på Zeis Axiovert 200, inverterade det optiska mikroskopet. Övrepanel - YFP-fluorescence. Lägre panel - montagen av två AFM-amplitud signalerar avbildar av den samma regionen. Arrowheads - exempel av actinglödtrådar som ses i båda paneler. Ringa - exemplet av rundade särdrag på cellen ytbehandlar, sett endast i AFMEN avbildar. Fjäll bommar för µm 2 i båda paneler.

Sedan YFPEN märker all actin (monomers och glödtrådar), märks cytoplasmen svagt i fluorescencen avbildar, såväl som actinglödtrådarna. De större actinglödtrådarna kan ses i både AFMEN, och den optiska fluorescencen avbildar (två exempel markeras in Figurerar 2 med arrowheads). AFMEN avbildar show som annan specificerar av cellen ytbehandlar, emellertid som inte visas i fluorescencen, avbilda, liksom gruppen av rundade särdrag som markeras med en vit, ringer Figurerar in 2. Lämnade räcker sidan av showsna för AFM-panelen bestämt ytbehandlar strukturerar som är ganska olik från mönstra av den bakomliggande actincytoskeletonen.

Fibroblasts

Var dermal fibroblasts för Mus fullvuxna på glass coverslips. Cellerna fixades med 2% glutaraldehyde för 45 understöder, och därefter noterar 4% paraformaldehyde för 20, som för musmelanomcellerna. Actinglödtrådarna märktes fluorescerande, genom att kläcka cellerna som var över natten på 4°C med phalloidin-FITC, som per producentanvisningar. Cellerna avbildades i Dulbeccos PBS-lösning. Fluorescence avbildar samlades enligt ovan, genom att använda en immersionlins för olja 63x, och FITC filtrerar uppsättningen.

Figurera 3 shows som ett optiskt avbildar av en isolerad fibroblast. Avbilda visar fluorescencen från de märkta actinglödtrådarna. Actinen märks starkare, än för YFPEN Figurera in 1 och cytoskeletonen av fibroblasten som framkallas än för melanomcellen, så actinkabelstativ ut i fluorescencen avbildar klart.

Figurera 3. Optiskt avbilda av en dermal fibroblastcell för mus. Fluorescence från FITC-phalloidin märkte actin. Området som markeras med viten, boxas visas in Figurerar 4.

Avbildar Figurerar in 4 all show som regionen av cellen kantar, som markeras med en boxas Figurerar in 3. Den optiska fluorescencen avbildar (A) har roterats för att göra jämförelse med AFMEN lättare avbildar (B, montage av två amplitud signalerar avbildar, och C, montage av topografi två avbildar), av det samma området.

Figurera 4. Jämförelsen av optiskt och AFM avbildar av en fibroblast genom att använda JPK NanoWizard®. A: fluorescerande märkt actin (phalloidin-FITC). B: montagen av två AFM-amplitud signalerar avbildar. C: montagen av topografi för två AFM avbildar. Fjäll bommar för µm 2 sammanlagt, höjd spänner av AFM avbildar är µm 1,8.

De fina framstickandena på cellgränsen (som markeras med vitarrowheads) är synliga i fluorescencen avbildar svagt (A), men kan klart lösas i AFMEN avbildar (B, C). Andra isolerade särdrag på cellen ytbehandlar är endast synliga i AFMEN avbildar (till exempel, det stora särdrag som markeras med en svart arrowhead).

AFMEN och det optiskt avbildar ger här kompletterande information om båda ytbehandla av cellen, och submembranous strukturerar. AFMEN avbildar ger både verklig 3-D information om cellen formar (från topografin signalerar), och ett intryck av boten strukturerar på cellen ytbehandlar (från amplituden signalera). Kombinationen av optisk och strukturell information låter IDet av de cell- delarna som det bakomliggande särskilda cellmembranet strukturerar.

Behandlade Fibroblasts

Att visa en applikation för den olika informationen, som är tillgänglig från denna kombination av microscopytekniker, verkställer en kort studie av det apoptotic av väteperoxiden (HO22) på fibroblasten som celler framläggas här.

De dermal fibroblastsna för musen behandlades med låga koncentrationer av väteperoxiden till påbörjandet en celldödkaskad. De behandlade cellerna kläcktes med peroxiden för 100 µMväten för endera 30 noterar eller en timme, för att fixas och den trådlika actinen som fluorescerande enligt ovan märktes för standart avbilda.

En överblick av resultaten ges in Figurerar 5 för kontrollerar celler (ingen behandling, avbildar serieA.C.), och celler som behandlas med väteperoxiden för 15, noterar (avbilda serien D-F) eller 30 noterar (GEN-I). Avbildar längs varje ror show som olika avbilda tekniker för den samma cellen tar prov. Arrangera gradviskontrasten (A, D, G) och epi-flurorescence (B, E, H) avbildar show, som samma tar prov område. Regionen för AFM-topografin avbildar (C, F, I) markeras i det optiskt avbildar med en boxas. Bildläsningsområdet för AFMEN avbildar var 20 µm för µm x 20 i varje fall.

Figurera 5. Kombinationen av optiskt och AFM avbildar av fibroblasts som behandlas med väteperoxiden. Avbilda celler för ntrolen för serieA.C.-shows (ingen HO22 behandling), D--Fshowsceller som har behandlats med 100 som µM HO22 för 30 noterar för fixation, och - I visar celler som har behandlats för en timme för fixation. Arrangera Gradvis kontrast avbildar (A, D, G) och epi-fluorescence från TC-phalloidin märkt show för actinglödtrådar (B, E, H) samma bildläsningsområde för varje fall. AFM-topografi avbildar (C, F, I) är 20 M x 20 µmbildläsningar i varje fall, for regionen som markeras med en boxas i det föregående optiskt, avbildar. Det sammanlagda höjdfjäll för C D F är µm 2,3 i båda fall, och det sammanlagda höjdfjäll in är Jag µm 9. Att avbilda för AFM bars ut i kontaktfunktionsläget som använder vässade DNP-cantilevers med, fjädrar konstanten 0,06 N/m.

Framstående actinkablar kan ses att sammanlagt tre avbildar (AC) för det untreated kontrollerar celler. I tillägg kan vesicles ses i arrangera gradviskontrasten avbildar, som korrelerar med framstickanden på cellen ytbehandlar i AFM-topografin avbildar (till exempel, den som cirklas i C).

Efter behandling för 30 har noterat med µMen 100 HO22, har actinglödtrådarna startat att dra tillbaka från kantar av cellerna. Fluorescencen avbildar i E-shows svimmar att befläcka på peripheryen av cellen, men specificerar kan klarare ses i den motsvarande AFMEN avbildar (F). En region av förhållandevis sänker membranet lämnas på peripheryen (som markeras med en pil i F) som har en bot - att koppla ihop strukturera understödja den, men de framstående actinfibrerna fördjupa ej längre till kanta av cellen.

Cellerna som behandlas med HO22 för en timmeshow en dramatisk ändring i cellmorfologi och en färdig rearrangement av actincytoskeletonen. Cellerna har tillbakadraget och blir rundare, förminskas actinkablarna, och blebs har startat att bilda på ytbehandla.

Blebsna bildar stort tredimensionellt strukturerar - det sammanlagda höjdfjäll för AFMEN avbildar i båda C AND F är µm 2,3, fördriver höjden spänner för jumbon avbildar (I) är µm 9. AFM-mätningarna låter ett kvantitativt mäter av ändringen i cellhöjd, som den rundar upp, och ytbehandlablebsna kunde analyseras för storleksanpassar, formar, numrerar eller volym. Jämförelsen med fluorescencen avbildar i H-shows som den bakomliggande actincytoskeletonen bleben strukturerar.

Summariskt

Denna rapport har introducerat några av möjligheterna av att kombinera olika optiska avbilda tekniker med AFM för att studera cellmorfologi och svar. Kombination av tekniker gör spänna av information bredare som kan samlas om cellen strukturerar och fungerar. Specifika molekylar på cellen ytbehandlar, eller i de bakomliggande delarna av cellen kan märkas, och avbildat för att undersöka deras förhållande till morfologin av cellen ytbehandla, och detaljen strukturerar. Dessa utredningar kan göras under fysiologiskt villkorar, eller även på bosatt celler, och närvarande nya tillfällen att analysera förhållandet mellan läkarundersökningen strukturerar, och cell- fungera.

Källa: JPK Instrumenterar

För mer information på denna källa behaga besök JPK Instrumenterar

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:30

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit