细胞联合的光学和 AFM 想象使用 NanoWizard 基本强制显微镜的从 JPK 仪器

包括的事宜

简介
鼠标黑瘤细胞标记与 YFP
成纤维细胞
对待的成纤维细胞
汇总

简介

结合光学和细胞 AFM 想象打开关联结构信息的许多可能性关于细胞表面与功能标记某些要素。 在此报表,示例与阶段对比的, DIC 光学显微学结合的显示 AFM,并且使用 JPK 在蔡司 AFM 的 epi 荧光挂接的 NanoWizard® Axiovert 200 倒置了光学显微镜。

作为一种特殊应用,细胞对待与过氧化氢导致 apoptotic blebbing。 光学和 AFM 想象的组合允许连结的更好的解释变化在膜表面上,当泡形成和肌动蛋白细胞骨架的结构的之间在他们下的。

鼠标黑瘤细胞标记与 YFP

在第一个示例中,使用了鼠标黑瘤附属细胞系 (B16)。 在此细胞系,肌动蛋白标记了与黄色萤光蛋白质 (YFP)。 细胞是从 Biotechnologisches Zentrum, TU 德累斯顿) 博士的克莱门斯弗朗兹 (蜂窝电话设备组,亲切的礼品。

在此细胞系的细胞是特别移动的,并且不很好遵守,因为他们增长,因此他们在想象前是固定的。 细胞只对待与 2% 戊二醛 45 秒,使从戊二醛的荧光摊缴减到最小,并且细胞然后被修理了在 4% 多聚甲醛的 20 分钟。

B16 细胞的光学图象在表 1. 显示。 这个上面的面板是使用 20x 水油浸接物镜得到的阶段对比图象。 这个更低的面板在细胞边缘附近显示区域的 YFP 荧光和获得了使用 63x 油浸透镜 (NA 1.2)。 YFP 标记肌动蛋白单体,那么有对萤光信号的某摊缴从细胞质以及从肌动蛋白细丝。

图 1. 光学图象鼠标黑瘤细胞。 上面的图象 - 请逐步采用对比, 20x 水浸没透镜。 降低图象 - 从 YFP 被标记的肌动蛋白, 63x 的荧光油浸透镜。 荧光图象包括的这个区域标记用在这个上面的图象的一个配件箱。

细胞的 AFM 想象在 Dulbecco 的 PBS 解决方法被执行了。 对于 AFM 想象,断断续续的联系模式使用了,与有大约 0.3 N/m. 一个弹簧常数的三角氮化硅悬臂。 在断断续续的联系模式下, AFM 传感器摆动在这个范例的表面,并且动摆的高度用于控制扫描程序。 此模式产生细胞表面的地势从高度信号的图象和图象,显示细胞表面的更加细致的详细资料。

图 2 显示 B16 鼠标黑瘤细胞边缘的光学和 AFM 图象比较。 这个上面的面板是一个 YFP 荧光图象,在表 1,并且这个更低的面板是二个 AFM 高度信号图象蒙太奇。 当这个技巧浏览在表面, AFM 高度信号与地势的梯度有关。 这意味着图象看上去遮蔽,好象地势从这个端被点燃,并且表面的更小的详细资料特别清楚被看到。 范例区是如被标记在表 1,但是荧光图象为与 AFM 图象的更加容易的比较被转动了。 缩放比例棒是 2 在两个面板的 µm。

图 2. B16 鼠标黑瘤细胞印象使用 JPK 在 Zeis 挂接的 NanoWizard® Axiovert 200 倒置了光学显微镜。 上面的面板 - YFP 荧光。 降低面板 - 同一个区域的二个 AFM 高度信号图象蒙太奇。 箭头 - 肌动蛋白细丝的示例在两个面板看见的。 环形 - 被舍入的功能的示例在细胞表面的,仅看到在 AFM 图象。 缩放比例在两个面板的棒 2 µm。

因为 YFP 标记所有肌动蛋白 (单体和细丝),细胞质在荧光图象,以及肌动蛋白细丝弱被标记。 更大的肌动蛋白细丝在 AFM 和光学荧光图象 (二个示例能被看见在与箭头的表 2 被标记)。 AFM 图象在表 2. 显示细胞表面的其他详细资料,然而,没出现于荧光图象,例如组被舍入的功能标记用空白环形。 AFM 面板的左手边特别地显示是相当与基础肌动蛋白细胞骨架不同的模式的表面结构。

成纤维细胞

鼠标皮肤成纤维细胞在玻璃盖玻片增长。 细胞修理了与 2% 戊二醛 45 秒然后 4% 多聚甲醛 20 分钟,至于鼠标黑瘤细胞的。 肌动蛋白细丝萤光是通过隔夜孵化细胞标记的在与 phalloidin-FITC 的 4°C,根据制造商指令。 细胞是印象的在 Dulbecco 的 PBS 解决方法。 使用 63x 油浸透镜和 FITC 补白集,荧光图象如上所述收集了。

图 3 显示一个查出的成纤维细胞的一个光学图象。 这个图象显示从被标记的肌动蛋白细丝的荧光。 肌动蛋白在表 1 更加严格被标记比对于 YFP 和对于黑瘤细胞开发的比这个成纤维细胞的细胞骨架,因此肌动蛋白电缆在荧光图象明显地引人注意。

图 3. 光学图象鼠标皮肤成纤维细胞细胞。 从 FITC-phalloidin 的荧光标记了肌动蛋白。 区标记用白色箱子在表 4. 显示。

图象在表 4 全部显示在表 3. 标记用一个配件箱细胞边缘的区域。 光学荧光图象 (a) 被转动实现与 AFM 图象 (二个高度信号图象和 C B、二个地势图象蒙太奇,蒙太奇的比较) 的同一区。

图 4. 一个成纤维细胞的光学和 AFM 图象比较使用 JPK NanoWizard® 的。 A : 萤光被标记的肌动蛋白 (phalloidin-FITC)。 B : 二个 AFM 高度信号图象蒙太奇。 C : 二个 AFM 地势图象蒙太奇。 称总计的棒 2 µm,高度范围 AFM 图象是 1.8 µm。

在细胞界限的细致的伸进 (标记用空白箭头) 微弱地是可视的在荧光图象 (a),但是可以明显地被解决在 AFM 图象 (B, C)。 其他查出的功能在细胞表面只是可视的在 AFM 图象 (例如,大功能标记用黑色箭头)。

这里 AFM 和光学图象提供关于这个细胞的表面和 submembranous 结构的补充信息。 AFM 图象有关于细胞形状的实际三维信息 (从地势信号) 和微细结构的印象在细胞表面 (从高度信号)。 光学和结构信息的组合允许蜂窝电话要素基础特殊细胞膜结构的确定。

对待的成纤维细胞

要展示对从显微学技术的此组合是可得到的另外信息的申请, (HO) 对成纤维细胞细胞存在得过氧化氢的22 apoptotic 作用的一个简要研究这里。

鼠标皮肤成纤维细胞对待与过氧化氢的低浓度启动细胞死亡级联。 对待的细胞孵化了与 100 µM 过氧化氢 30 分钟或一个小时,在是固定的和为标准想象萤光如上所述标记的纤维状肌动蛋白前。

结果概览在控制细胞 (没有处理,图象串联 A.C.) 和细胞的表 5 提供对待与 15 分钟 (图象串联 D-F) 或 30 分钟的 (美国兵) 过氧化氢。 沿每行的图象显示同一个细胞范例的不同的成象技术。 阶段对比 (A、 D、 G) 和 epi-flurorescence (B, E, H) 图象显示同一范例区。 AFM 地势图象的区域 (C, F, I) 在与配件箱的光学图象被标记。 AFM 图象的扫描区是 20 在每个案件的 µm x 20 µm。

图 5. 成纤维细胞的光学和 AFM 图象组合对待与过氧化氢。 图象串联 A.C. 显示 ntrol 细胞 (没有 HO22 处理), D-F 显示对待与 100 µM HO 22 在定象前的 30 分钟的细胞,和 - I 显示对待在定象前的一时数的细胞。 阶段对比图象 (A、 D、 G) 和 epi 荧光从 TCphalloidin 被标记的肌动蛋白细丝 (B, E, H) 显示同样浏览区每个案件。 AFM 地势图象 (C, F, I) 是 20 m x 在每个案件的 20 µm 扫描,为了这个区域标记用在之前的光学图象的一个配件箱。 C 的 d F 总高度缩放比例在两种情况下是 2.3 µm,并且总高度缩放比例我是 9 µm。 AFM 想象在联系模式下被执行了使用有弹簧常数的 0.06 N/m. 被削尖的 DNP 悬臂。

突出的肌动蛋白电缆在所有三个图象 (AC) 能被看见为未经治疗的控制细胞。 另外,泡在阶段对比图象能被看见,例如关联与在细胞表面的伸进在 AFM 地势图象 (在 C) 盘旋的那个。

在处理以后与 100 µM 的 30 分钟 HO22,肌动蛋白细丝开始从细胞的边缘缩回。 在 E 的荧光图象显示微弱弄脏在这个细胞的周围,但是详细资料在对应的 AFM 图象 (f) 能更加清楚被看到。 相对地平面的膜的区域被留下在这个周围 (标记用有一个细孔的结构支持它的一个箭头在 F),但是突出的肌动蛋白纤维不再请延伸到这个细胞的边缘。

细胞对待与 HO22 为一个时数显示在细胞形态学的剧烈的变动和肌动蛋白细胞骨架的完全重新整理。 细胞缩回了并且变得更加来回,减少肌动蛋白电缆,并且水在表面开始形成。

水表单大三维结构 - AFM 图象的总高度缩放比例在两 C and F 是 2.3 µm,而最后图象的 (i) 高度范围是 9 µm。 AFM 评定允许变化的一个定量评定在细胞高度上的,当它舍入,并且表面水可能对于范围、形状、编号或者数量分析。 与荧光图象的比较在 H 显示强调水结构的肌动蛋白细胞骨架。

汇总

此报表引入某些结合不同的光学成象技术的可能性与 AFM 的学习细胞形态学和回应。 结合技术扩大可以被会集关于胞状结构和功能的信息范围。 特定分子在细胞表面或在这个细胞的基础部分可以是被标记和印象的测试他们的对细胞表面和特殊结构的形态学的关系。 这些调查可以完成在生理情况下,甚至在活细胞和当前新的机会分析物理结构和蜂窝电话功能之间的关系。

来源: JPK 仪器

关于此来源的更多信息请参观 JPK 仪器

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:46

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit