BioAFM de NanoWizard Adecuado Perfectamente para Estudiar Microorganismos por los Instrumentos de JPK

Temas Revestidos

Introducción
Nanotecnología para la Microbiología
Levadura
Bacterias
Virus
Conclusiones
Acuses De Recibo

Introducción

El término “microbiología” describe generalmente el estudio de esos organismos invisibles al aro humano, particularmente levadura, bacterias y virus. Sin Embargo, estos tres tipos de organismos son importante diferentes de uno a. La Levadura y las bacterias son diversos tipos de la célula (eucariótico y procariótico respectivamente), mientras que un virus no es estrictamente un organismo vivo, siendo un parásito intracelular de la obligación. Las herramientas para conducto la investigación en microbiología se pueden separar en la microscopia principal de dos campos, que se requiere para la visualización, y la biología molecular, que se ha utilizado para caracterizar (en algunos casos completo) el genético y proteomic compone de estos organismos.

Nanotecnología para la Microbiología

Los pasos iniciales en la apertura del campo de la microbiología vinieron con la llegada de los primeros microscopios. Las Bacterias primero fueron visualizadas por Antonio van Leeuwenhoek, usando un microscopio simple, uno mismo-construido, hacia 1676. Los microscopios construidos por Leeuwenhoek no eran microscopios compuestos, confiando en lugar de otro en un único lense, más bién una lupa muy potente. Una de sus primeras descripciones de las bacterias (designadas animálculos) era de las muestras escariadas de los dientes de van Leeuwenhoek mismo.

Mientras Que la levadura se ha utilizado en la fermentación y leudar el pan por alrededor 5000 años, era en 1860 que Louis Pasteur primero describió la levadura, Saccharomyces Cerevisiae como el effecter de estos procesos. Louis Pasteur hizo muchas contribuciones importantes al campo de la microbiología a lo largo de los años, de la descripción del S. cerevisiae, a sus experimentos elegantes para refutar la teoría de la generación espontánea y de su papel fundamental en la teoría de germen de la enfermedad y del revelado vaccíneo temprano. De hecho, uno de los éxitos de Pasteur en el campo del revelado vaccíneo era atenuar el virus de rabia a través de la calefacción para la inyección como vacuna, a pesar de no poder visualizar el virus sí mismo en el tejido afectado.

Los Adelantos hechos en microscopia pálida por el trabajo combinado del Abbe de Ernst y Carl Zeiss en los 1880s ampliaron más lejos la investigación del mundo microbiológico. Sin Embargo, como Abbe mismo descrito, hay un límite a la resolución de la microscopia pálida, relacionada en la longitud de onda de la luz illuminating y de la apertura numérica del lente. En realidad, la resolución de la microscopia pálida se limita a la mitad de la longitud de onda de la luz, o a alrededor 250 nanómetro. Como tal, el estudio de la estructura de virus tuvo que esperar el advenimiento del microscopio electrónico en 1931 por Ernst Ruska y la cristalización subsiguiente del virus de mosaico de tabaco en 1935 por Wendall Stanley.

Más recientemente, el microscopio atómico de la fuerza ha abierto un nuevo camino para la investigación y la manipulación de estructuras en mismo una pequeña escala. Una de las ventajas lo más a menudo posible citadas del AFM en el estudio de estructuras biológicas es el hecho de que, a diferencia de microscopia electrónica, las imágenes de alta resolución se pueden obtener bajo condiciones fisiológicas. Sin Embargo, hay más al AFM que apenas su capacidad para la proyección de imagen de alta resolución. La naturaleza mecánica del AFM significa que el voladizo, usado para la proyección de imagen, se puede también utilizar para medir fuerzas de la acción recíproca, en el rango del piconewton.

como tal, no sólo puede la imagen del AFM la superficie de microorganismos en la alta resolución, bajo condiciones fisiológicas, él se puede también utilizar para investigar las fuerzas de enlace entre los microorganismos y las superficies de la meta.

El JPK Nanowizard® BioAFM se adapta perfectamente a tales estudios. El Nanowizard® se diseña para trabajar simultáneamente con microscopia pálida, y se instala en un microscopio pálido invertido, permitiendo los canales múltiples de la información sean cerco y reduciendo tiempo experimental permitiendo que el utilizador determine la ubicación de células del interés ópticamente, antes de explorar una región determinada con el AFM. El casquillo especialmente diseñado de la muestra, el JPK BioCell™, facilita experimentos en las temperaturas entre 15-60°C en tiras de cristal finas, tal que la calidad de imágenes ópticas en no reducido. Además, el JPK Nanowizard® exhibe estabilidad superior, permitiendo la proyección de imagen de alta resolución de los componentes de la célula, tales como capas superficiales bacterianas (Cuadro 1) así como proyección de imagen fisiológica de células enteras, de prokaryotes a los eucariotas.

Cuadro 1. capa de los radiodurans de Deinococcus, imagen de HPI proporcionada amablemente por el Dr. Patrick Frederix, Universidad de Basilea.

Levadura

Los cerevisae de la levadura S., conocidos también como levadura de florecimiento, son no sólo de uso en procesos industriales de la fabricación de pan a elaborar de la cerveza, él son también un tipo organismo en el estudio de células eucarióticas. Pues el S. cerevisiae es capaz de incremento haploide o diploide y es un organismo unicelular con un rato que duplica de un par de horas, ha probado bien adaptado al estudio del funcionamiento básico de células eucarióticas.

La levadura S. cerevisiae es rodeada por una pared celular integrada por proteínas, polisacáridos y pequeñas cantidades de quitina. La microscopia electrónica ha mostrado que esta pared celular es una estructura acodada que coloca hasta 300 nanómetro densamente. La capa interna presta fuerza mecánica y se compone de â1,2-glycan y de la quitina. La capa exterior está implicada en acciones del reconocimiento entre las células, y compuesta sobre todo de mannoproteins pesado glycosylated. La presencia de las cadenas laterales del hidrato de carbono en estos mannoproteins hace la pared celular hidrofílica y da lugar a cargas negativas múltiples en el pH fisiológico. Cuando es reflejada con el AFM, la superficie de la célula aparece muy lisa, y se deforma fácilmente, necesitando la exploración cuidadosa en la fuerza mínima (Cuadro 2). La única característica superficial evidente es la cicatriz del brote en el extremo contrario de la célula de molde-madre a la célula de hija nuevamente de formación. La superficie aparece lisa como los azúcares obscurece la membrana.

Cuadro 2. Proyección De Imagen del S. cerevisiae. Las células de Levadura fueron situadas usando la microscopia de DIC (a) y entonces reflejado en modo de contacto en líquido con el AFM (b). En (c) una imagen 3D generada del canal de la altura se visualiza, destacando la cicatriz del brote en la célula de molde-madre (la flecha amarilla.)

Una de las características únicas del AFM proviene la naturaleza mecánica del microscopio sí mismo. El voladizo flexible se puede calibrar y utilizar posteriormente para calcular fuerzas de la acción recíproca. Esto se puede entonces utilizar para determinar la fuerza de la acción recíproca entre una muestra y el voladizo, y la longitud al cual los elementos superficiales estirará antes de que la conexión al voladizo se rompa.

Aquí, hemos traído el voladizo en contacto con varias puntas en la superficie del molde-madre y de la célula de hija. Por lo menos 10 curvas de la fuerza-distancia fueron obtenidas en las puntas múltiples para cada célula.

De las curvas de la fuerza-distancia, los diversos datos pueden ser extraídos. En el Cuadro 3, solamente uno de las curvas del extender (como el voladizo se acerca a la superficie y la deforma) se ha trazado en rojo. El otro curva todo corresponde a la reconstitución, o a la contracción del voladizo lejos de la superficie. Durante esta fase de la contracción, si un elemento superficial ha limitado al voladizo, el voladizo desviará hacia abajo como los movimientos piezoeléctricos la viruta que sujeta el voladizo lejos de la superficie. Pues el voladizo desvía hacia abajo la fuerza aplicada al elemento superficial asociado al voladizo aumentará. En la fuerza en la cual el bono entre la biomolécula y el voladizo está fragmentado, el voladizo encajará a presión de nuevo a su posición no-desviada.

Cuadro 3. curvas de la Fuerza-Distancia de la acción recíproca entre el voladizo y la superficie de la hija (a) o de la célula de molde-madre (b). En rojo es la curva del extender, todos los demás es se retracta curvas. La fuerza de desatadura máxima (f) y la distancia de la separación (d) se pueden calcular de estos datos. La flecha azul indica la región de la curva que es indicativa de estirar elástico de las moléculas.

La dimensión de una variable de la sección del retractar de las curvas de la fuerza-distancia puede también indicar algo sobre las propiedades materiales de la biomolécula asociada. En este caso la dimensión de una variable de la curva muestra que los elementos superficiales asociados al voladizo deforman elástico, antes de que la acción recíproca con el voladizo esté fragmentada. Además, de esto retrace la curva una puede determinar la fuerza requerida para romper el bono y la distancia de la separación de la superficie en la cual esta desorganización en enlace ocurre.

Hay variabilidad entre las curvas de la fuerza-distancia obtenidas en la misma célula, debido al hecho de que no cada acción recíproca entre el voladizo y la superficie de la célula dará lugar al accesorio de una biomolécula al voladizo, el voladizo no asociará siempre al extremo de una molécula y la composición superficial es intrínsecamente heterogénea. Es por lo tanto importante detectar un suficiente número de curvas de la fuerza-distancia para poder sujetar efectivo los datos al análisis estadístico. Aquí, sobre 100 curvas de la fuerza fueron medidos en cada célula, y la fuerza, la F, y la distancia de desatadura máximas en la ruptura, D de la separación, eran calculadas y se presentan en el Cuadro 4 como histograma. Los valores F y D eran calculados solamente cuando una acción recíproca entre una molécula superficial y el voladizo fue detectada.

El Cuadro 4. Histogramas de la extensión se distancia D (a) y la fuerza de desatadura máxima F (b) para las células del molde-madre y de hija.

En el caso de la distancia a la ruptura, el histograma de valores muestra que para ambas células los datos están distribuidos normalmente hasta 400 nanómetro (Higo 4A), y entonces para ambas células hay algunos afloramientos más grandes. Para comparar los dos conjuntos de datos los afloramientos encima de 400 nanómetro fueron desatendidos. Dentro de estos apremios, para la célula de molde-madre D = 139 ± 56 nanómetro, y para la célula de hija D = 86 ± 43 nanómetro. Estos valores fueron determinados para ser importante diferentes, usando una T-Prueba con dos colas del estudiante.

Los datos para la fuerza de desatadura máxima muestran que, por término medio, la fuerza de desatadura para la célula de molde-madre es más alta que la de la célula de hija (molde-madre, F = 352 pN: hija, F = 167 pN). Sin Embargo, en este caso, hay una distribución mucho más amplia de fuerzas de desatadura y en ambos casos, había varias curvas de la fuerza-distancia donde no había desviación del voladizo, es decir ningún atascamiento de las moléculas superficiales al voladizo (Figura 4B). Estos datos sugieren una diferencia en la estructura y la composición de la pared celular entre el molde-madre y la célula de hija.

Bacterias

Pues el AFM es una técnica de proyección de imagen superficial, se ha utilizado para caracterizar las estructuras superficiales en la alta resolución. Algunas bacterias exhiben un Asesino, o la capa superficial, consistiendo en un cedazo regularmente pila de discos de la proteína. El empaque presta una estabilidad estructural a la muestra, Asesinos tan aislados, cristalinos puede ser reflejado en la alta resolución, subunidades individuales de la proteína de la demostración. La capa intermedia hexagonal pila de discos de los radiodurans de Deinococcus del archaebacteria (el Cuadro 1) es un ejemplo bien conocido. En imágenes del AFM de esta capa de HPI, una puede ver las subunidades individuales de cada poro, y que algunos de estos poros están en una conformación abierta, mientras que otras es cerrada.

Mientras Que no hacen la mayoría de los Asesinos de la pieza de convicción del archaebacteria, deformaciones del laboratorio del eubacteria generalmente. Las bacterias más de uso general del laboratorio son Eschericia coli, las bacterias gramnegativas. Las bacterias Gramnegativas tienen una membrana de plasma, rodeada por un espacio periplásmico en la cual hay una pared celular rígida pero altamente porosa de peptidoglycan. Esto entonces es rodeada por una membrana exterior, de la cual los lipopolysaccarides de la longitud diversa extienden.

Cuadro 5. imágenes Intermitentes del modo de contacto de las células de DH5a. La altura de la Reseña (a) y el desvío hacen señales (b) imágenes, y una imagen más alta de la señal del desvío de la magnificación (c) de la superficie de la bacteria.

Aquí, tenemos dos deformaciones reflejadas de Escherichia Coli, de DH5a y de OP50. Las imágenes de DH5a muestran la obra clásica, varilla-dimensión de una variable de muchas bacterias gramnegativas. Las células fueron exploradas en el aire (Cuadro 5) y en el almacenador intermediaro (Cuadro 6). Cuando es reflejada en aire, la superficie de las bacterias aparece modelada altamente. Además, un halo alrededor de la bacteria es evidente. Estas estructuras corresponden probablemente al pili, que se encuentran en la superficie de Escherichia Coli. En cambio, cuando es reflejado en líquido (el Cuadro 6) la superficie de la bacteria aparece mucho más liso. En este caso esto es debido al hecho de que las estructuras superficiales serían dislocadas fácilmente por el movimiento de la punta durante la exploración, pues no se reparan en el lugar.

Cuadro 6. imágenes Intermitentes del modo de contacto de DH5a en líquido. Una imagen 3D generada de los datos topográficos (a) y una imagen más alta de la señal del desvío de la magnificación (b) se visualizan.

La deformación OP50, mientras que también Escherichia Coli, aparece muy diferente. OP50 fue aislado originalmente como deformación que se podría utilizar para introducir los elegans de Caenorhabditis. Es un uracilo que requiere la deformación que es más frágil y más pequeña que otras deformaciones de Escherichia Coli. Cuando es reflejado en aire (el Cuadro 7) estas bacterias no exhibe la misma superficie estructurada según lo considerado para el DH5a. Además, las células son más frágiles y deben ser cuidadosamente reflejadas evitar quitarlos de la superficie. En líquido, la superficie también se estructura menos que la de DH5a, y las regiones de la superficie de la célula se dislocan en la dirección de exploración, probable correspondiente a la dislocación de los azúcares y de otras estructuras flexibles en la superficie de la célula.

Cuadro 7. Imágenes de las bacterias OP50 reflejadas en el aire (Uno-Topografía, señal de Berror) y el líquido (topografía de la C, señal del desvío de la D).

El voladizo se puede también utilizar para sondar acciones recíprocas con los azúcares en la superficie de las bacterias (como se muestra para antedicho cerevisiae del S.). Sin Embargo, aquí hemos asociado las bacterias al voladizo (usando la polivinílico-L-lisina) y hemos medido la acción recíproca entre las bacterias y la superficie de la mica (Cuadro 8). Tal técnica es única en que permite la cuantificación de las acciones recíprocas de la bacteriano-superficie, crítico para los estudios de biofouling en procesos industriales. El uso del JPK Biocell™ como casquillo de la muestra permite que la adición in situ de pastas ciegue estas acciones recíprocas.

Cuadro 8. curvers Representativos de la fuerza-distancia de la acción recíproca entre el voladizo-salto DH5a y una superficie de la mica, en almacenador intermediaro. Una curva del extender se presenta en rojo, todas las curvas azules es curvas de la contracción. El Aumento de la fuerza aplicada no aumentó la fuerza de desatadura máxima. Las Flechas indican acciones de desatadura individuales.

Las curvas Representativas de la fuerza-distancia de las acciones recíprocas de DH5á-mica se presentan en el Cuadro 8. En comparación con la acción recíproca del voladizo con la superficie cerevisiae del S., allí no son ninguna deformación elástica de la muestra. Varias acciones de desatadura discretas se pueden considerar, probable correspondiente a la desatadura de elementos superficiales individuales. Una Vez Más de las curvas una de la distancia de la fuerza puede cuantificar la fuerza máxima requerida para separar las bacterias de la superficie, no obstante una puede también comenzar a investigar acciones de desatadura individuales.

Virus

Los Virus son obligan los parásitos intracelulares integrados por un material genético circundante de la cubierta exterior de la proteína que consista en la DNA o el ARN. Este material genético no contiene toda la información requerida para la réplica, en lugar el virus necesita derribar la maquinaria celular de la célula huesped para propagar. Los Virus son extremadamente pequeños, alrededor 20 nanómetro a 400 nanómetro. Esto significa que la caracterización de la estructura viral requiere técnicas de proyección de imagen de alta resolución, tales como microscopia atómica de la fuerza. Aquí tenemos virus de mosaico de tabaco reflejado (TMV), el primer virus reflejado usando microscopia electrónica.

Cuadro 9. imágenes Intermitentes del modo de contacto de las partículas de TMV. Se presentan la Topografía (a), la fase (b) y las imágenes de la señal del desvío (c) de la misma región de la muestra.

Las partículas de TMV fueron adsorbidas a la mica y reflejado usando modo de contacto intermitente. Estas partículas del virus se conocen como capsids helicoidales, donde las pilas de la proteína de la cubierta en un modelo helicoidal alrededor del material genético. El Este empilar helicoidal se puede considerar en los canales de señal de la altura, de la fase y del desvío (Cuadro 9). Una ventaja importante de usar un BioAFM, tal como el JPK Nanowizard®, a las muestras biológicas de la imagen, es que la proyección de imagen se puede conducto en líquido. Como tal, las partículas del virus pueden ser reflejadas en la superficie de sus células de meta, en líquido. Aquí, tenemos virus de gripe reflejado asociado a la superficie de glóbulos rojos, en líquido, usando modo de contacto intermitente. Las partículas del virus son sin obstrucción reflejadas en la superficie de las células.

Cuadro 10. partículas del virus de Gripe asociadas a la superficie de un eritrocito. La imagen de la reseña (a) y una imagen más alta de la magnificación (b) de la superficie roja del glóbulo muestran las partículas del virus de gripe (la flecha blanca)

Conclusiones

El bioAFM de Nanowizard® se adapta perfectamente para el estudio de microorganismos. El JPK Biocell proporciona a condiciones fisiológicas sin sacrificar estabilidad del AFM o calidad óptica. La estabilidad del microscopio activa la proyección de imagen de las subunidades individuales de la proteína, y la integración completa en un microscopio pálido invertido permite a una combinación de las técnicas de la microscopia conducto simultáneamente. No sólo esta plataforma permite imágenes de alta resolución de muestras microbianas, puede ser utilizada para cuantificar fuerzas de la acción recíproca entre organismos y una superficie o entre las moléculas voladizas y superficie-asociadas.

Acuses De Recibo

Muchas gracias al Dr. Jeffrey Stear, Max Planck Institute para la Biología Celular y la Genética Moleculares, por las muestras cerevisiae de Escherichia Coli y del S. TMV fue proporcionado amablemente por el Dr. Michael Laue del Instituto de Robert Koch. Las imágenes de HPI fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Patrick Frederix, Universidad de Basilea.

Fuente: Instrumentos de JPK

Para más información sobre esta fuente visite por favor los Instrumentos de JPK

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:26

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