NanoWizard bioAFM perfekt egnet til at studere mikroorganismer ved JPK Instruments

:: AZoNanotechnology artikel

Emner, der

Indledning
Nanoteknologi for Mikrobiologi
Gær
Bakterier
Vira
Konklusioner
Anerkendelser

Indledning

Udtrykket "mikrobiologi" generelt beskriver undersøgelsen af ​​disse organismer usynlige for det menneskelige øje, især gær, bakterier og vira. Men disse tre typer af organismer er væsentligt forskellige fra hinanden. Gær og bakterier er forskellige celletyper (eukaryote og prokaryote), mens en virus ikke er strengt en levende organisme, som er en obligat intracellulær parasit. De værktøjer til at gennemføre forskning i mikrobiologi kan opdeles i to hovedområder-mikroskopi, som er nødvendig for visualisering og molekylær biologi, som har været anvendt til at karakterisere (i nogle tilfælde omfattende) den genetiske og proteom udgør disse organismer.

Nanoteknologi for Mikrobiologi

De første trin i åbningen inden for mikrobiologi kom med fremkomsten af ​​de første mikroskoper. Bakterier blev først visualiseres ved Antony van Leeuwenhoek, ved hjælp af en simpel, selvbyggede mikroskop, omkring 1676. Den mikroskoper bygget af Leeuwenhoek var ikke sammensatte mikroskoper, bygger i stedet på en enkelt linse, mere som en meget stærk lup. En af hans første beskrivelser af bakterier (benævnt animalcules) var fra prøver skrabet fra tænderne van Leeuwenhoek selv.

Mens gær har været anvendt i gæring og surdej brød til omkring 5000 år, var det i 1860, at Louis Pasteur først beskrevet gæren, Saccharomyces cerevisiae som effecter af disse processer. Louis Pasteur gjorde mange væsentlige bidrag til området for mikrobiologi i årenes løb, fra beskrivelsen af ​​S. cerevisiae, til hans elegante eksperimenter for at modbevise teorien om spontan generation og hans grundlæggende rolle i kimen teorien om sygdom og tidlig udvikling af vacciner. Faktisk var en af ​​Pasteurs succeser inden for udvikling af vacciner til at dæmpe rabiesvirus ved opvarmning til injektion som en vaccine, selv om de ikke er i stand til at visualisere selve virus i de berørte væv.

Fremskridt i lysmikroskopi ved den kombinerede arbejde, Ernst Abbe og Carl Zeiss i 1880'erne yderligere udvidet den forskning af den mikrobiologiske verden. Men som Abbe selv beskrevet, at der er en grænse for løsningen af ​​lysmikroskopi, afhængig af bølgelængden af ​​den reflekterende lys og numeriske åbning af linsen. I virkeligheden er løsningen af ​​lysmikroskopi begrænset til halvdelen af ​​bølgelængden af ​​lys, eller omkring 250 nm. Som sådan, havde studiet af strukturen af ​​virus til at vente på fremkomsten af ​​elektron mikroskop i 1931 af Ernst Ruska og den efterfølgende krystallisering af den tobak mosaic virus i 1935 af Wendall Stanley.

På det seneste har atomic force mikroskop åbnet en ny vej til undersøgelse og manipulation af strukturer på et meget lille målestok. En af de oftest nævnte fordele ved AFM i studiet af biologiske strukturer er, at i modsætning til elektronmikroskopi, kan billeder i høj opløsning opnås under fysiologiske betingelser. Men der er mere til AFM end blot sin evne til høj opløsning billeddannelse. Den mekaniske karakter AFM betyder, at cantilever, der anvendes til billeddannelse, også kan bruges til at måle samspil styrker, i de piconewton området.

Som sådan, ikke kun kan AFM billede af overfladen af ​​mikroorganismer i høj opløsning, under fysiologiske forhold, kan den også bruges til at undersøge de bindende kræfter mellem mikroorganismer og målrette overflader.

Den JPK Nanowizard ® BioAFM er perfekt egnet til sådanne undersøgelser. Den Nanowizard ® er designet til at arbejde samtidigt med lys mikroskopi, og er installeret på en omvendt lysmikroskop, så flere kanaler med oplysninger der skal indsamles og reducere eksperimenterende tid ved at lade brugeren at identificere placeringen af celler af interesse optisk, før scanning af et bestemt region med AFM. Den er specielt designet prøve indehaveren, JPK BioCell ™ , letter eksperimenter ved temperaturer mellem 15-60 ° C på tynde glas dækglas, således at kvaliteten af optiske billeder i ikke reduceres. Hertil kommer, at JPK Nanowizard ® udviser overlegen stabilitet, der giver høj opløsning billeddannelse af celle-komponenter, såsom bakteriel overflade lag (figur 1) samt fysiologiske scanning af hele celler, fra prokaryoter til eukaryoter.

Figur 1. HPI lag fra Deinococcus radiodurans, billede venligst udlånt af Dr. Patrick Frederix, Universitetet i Basel.

Gær

Gæren S. cerevisiae, også kendt som spirende gær, ikke kun for brug i industrielle processer fra brød til brygning af øl, det er også en type organisme i studiet af eukaryote celler. Da S. cerevisiae er i stand til haploide og diploide vækst og er en enkelt celle organisme med en fordobling tid af et par timer, har det vist sig velegnet til studiet af de basale funktion af eukaryote celler.

Gæren S. cerevisiae er omgivet af en cellevæg, der består af proteiner, polysaccharider og små mængder af kitin. Elektronmikroskopi har vist, at denne celle væg er en lagdelt struktur, nemlig op til 300 nm tyk. Det inderste lag giver mekanisk styrke og er sammensat af A1 ,2-glycan og kitin. Det yderste lag er involveret i erkendelse arrangementer mellem cellerne, og er for det meste består af stærkt glykosyleret mannoproteins. Tilstedeværelsen af ​​kulhydrat sidekæder på disse mannoproteins gør cellevæggen hydrofile og resultere i flere negative ladninger ved fysiologisk pH. Når filmede med AFM, overfladen af ​​cellen synes meget glat, og er let deformeres, hvilket nødvendiggør omhyggelig scanning med minimal kraft (figur 2). Det eneste synlige overflade træk er opløbet ar i den modsatte ende af moderen cellen til den nyligt danner datter celle. Overfladen ser glat som sukker obskure membranen.

Figur 2. Imaging af S. cerevisiae. Gærceller var placeret ved hjælp af DIC mikroskopi (A) og derefter filmede i kontakt mode i væske med AFM (B). I (C), et 3D-billede genereret fra højden kanal vises, fremhæver knop ar på moderen celle (gul pil.)

En af de unikke funktioner i AFM stammer fra den mekaniske karakter mikroskop selv. Den fleksible udhængende kan kalibreres, og senere anvendes til at beregne interaktionen kræfter. Dette kan så bruges til at bestemme både den kraft af samspillet mellem en prøve og cantilever, og længden, som overfladen elementer vil strække sig, før linket til cantilever er bristet.

Her har vi bragt cantilever i kontakt med en række punkter på overfladen af ​​både moderen og datteren celle. Mindst 10 kraft-afstand kurver blev opnået på flere point for hver celle.

Fra kraft-distance kurver, kan forskellige data hentes. I Figur 3 er kun en af ​​de udvide kurver (som cantilever nærmer sig overfladen og deformerer) er plottet i rødt. De andre kurver alle svarer til spore, eller tilbagetrækning af cantilever væk fra overfladen. I denne dementi fase, hvis en overflade element har bundet til cantilever vil cantilever afbøje nedad som piezo flytter chippen holder cantilever væk fra overfladen. Da cantilever afbøjer nedad den kraft, til overfladen element knyttet til cantilever vil stige. På den kraft, hvormed bånd mellem biomolekyle og cantilever er brudt, vil cantilever snap tilbage til sine ikke-afbøjet position.

Figur 3. Force-afstand kurver af samspillet mellem cantilever og overfladen af ​​datter (A) eller mor celle (B). I rød er den forlænge kurven, er alle andre trække kurver. Den maksimale uforpligtende kraft (F) og afstand (D) kan beregnes ud fra disse data. Den blå pil angiver det område af kurve, der er tegn på elastisk udspænding af molekyler.

Formen på trække del af den kraft-distance kurver kan også angive noget om materialets egenskaber af vedlagte biomolekyle. I dette tilfælde kurvens form viser, at overfladen elementer knyttet til cantilever deformere elastisk, før samspillet med cantilever er brudt. Derudover fra denne spore kurve kan man bestemme den kraft, der kræves for at bryde bånd og afstanden af ​​separation fra overfladen, hvor dette bånd forstyrrelser opstår.

Der er variation mellem de force-afstand kurver fås på samme celle, skyldes, at ikke enhver interaktion mellem cantilever og cellens overflade vil resultere i anbringelse af et biomolekyle til cantilever, vil cantilever ikke altid tillægger ende af et molekyle og overfladen sammensætning er i sagens natur heterogen. Det er derfor vigtigt at få et tilstrækkeligt antal af magt-distance kurver, således at data effektivt kan gøres til genstand for statistisk analyse. Her blev over 100 kraft kurver målt på hver celle, og den maksimale uforpligtende kraft, F og afstandskrav ved brud, D, blev beregnet og præsenteres i figur 4 som et histogram. Værdierne F og D var kun beregnes, når et samspil mellem en overflade molekyle og cantilever blev opdaget.

Figur 4. Histogrammer for forlængelse afstand D (A) og maksimal uforpligtende kraft F (B) for mor og datter celler.

I tilfælde af afstanden til at briste, viser histogrammet af værdier, der for begge celler dataene er normalt fordelt på op til 400 nm (Fig. 4A), og derefter for begge celler der er nogle større outliers. For at sammenligne de to datasæt af outliers over 400 nm var blevet tilsidesat. Inden for disse begrænsninger, for moderen cellen D = 139 ± 56 nm, og for datteren cellen D = 86 ± 43 nm. Disse værdier blev bestemt til at være markant anderledes, ved hjælp af en to-sidet student t-test.

De data for den maksimale uforpligtende kraft viser, at i gennemsnit, det uforpligtende kraft for moderen cellen er højere end den datter celle (mor, F = 352 PN: datter, F = 167 PN). Men i dette tilfælde, er der et meget bredere fordeling af uforpligtende kræfter og i begge tilfælde, var der en række af magt-distance kurver hvor der ikke var udslag af cantilever, dvs ingen binding af overflade molekyler til cantilever (Figur 4B ). Disse data tyder på en forskel i strukturen og sammensætningen af ​​cellevæggen mellem mor og datter cellen.

Bakterier

Som AFM er en overflade imaging teknik, har den været brugt til at karakterisere overfladestrukturer med høj opløsning. Nogle bakterier udviser en S-lag, eller overfladelag, bestående af et regelmæssigt pakket gitter af protein. Emballagen giver en strukturel stabilitet til prøven, kan så isoleret, krystallinsk Slayers skal afbildes i høj opløsning, der viser de enkelte protein underenheder. Den Hexagonal pakket mellemliggende lag fra archaebacteria Deinococcus radiodurans (figur 1) er et velkendt eksempel. I AFM billeder af denne HPI lag, kan man se de enkelte subunits af hver pore, og at nogle af disse porer er i et åbent kropsbygning, mens andre er lukkede.

Mens de fleste archaebacteria udstille S-lag, laboratoriestammer af eubacteria generelt ikke. De mest almindeligt anvendte laboratorium bakterier er Eschericia coli, en gram-negative bakterier. Gram-negative bakterier har en plasma membran, omgivet af en periplasmic rum, hvor der er en stiv, men meget porøse cellevæg af peptidoglycan. Dette er så omgivet af en ydre membran, hvorfra lipopolysaccarides af varierende længde udvide.

Figur 5. Sporadisk kontakt tilstand billeder af DH5a celler. Oversigt højde (A) og fejlsignal (B) billeder, og en højere forstørrelse fejlsignal billede (C) af overfladen af ​​bakterien.

Her har vi afbildet to stammer af E. coli, DH5a og OP50. Billederne af DH5a viser den klassiske, stang-formen af ​​mange gram-negative bakterier. Cellerne blev scannet i luft (Figur 5) og i buffer (Figur 6). Når afbildes i luften, overfladen af ​​bakterier forekommer yderst mønstrede. Hertil kommer, er en glorie omkring bakterien tilsyneladende. Disse strukturer sandsynligvis svarer til Pili, som findes på overfladen af ​​E. coli. I modsætning hertil overfladen af ​​bakterien, når filmede i væske (figur 6) vises meget glattere. I dette tilfælde skyldes det faktum, at overfladen strukturer ville være let fordrevet af bevægelse i spidsen under scanning, da de ikke er fast på plads.

Figur 6. Sporadisk kontakt tilstand billeder af DH5a i væske. En 3D-billede genereret fra topografiske data (A) og en større forstørrelse fejlsignal billede (B) vises.

Den OP50 stamme, samtidig med E. coli, synes ganske anderledes. OP50 blev oprindeligt isoleret som en stamme, der kunne bruges til foder Caenorhabditis elegans. Det er en uracil kræver stamme, der er mere skrøbeligt og mindre end andre E. coli stammer. Når afbildes i luft (figur 7) disse bakterier ikke udviser samme struktureret overflade, som ses for DH5a. Desuden er de celler mere skrøbelige og skal omhyggeligt filmede for at undgå at fjerne dem fra overfladen. I væske, er overfladen også mindre struktureret end DH5a, og regioner i cellens overflade er fordrevet i scanningen retning, formentlig svarende til forskydningen af ​​sukker og andre fleksible strukturer på overfladen af ​​cellen.

Figur 7. Billeder af OP50 bakterier filmede i luft (A-topografi, Berror signal) og væske (C-topografi, D-error signal).

Cantilever kan også bruges til at undersøge interaktioner med sukker på overfladen af ​​bakterier (som vist for S. cerevisiae ovenfor). Men her har vi tilknyttet bakterierne til cantilever (ved hjælp af poly-L-lysin) og målt samspillet mellem bakterier og glimmer overfladen (figur 8). En sådan teknik er enestående, fordi det giver mulighed for kvantificering af bakteriel-overflade vekselvirkninger, kritisk til undersøgelser af begroning i industrielle processer. Brugen af JPK Biocell ™ som en prøve indehaver tillader in situ tilsætning af stoffer til at blokere disse interaktioner.

Figur 8. Repræsentant kraft-afstand curvers af samspillet mellem cantilever-bundet DH5a og en glimmer overflade, i en buffer. En forlængelse kurve er præsenteret i rød, alle blå kurver er tilbagetrækning kurver. Forøgelse af den anvendte kraft ikke øge den maksimale uforpligtende kraft. Pile angiver individuelle uforpligtende arrangementer.

Repræsentant kraft-afstand kurver DH5á-glimmer interaktioner er præsenteret i Figur 8. I sammenligning med samspillet mellem cantilever med S. cerevisiae overfladen, er der ingen elastisk deformation af prøven. En række diskrete uforpligtende begivenheder kan ses, formentlig svarende til uforpligtende enkelte overflade elementer. Igen, fra den kraft afstand kurver man kan kvantificere den maksimale kraft der kræves for at adskille bakterierne fra overfladen, men man kan også begynde at undersøge individuelle uforpligtende arrangementer.

Vira

Vira er obligat intracellulære parasitter, der består af en ydre protein pels omgivende genetiske materiale, som består af enten DNA eller RNA. Det genetiske materiale ikke indeholder alle de oplysninger, der kræves til replikering, i stedet virus behøver for at undergrave den cellulære maskineri i værtscellen til at formere sig. Virus er meget små, omkring 20 nm til 400 nm. Det betyder, at karakterisering af virale struktur kræver høj opløsning billeddannelse teknikker, såsom atomic force mikroskopi. Her har vi afbildet tobak mosaic virus (TMV), den første virus filmede med elektronmikroskopi.

Figur 9. Sporadisk kontakt tilstand billeder af TMV partikler. Topografi (A), fase (B) og fejlsignal billeder (C) på den samme prøve region præsenteres.

De TMV partikler blev adsorberet til glimmer og filmede med sporadisk kontakt-tilstand. Disse virus partikler er kendt som cylindrisk capsids, hvor pelsen protein stakke i et spiralformet mønster omkring det genetiske materiale. Dette spiralskårne stabling kan ses i højden, fase og fejlsignal kanaler (figur 9). En væsentlig fordel ved at bruge en BioAFM, såsom JPK Nanowizard ® , til billede biologiske prøver, er, at imaging kan udføres i væske. Som sådan kan virus partikler skal afbildes på overfladen af ​​deres target-celler i væske. Her har vi afbildet influenzavirus knyttet til overfladen af ​​røde blodlegemer, i væske, ved hjælp af sporadisk kontakt-tilstand. Den virus partikler er klart afbildet på overfladen af ​​cellerne.

Figur 10. Influenza-virus partikler i forbindelse med overfladen af ​​en erytrocyt. Oversigten billede (A) og højere forstørrelse billede (B) af de røde blodlegemer overflade viser influenza-virus partikler (hvid pil)

Konklusioner

Den Nanowizard ® bioAFM er perfekt egnet til studiet af mikroorganismer. Den JPK Biocell giver fysiologiske forhold uden at ofre AFM stabilitet eller optisk kvalitet. Stabiliteten i mikroskopet gør det muligt billeder af de enkelte protein subunits, og fuld integration i en omvendt lysmikroskop muliggør en kombination af mikroskopi teknikker, der skal udføres samtidigt. Ikke alene giver denne platform giver billeder i høj opløsning af mikrobielle prøver, kan det bruges til at kvantificere samspillet kræfter mellem organismer og en overflade eller mellem cantilever og overflade-associerede molekyler.

Anerkendelser

Mange tak til Dr. Jeffrey Stear, Max Planck Institut for Molekylær Cellebiologi og Genetik, for E. coli og S. cerevisiae prøver. TMV er venligst leveret af Dr. Michael Laue fra Robert Koch Instituttet. De HPI billeder blev venligst stillet til rådighed af Dr. Patrick Frederix, universitetet i Basel.

Kilde: JPK Instruments

For mere information om denne kilde kan du besøge JPK Instruments