NanoWizard-bioAFM Tadellos Entsprochen für das Studieren von Mikroorganismen durch JPK-Instrumente

Themen Umfaßt

Einleitung
Nanotechnologie für Mikrobiologie
Hefe
Bakterien
Viren
Schlussfolgerungen
Quittungen

Einleitung

Der Ausdruck „Mikrobiologie“ beschreibt im Allgemeinen die Studie jener Organismen, die zum menschlichen Auge, insbesondere Hefe, Bakterien und Viren unsichtbar sind. Jedoch sind diese drei Baumuster von Organismen zu einander beträchtlich unterschiedlich. Hefe und Bakterien sind die verschiedenen Zellbaumuster (eukaryotic und prokaryotic beziehungsweise), während ein Virus nicht ausschließlich ein lebender Organismus ist-, seiend ein intrazellulärer Parasit des Verpflichtung. Die Hilfsmittel zum Leiten von Forschung in der Mikrobiologie können Mikroskopie mit zwei in die Hauptbereichen getrennt werden, die für Sichtbarmachung gefordert wird, und Molekularbiologie, die verwendet worden ist, um (in einigen Fällen umfassend) das genetische und das proteomic zu kennzeichnen, bilden von diesen Organismen.

Nanotechnologie für Mikrobiologie

Die ersten Schritte, wenn sie den Bereich von Mikrobiologie öffneten, kamen mit dem Aufkommen der ersten Mikroskope. Bakterien wurden zuerst von Antony van Leeuwenhoek, unter Verwendung eines einfachen, selbst gebaut Mikroskops, gegen 1676 sichtbar gemacht. Die Mikroskope, die durch Leeuwenhoek aufgebaut wurden, waren nicht die Verbundmikroskope und stattdessen beruhten auf einem einzelnen lense, eher wie ein sehr leistungsfähiges Vergrößerungsglas. Eine seiner Erstbeschreibungen der Bakterien (gekennzeichnet als kleine Tierchen) war von den Proben, die von den Zähnen von van Leeuwenhoek selbst gerieben wurden.

Während Hefe in der Gärung und Brot für herum 5000 Jahre zu säuern verwendet worden sind, war es im Jahre 1860 dass Louis Pasteur zuerst die Hefe beschrieb, Saccharomyces Cerevisiae als das effecter dieser Prozesse. Louis Pasteur ließ viele beträchtlichen Beiträge zum Bereich von Mikrobiologie im Laufe der Jahre, von der Beschreibung von S. cerevisiae, zu seinen eleganten Experimenten die Theorie der spontanen Generation und seiner grundlegenden Rolle in der Mikrobentheorie der Krankheit und der frühen Impfstoffentwicklung widerlegen. Tatsächlich war einer von Pasteurs Erfolgen auf dem Gebiet der Impfstoffentwicklung, Tollwutvirus durch Heizung für Einspritzung als Impfstoff zu vermindern, trotz des In der Lage seins nicht, das Virus selbst im betroffenen Gewebe sichtbar zu machen.

Die Förderungen, die in der Lichtmikroskopie von der kombinierten Arbeit von Ernst-Abbe und von Carl Zeiss in den 1880s dehnten gemacht wurden weiter, die Forschung der mikrobiologischen Welt aus. Jedoch wie Abbe selbst beschrieben, gibt es eine Grenze zur Auflösung der Lichtmikroskopie, abhängig von der Wellenlänge der illuminating Leuchte und der numerischen Öffnung des Objektivs. In Wirklichkeit ist die Auflösung der Lichtmikroskopie bis Hälfte Wellenlänge der Leuchte oder herum 250 nm begrenzt. Als solches musste die Studie der Zelle der Viren auf die Einführung des Elektronenmikroskops warten im Jahre 1931 durch Ernst Ruska und die nachfolgende Kristallisation vom Tabakmosaikvirus im Jahre 1935 durch Wendall Stanley.

Vor kurzem, hat das Atomkraftmikroskop einen neuen Pfad für die Untersuchung und die Manipulation von Zellen auf einem sehr kleinen Maßstab geöffnet. Einer der häufig zitierten Vorteile des FLUGHANDBUCHS in der Studie von biologischen Zellen ist die Tatsache, die, anders als Elektronenmikroskopie, Bilder der hohen Auflösung unter physiologischen Bedingungen erreicht werden können. Jedoch gibt es mehr zum FLUGHANDBUCH als gerade seine Kapazität für Darstellung der hohen Auflösung. Die mechanische Beschaffenheit des FLUGHANDBUCHS bedeutet, dass der Kragbalken, verwendet für Darstellung, auch verwendet werden kann, um Interaktionskräfte zu messen, in der piconewton Reichweite.

als solches kann nicht nur das FLUGHANDBUCH-Bild die Oberfläche von Mikroorganismen an der hohen Auflösung, unter physiologischen Bedingungen, es kann auch verwendet werden, um die verbindlichen Kräfte zwischen Mikroorganismen und Zieloberflächen nachzuforschen.

Das JPK Nanowizard® BioAFM wird tadellos zu solchen Studien entsprochen. Das Nanowizard® ist konstruiert, um mit Lichtmikroskopie gleichzeitig zu arbeiten und ist auf ein umgekehrtes Lichtmikroskop eingebaut, lässt mehrfache Kanäle von Informationen montiert sein und verringert experimentelle Zeit, indem man dem Benutzer erlaubt, den Einbauort von Zellen von Zinsen optisch zu kennzeichnen, bevor man eine bestimmte Region mit FLUGHANDBUCH scannt. Die besonders konstruierte Beispielhalterung, das JPK BioCell™, ermöglicht Experimente bei den Temperaturen zwischen 15-60°C auf dünnen Glasdeckgläsern, sodass die Qualität von optischen Bildern, in nicht verringert. Darüber hinaus weist das JPK Nanowizard® überlegene Stabilität auf und erlaubt Darstellung der hohen Auflösung von Zellbauteilen, wie bakteriellen Deckschichten (Abbildung 1) sowie physiologischer Darstellung von den ganzen Zellen, von Prokaryotes zu Eukaryotes.

Abbildung 1. HPI-Schicht von Deinococcus-radiodurans, Bild nett zur Verfügung gestellt von Dr. Patrick Frederix, Universität von Basel.

Hefe

Die Hefe S. cerevisae, auch bekannt als Knospungshefe, ist nicht nur vom Gebrauch in den industriellen Prozessen von der Brotherstellung zum Brauen des Bieres, es ist auch ein Baumuster Organismus in der Studie von Eukaryoten. Da S., das cerevisiae ist, zum haploiden oder diploiden Wachstum fähig ist und ein einzelliger Organismus mit einem Eilschritt von ein paar Stunden ist, hat es gut angepasstes zur Studie des grundlegenden Arbeitens der Eukaryoten geprüft.

Die Hefe S., die cerevisiae ist, wird durch eine Zellwand umgeben, die aus Proteinen, Polysacchariden und kleinen Mengen des Chitins besteht. Elektronenmikroskopie hat gezeigt, dass diese Zellwand eine Sandwich-Struktur ist, die sich dick bis 300 nm erstreckt. Die innere Schicht leiht mechanische Festigkeit und wird aus â1,2-glycan und Chitin verfasst. Die äußere Schicht wird in Anerkennungsereignisse zwischen Zellen miteinbezogen und wird größtenteils aus schwer glykosylierten mannoproteins verfasst. Das Vorhandensein der Kohlenhydratseitenketten auf diesen mannoproteins stellt die Zellwand hydrophil her und ergibt mehrfache negative Ladung an physiologischer Ph. Wenn abgebildet mit FLUGHANDBUCH, sieht die Oberfläche der Zelle sehr glatt aus und wird leicht verformt und erfordert vorsichtiges Scannen an der minimalen Kraft (Abbildung 2). Das einzige offensichtliche Oberflächenmerkmal ist die Knospennarbe am anderen Ende der Mutterzelle zur eben Formungstochterzelle. Die Oberfläche sieht als der Zucker undeutlich machen die Membran glatt aus.

Abbildung 2. Darstellung von S. cerevisiae. Hefezellen waren unter Verwendung DIC-Mikroskopie (a) und dann abgebildet im Kontaktmodus in der Flüssigkeit mit dem FLUGHANDBUCH (b). In (c) einem Bild 3D, das vom Höhenkanal erzeugt wird, wird angezeigt und markiert die Knospennarbe auf der Mutterzelle (gelber Pfeil.)

Eins der eindeutigen Merkmale des FLUGHANDBUCHS stammt die mechanische Beschaffenheit des Mikroskops selbst ab. Der flexible Kragbalken kann kalibriert werden und nachfolgend verwendet werden, um Interaktionskräfte zu berechnen. Dieses kann dann verwendet werden, um die Kraft der Interaktion zwischen einer Probe und dem Kragbalken zu bestimmen, und zu dem die Länge Oberflächenelemente ausdehnt, bevor das Link zum Kragbalken gebrochen wird.

Hier haben wir den Kragbalken in Kontakt mit einigen Punkten auf der Oberfläche der Mutter und der Tochterzelle geholt. Mindestens wurden 10 Kraftabstand Kurven an den mehrfachen Punkten für jede Zelle erreicht.

Von den Kraftabstand Kurven können verschiedene Daten extrahiert werden. In Abbildung 3, ist nur eine der Ausdehnungskurven (als der Kragbalken nähert sich der Oberfläche und verformt sich), im Rot grafisch dargestellt worden. Alle anderes kurvt entsprechen dem Zurückverfolgung oder Einfahren des Kragbalkens weg von der Oberfläche. Während dieser Einfahrenphase wenn ein Oberflächenelement zum Kragbalken gesprungen ist, lenkt der Kragbalken nach unten als die piezo Bewegungen das Chip ab, das den Kragbalken weg von der Oberfläche anhält. Da der Kragbalken nach unten ablenkt, erhöht die Kraft, die am Oberflächenelement befestigt wird zum Kragbalken aufgewendet wird. An der Kraft, an der das Anleihe zwischen dem Biomolekül und dem Kragbalken unterbrochen ist, reißt der Kragbalken zurück zu seiner nicht-abgelenkten Stellung.

Abbildung 3. Kraft-Abstand Kurven der Interaktion zwischen dem Kragbalken und der Oberfläche der Tochter (a) oder der Mutterzelle (b). Im Rot ist die Ausdehnungskurve, alle andere sind einfahren Kurven. Die maximale befreiende Kraft (f) und der Trennungsabstand (d) können von diesen Daten berechnet werden. Der blaue Pfeil zeigt die Region der Kurve an, die vom elastischen Ausdehnen der Moleküle hinweisend ist.

Die Form des Einfahrungskapitels der Kraftabstand Kurven kann etwas über die Materialeigenschaften des befestigten Biomoleküls auch anzeigen. In diesem Fall zeigt die Form der Kurve, dass die Oberflächenelemente, die zum Kragbalken befestigt werden, sich elastisch verformen, bevor die Interaktion mit dem Kragbalken unterbrochen ist. Zusätzlich von diesem verfolgen Sie Kurve man kann die Kraft bestimmen zurück, die benötigt wird, um das Anleihe und den Abstand der Trennung von der Oberfläche zu brechen, an der diese Bondunterbrechung auftritt.

Es gibt Variabilität zwischen den Kraftabstand Kurven, die auf der gleichen Zelle erreicht werden, wegen der Tatsache, dass nicht jede Interaktion zwischen dem Kragbalken und der Zelloberfläche den Anhang eines Biomoleküls zum Kragbalken ergibt, der Kragbalken nicht immer befestigt zum Ende eines Moleküls und die Oberflächenzusammensetzung ist in sich selbst heterogen. Es ist deshalb wichtig, eine genügende Anzahl von Kraftabstand Kurven zu erwerben, damit die Daten statistischer Analyse effektiv unterworfen werden können. Hier über 100 Kraftkurven wurden auf jeder Zelle gemessen, und die maximale befreiende Kraft, das F und der Trennungsabstand am Bruch, D, wurden berechnet und werden in Abbildung 4 als Histogramm dargestellt. Die Werte F und D wurden nur berechnet, als eine Interaktion zwischen einem Oberflächenmolekül und dem Kragbalken entdeckt wurde.

Abbildung 4. Histogramme der Extension überholen D (a) und maximale befreiende Kraft F (b) für die Mutter- und Tochterzellen.

Im Falle des Abstandes zum Bruch, zeigt das Histogramm von Werten, dass für beide Zellen die Daten normalerweise bis 400 nm (Feige 4A) verteilt werden, und dann für beide Zellen gibt es einige größere Ausreißer. Um die zwei Dateien zu vergleichen wurden die Ausreißer über 400 nm missachtet. Innerhalb dieser Beschränkungen, für die Mutterzelle D = 139 ± 56 nm und für die Tochterzelle D = 86 ± 43 nm. Diese Werte wurden bestimmt, um, unter Verwendung einer zweischwänzigen Student T-Prüfung beträchtlich unterschiedlich zu sein.

Die Daten für die maximale befreiende Kraft zeigen, dass im Durchschnitt die befreiende Kraft für die Mutterzelle höher als die der Tochterzelle ist (Mutter, F = 352 pN: Tochter, F = 167 pN). Jedoch in diesem Fall gibt es eine viel breitere Verteilung von befreienden Kräften und in beiden Fällen, gab es einige Kraftabstand Kurven, in denen es keinen Ausschlag des Kragbalkens gab, d.h. keine Schwergängigkeit von Oberflächenmolekülen zum Kragbalken (Abbildung 4B). Diese Daten schlagen einen Unterschied bezüglich der Zelle und der Zusammensetzung der Zellwand zwischen der Mutter und der Tochterzelle vor.

Bakterien

Da FLUGHANDBUCH eine Oberflächenabbildungstechnik ist, ist es verwendet worden, um Oberflächenzellen an der hohen Auflösung zu kennzeichnen. Einige Bakterien weisen eine S-Schicht- oder Deckschicht auf und bestehen aus einem regelmäßig gepackten Gitter des Proteins. Die Verpackung leiht eine strukturelle Stabilität zur Probe, so getrennte, kristallene Mörder kann an der hohen Auflösung, einzelne Proteinuntereinheiten der Vertretung abgebildet sein. Die sechseckig gepackte Zwischenschicht von den Archaebacteria Deinococcus-radiodurans (Abbildung 1) ist ein weithin bekanntes Beispiel. In FLUGHANDBUCH-Bildern dieser HPI-Schicht, kann man die einzelnen Untereinheiten jeder Pore sehen und dass einige dieser Poren in einer offenen Anpassung sind, während andere sind geschlossen.

Während die meisten Archaebacteriaausstellung S-Schichten, Laborspannungen von Eubacteria im Allgemeinen nicht tun. Die allgemein verwendetsten Laborbakterien ist- Eschericia Coli, Bakterien eines Gram negativ. Gram negativ-Bakterien haben eine Plasmamembran, umgeben durch in der einen periplasmic Platz es eine steife aber in hohem Grade poröse Zellwand von peptidoglycan gibt. Dieses wird dann durch eine äußere Membran umgeben, von der lipopolysaccarides der unterschiedlichen Länge sich ausdehnen.

Abbildung 5. Zeitweilige Kontaktmodusbilder von DH5a-Zellen. Überblickhöhe (a) und Fehler signalisieren (b) Bilder und ein höheres Vergrößerungsfehlersignalbild (c) der Oberfläche der Bakterie.

Hier haben wir abgebildete zwei Spannungen von Escherichia Coli, von DH5a und von OP50. Die Bilder von DH5a zeigen den Klassiker, Gestängeform vieler Gram negativ-Bakterien. Die Zellen wurden in einer Luft gescannt (Abbildung 5) und im Buffer (Abbildung 6). Wenn abgebildet in einer Luft, sieht die Oberfläche der Bakterien in hohem Grade kopiert aus. Darüber hinaus ist ein Halo um die Bakterie offensichtlich. Diese Zellen entsprechen wahrscheinlich pili, die an der Oberfläche von Escherichia Coli gefunden werden. Demgegenüber wenn abgebildet in der Flüssigkeit (Abbildung 6) die Oberfläche der Bakterie sieht viel glatter aus. In diesem Fall liegt dieses an der Tatsache, dass die Oberflächenzellen leicht durch die Bewegung der Spitze während des Scannens verlegt würden, da sie nicht an Ort und Stelle repariert werden.

Abbildung 6. Zeitweilige Kontaktmodusbilder von DH5a in der Flüssigkeit. Ein Bild 3D, das von topographischen Daten (a) erzeugt werden und ein höheres Vergrößerungsfehlersignalbild (b) werden angezeigt.

Die Spannung OP50, während auch Escherichia Coli, sieht ziemlich unterschiedlich aus. OP50 wurde ursprünglich als Spannung getrennt, die verwendet werden könnte, um Caenorhabditis-elegans zu führen. Es ist ein Urazil, das Spannung benötigt, die zerbrechlicher und kleiner ist, als andere Escherichia- Colispannungen. Wenn abgebildet in einer Luft (Abbildung 7) diese Bakterien weisen die gleiche strukturierte Oberfläche nicht wie für das DH5a gesehen auf. Darüber hinaus sind die Zellen zerbrechlicher und müssen sorgfältig abgebildet sein sie, von der Oberfläche zu löschen zu vermeiden. In der Flüssigkeit wird die Oberfläche auch weniger als die von DH5a strukturiert, und Regionen der Zelloberfläche werden in der Suchrichtung verlegt, die entsprechend der Distanzadresse des Zuckers und anderer flexibler Zellen an der Oberfläche der Zelle wahrscheinlich ist.

Abbildung 7. Bilder von den Bakterien OP50 abgebildet in einer Luft (Ein-Topographie, Berror-Signal) und in der Flüssigkeit (C-Topographie, D-Fehlersignal).

Der Kragbalken kann auch verwendet werden, um Interaktionen mit dem Zucker an der Oberfläche der Bakterien zu prüfen (wie gezeigt für oben genanntes S. cerevisiae). Jedoch hier haben wir die Bakterien zum Kragbalken (unter Verwendung des Poly--Llysins) befestigt und der Interaktion zwischen den Bakterien und der Glimmeroberfläche gemessen (Abbildung 8). Solch Eine Technik ist dadurch eindeutig, dass sie die Quantifikation von Bakterielloberfläche Interaktionen erlaubt, kritisch für Studien von Biofouling in den industriellen Prozessen. Der Gebrauch des JPK Biocell™ als Beispielhalterung lässt den in-situzusatz von Mitteln diese Interaktionen blockieren.

Abbildung 8. Repräsentativ-Kraftabstand curvers der Interaktion zwischen freitragend-gehendem DH5a und einer Glimmeroberfläche, im Buffer. Eine Ausdehnungskurve wird im Rot, alle blauen Kurven sind Einfahrenkurven dargestellt. Das Erhöhen der angewandten Kraft erhöhte nicht die maximale befreiende Kraft. Pfeile zeigen einzelne befreiende Ereignisse an.

Repräsentativ-Kraftabstand Kurven von DH5á-mica Interaktionen werden in Abbildung 8. Im Vergleich zu der Interaktion des Kragbalkens mit der Oberfläche S. cerevisiae, dort ist keine elastische Deformation der Probe dargestellt. Einige getrennte befreiende Ereignisse können gesehen werden, wahrscheinlich entsprechend dem Befreien von einzelnen Oberflächenelementen. Wieder von den Kraftabstandskurven man kann die maximale Kraft mengenmäßig bestimmen, die benötigt wird, um sich die Bakterien von der Oberfläche zu trennen, gleichwohl man auch beginnen kann, einzelne befreiende Ereignisse nachzuforschen.

Viren

Viren sind verpflichten die intrazellulären Parasiten, die aus einem umgebenden Genmaterial des äußeren Proteinmantels bestehen, das entweder DNS oder aus RNS besteht. Dieses Genmaterial enthält nicht alle Informationen, die für Wiederholung benötigt werden, stattdessen muss das Virus die zelluläre Maschinerie der Wirtszelle umstürzen, um fortzupflanzen. Viren sind, herum 20 nm bis 400 nm extrem klein. Dies heißt, dass die Kennzeichnung der Virenzelle Abbildungstechniken der hohen Auflösung benötigt, wie Atomkraftmikroskopie. Hier haben wir abgebildetes Tabakmosaikvirus (TMV), das erste Virus, das unter Verwendung der Elektronenmikroskopie abgebildet ist.

Abbildung 9. Zeitweilige Kontaktmodusbilder von TMV-Partikeln. Topographie (a), Phase (b) und Fehlersignalbilder (c) der gleichen Beispielregion werden dargestellt.

Die TMV-Partikel wurden zum Glimmer und abgebildet unter Verwendung des zeitweiligen Kontaktmodus adsorbiert. Diese Viruspartikel als schraubenartige capsids, in denen die Mantelproteinstapel in einem schraubenartigen Muster um das Genmaterial bekannt. Dieses schraubenartige Stapeln kann in den Höhen-, Phasen- und FehlerZeichenkanälen gesehen werden (Abbildung 9). Ein beträchtlicher Vorteil der Anwendung von einem BioAFM, wie das JPK Nanowizard®, zu den biologischen Proben des Bildes, ist, dass die Darstellung in Flüssigkeit geleitet werden kann. Als solches können Viruspartikel auf der Oberfläche ihrer Zielzellen, in der Flüssigkeit abgebildet sein. Hier haben wir das abgebildete Grippevirus, das zur Oberfläche von roten Blutkörperchen, in der Flüssigkeit, unter Verwendung des zeitweiligen Kontaktmodus befestigt wird. Die Viruspartikel sind offenbar an der Oberfläche der Zellen abgebildet.

Abbildung 10. Grippeviruspartikel verbunden mit der Oberfläche eines Erythrozyts. Das Überblickbild (a) und das höhere Vergrößerungsbild (b) der Oberfläche des roten Blutkörperchens zeigen Grippeviruspartikel (weißen Pfeil)

Schlussfolgerungen

Das Nanowizard®-bioAFM wird tadellos für die Studie von Mikroorganismen entsprochen. Das JPK Biocell stellt physiologische Bedingungen zur Verfügung, ohne FLUGHANDBUCH-Stabilität oder optische Qualität zu opfern. Die Stabilität des Mikroskops aktiviert Darstellung von einzelnen Protein-Untereinheiten, und volle Integration in ein umgekehrtes Lichtmikroskop aktiviert eine Kombination von Mikroskopietechniken, gleichzeitig geleitet zu werden. Nicht nur erlaubt diese Plattform Bilder der hohen Auflösung von Mikrobenproben, kann sie verwendet werden, um Interaktionskräfte zwischen Organismen und einer Oberfläche oder zwischen den freitragenden und Oberfläche-verbundenen Molekülen mengenmäßig zu bestimmen.

Quittungen

Vielen Dank Dr. Jeffrey Stear, Max Planck Institute für Molekulare Zellbiologie und Genetik, für die Proben Escherichia Coli und S. cerevisiae. TMV wurde nett von Dr. Michael Laue vom Robert Koch-Institut zur Verfügung gestellt. Die HPI-Bilder wurden nett von Dr. Patrick Frederix, Universität von Basel zur Verfügung gestellt.

Quelle: JPK-Instrumente

Zu mehr Information über diese Quelle besuchen Sie bitte JPK-Instrumente

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:59

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