細胞聯合的光學和 AFM 想像使用 NanoWizard 基本強制顯微鏡的從 JPK 儀器

包括的事宜

簡介
鼠標黑瘤細胞標記與 YFP
成纖維細胞
對待的成纖維細胞
彙總

簡介

結合光學和細胞 AFM 想像打開關聯結構信息的許多可能性關於細胞表面與功能標記某些要素。 在此報表,示例與階段對比的, DIC 光學顯微學結合的顯示 AFM,并且使用 JPK 在蔡司 AFM 的 epi 熒光掛接的 NanoWizard® Axiovert 200 倒置了光學顯微鏡。

作為一種特殊應用,細胞對待與過氧化氫導致 apoptotic blebbing。 光學和 AFM 想像的組合允許連結的更好的解釋變化在膜表面上,當泡形成和肌動蛋白細胞骨架的結構的之間在他們下的。

鼠標黑瘤細胞標記與 YFP

在第一個示例中,使用了鼠標黑瘤附屬細胞系 (B16)。 在此細胞系,肌動蛋白標記了與黃色螢光蛋白質 (YFP)。 細胞是從 Biotechnologisches Zentrum, TU 德累斯頓) 博士的克萊門斯弗朗茲 (蜂窩電話設備組,親切的禮品。

在此細胞系的細胞是特別移動的,并且不很好遵守,因為他們增長,因此他們在想像前是固定的。 細胞只對待與 2% 戊二醛 45 秒,使從戊二醛的熒光攤繳減到最小,并且細胞然後被修理了在 4% 多聚甲醛的 20 分鐘。

B16 細胞的光學圖像在表 1. 顯示。 這個上面的面板是使用 20x 水油浸接物鏡得到的階段對比圖像。 這個更低的面板在細胞邊緣附近顯示區域的 YFP 熒光和獲得了使用 63x 油浸透鏡 (NA 1.2)。 YFP 標記肌動蛋白單體,那麼有對螢光信號的某攤繳從細胞質以及從肌動蛋白細絲。

圖 1. 光學圖像鼠標黑瘤細胞。 上面的圖像 - 请逐步採用對比, 20x 水浸沒透鏡。 降低圖像 - 從 YFP 被標記的肌動蛋白, 63x 的熒光油浸透鏡。 熒光圖像包括的這個區域標記用在這個上面的圖像的一個配件箱。

細胞的 AFM 想像在 Dulbecco 的 PBS 解決方法被執行了。 對於 AFM 想像,斷斷續續的聯繫模式使用了,與有大約 0.3 N/m. 一個彈簧常數的三角氮化硅懸臂。 在斷斷續續的聯繫模式下, AFM 傳感器擺動在這個範例的表面,并且動擺的高度用於控制掃描程序。 此模式產生細胞表面的地勢從高度信號的圖像和圖像,顯示細胞表面的更加細致的詳細資料。

圖 2 顯示 B16 鼠標黑瘤細胞邊緣的光學和 AFM 圖像比較。 這個上面的面板是一個 YFP 熒光圖像,在表 1,并且這個更低的面板是二個 AFM 高度信號圖像蒙太奇。 當這個技巧瀏覽在表面, AFM 高度信號與地勢的梯度有關。 這意味著圖像看上去遮蔽,好像地勢從這個端被點燃,并且表面的更小的詳細資料特別清楚被看到。 範例區是如被標記在表 1,但是熒光圖像為與 AFM 圖像的更加容易的比較被轉動了。 縮放比例棒是 2 在兩個面板的 µm。

圖 2. B16 鼠標黑瘤細胞印象使用 JPK 在 Zeis 掛接的 NanoWizard® Axiovert 200 倒置了光學顯微鏡。 上面的面板 - YFP 熒光。 降低面板 - 同一個區域的二個 AFM 高度信號圖像蒙太奇。 箭頭 - 肌動蛋白細絲的示例在兩個面板看見的。 環形 - 被舍入的功能的示例在細胞表面的,仅看到在 AFM 圖像。 縮放比例在兩個面板的棒 2 µm。

因為 YFP 標記所有肌動蛋白 (單體和細絲),細胞質在熒光圖像,以及肌動蛋白細絲弱被標記。 更大的肌動蛋白細絲在 AFM 和光學熒光圖像 (二個示例能被看見在與箭頭的表 2 被標記)。 AFM 圖像在表 2. 顯示細胞表面的其他詳細資料,然而,沒出現於熒光圖像,例如組被舍入的功能標記用空白環形。 AFM 面板的左手邊特別地顯示是相當與基礎肌動蛋白細胞骨架不同的模式的表面結構。

成纖維細胞

鼠標皮膚成纖維細胞在玻璃蓋玻片增長。 細胞修理了與 2% 戊二醛 45 秒然後 4% 多聚甲醛 20 分鐘,至於鼠標黑瘤細胞的。 肌動蛋白細絲螢光是通過隔夜孵化細胞標記的在與 phalloidin-FITC 的 4°C,根據製造商指令。 細胞是印象的在 Dulbecco 的 PBS 解決方法。 使用 63x 油浸透鏡和 FITC 補白集,熒光圖像如上所述收集了。

圖 3 顯示一個查出的成纖維細胞的一個光學圖像。 這個圖像顯示從被標記的肌動蛋白細絲的熒光。 肌動蛋白在表 1 更加嚴格被標記比對於 YFP 和對於黑瘤細胞開發的比這個成纖維細胞的細胞骨架,因此肌動蛋白電纜在熒光圖像明顯地引人注意。

圖 3. 光學圖像鼠標皮膚成纖維細胞細胞。 從 FITC-phalloidin 的熒光標記了肌動蛋白。 區標記用白色箱子在表 4. 顯示。

圖像在表 4 全部顯示在表 3. 標記用一個配件箱細胞邊緣的區域。 光學熒光圖像 (a) 被轉動實現與 AFM 圖像 (二个高度信號圖像和 C B、二個地勢圖像蒙太奇,蒙太奇的比較) 的同一區。

圖 4. 一個成纖維細胞的光學和 AFM 圖像比較使用 JPK NanoWizard® 的。 A : 螢光被標記的肌動蛋白 (phalloidin-FITC)。 B : 二個 AFM 高度信號圖像蒙太奇。 C : 二個 AFM 地勢圖像蒙太奇。 稱總計的棒 2 µm,高度範圍 AFM 圖像是 1.8 µm。

在細胞界限的細致的伸進 (標記用空白箭頭) 微弱地是可視的在熒光圖像 (a),但是可以明顯地被解決在 AFM 圖像 (B, C)。 其他查出的功能在細胞表面只是可視的在 AFM 圖像 (例如,大功能標記用黑色箭頭)。

這裡 AFM 和光學圖像提供關於這個細胞的表面和 submembranous 結構的補充信息。 AFM 圖像有關於細胞形狀的實際三維信息 (從地勢信號) 和微細結構的印象在細胞表面 (從高度信號)。 光學和結構信息的組合允許蜂窩電話要素基礎特殊細胞膜結構的確定。

對待的成纖維細胞

要展示對從顯微學技術的此組合是可得到的另外信息的申請, (HO) 對成纖維細胞細胞存在得過氧化氫的22 apoptotic 作用的一個簡要研究這裡。

鼠標皮膚成纖維細胞對待與過氧化氫的低濃度啟動細胞死亡級聯。 對待的細胞孵化了與 100 µM 過氧化氫 30 分鐘或一個小時,在是固定的和為標準想像螢光如上所述標記的纖維狀肌動蛋白前。

結果概覽在控制細胞 (沒有處理,圖像串聯 A.C.) 和細胞的表 5 提供對待與 15 分鐘 (圖像串聯 D-F) 或 30 分鐘的 (美國兵) 過氧化氫。 沿每行的圖像顯示同一個細胞範例的不同的成像技術。 階段對比 (A、 D、 G) 和 epi-flurorescence (B, E, H) 圖像顯示同一範例區。 AFM 地勢圖像的區域 (C, F, I) 在與配件箱的光學圖像被標記。 AFM 圖像的掃描區是 20 在每個案件的 µm x 20 µm。

圖 5. 成纖維細胞的光學和 AFM 圖像組合對待與過氧化氫。 圖像串聯 A.C. 顯示 ntrol 細胞 (沒有 HO22 處理), D-F 顯示對待與 100 µM HO 22 在定像前的 30 分鐘的細胞,和 - I 顯示對待在定像前的一時數的細胞。 階段對比圖像 (A、 D、 G) 和 epi 熒光從 TCphalloidin 被標記的肌動蛋白細絲 (B, E, H) 顯示同樣瀏覽區每個案件。 AFM 地勢圖像 (C, F, I) 是 20 m x 在每個案件的 20 µm 掃描,為了這個區域標記用在之前的光學圖像的一個配件箱。 C 的 d F 總高度縮放比例在兩種情況下是 2.3 µm,并且總高度縮放比例我是 9 µm。 AFM 想像在聯繫模式下被執行了使用有彈簧常數的 0.06 N/m. 被削尖的 DNP 懸臂。

突出的肌動蛋白電纜在所有三個圖像 (AC) 能被看見為未經治療的控制細胞。 另外,泡在階段對比圖像能被看見,例如關聯與在細胞表面的伸進在 AFM 地勢圖像 (在 C) 盤旋的那個。

在處理以後與 100 µM 的 30 分鐘 HO22,肌動蛋白細絲開始從細胞的邊緣縮回。 在 E 的熒光圖像顯示微弱弄髒在這個細胞的周圍,但是詳細資料在對應的 AFM 圖像 (f) 能更加清楚被看到。 相對地平面的膜的區域被留下在這個周圍 (標記用有一個細孔的結構支持它的一個箭頭在 F),但是突出的肌動蛋白纖維不再请延伸到這個細胞的邊緣。

細胞對待與 HO22 為一個時數顯示在細胞形態學的劇烈的變動和肌動蛋白細胞骨架的完全重新整理。 細胞縮回了并且變得更加來回,減少肌動蛋白電纜,并且水在表面開始形成。

水表單大三維結構 - AFM 圖像的總高度縮放比例在兩 C and F 是 2.3 µm,而最後圖像的 (i) 高度範圍是 9 µm。 AFM 評定允許變化的一個定量評定在細胞高度上的,當它舍入,并且表面水可能對於範圍、形狀、編號或者數量分析。 與熒光圖像的比較在 H 顯示強調水結構的肌動蛋白細胞骨架。

彙總

此報表引入某些結合不同的光學成像技術的可能性與 AFM 的學習細胞形態學和回應。 結合技術擴大可以被會集關於胞狀結構和功能的信息範圍。 特定分子在細胞表面或在這個細胞的基礎部分可以是被標記和印象的測試他們的對細胞表面和特殊結構的形態學的關係。 這些調查可以完成在生理情況下,甚至在活細胞和當前新的機會分析物理結構和蜂窩電話功能之間的關係。

來源: JPK 儀器

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Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:49

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