BioAFM de NanoWizard Parfaitement Adapté à Étudier des Micros-organismes par des Instruments de JPK

Sujets Couverts

Introduction
Nanotechnologie pour la Microbiologie
Levure
Bactéries
Virus
Conclusions
Remerciements

Introduction

Le terme « microbiologie » décrit généralement l'étude de ces organismes invisibles à l'oeil humain, en particulier levure, bactéries et virus. Cependant, ces trois types d'organismes sont sensiblement différents entre eux. La Levure et les bactéries sont différents types de cellules (eucaryotique et procaryotique respectivement), attendu qu'un virus n'est pas strictement un organisme vivant, étant un parasite intracellulaire d'obligation. Les outils pour conduire la recherche en microbiologie peuvent être séparés dans la microscopie principale de deux zones, qui est exigée pour la visualisation, et la biologie moléculaire, qui a été employée pour caractériser (dans certains cas largement) le génétique et proteomic composent de ces organismes.

Nanotechnologie pour la Microbiologie

Les premières étapes en ouvrant la zone de la microbiologie sont venues avec l'arrivée des premiers microscopes. Des Bactéries ont été conçues la première fois par Antony van Leeuwenhoek, utilisant un microscope simple et de construction auto, vers 1676. Les microscopes établis par Leeuwenhoek n'étaient pas les microscopes composés, se fondant au lieu sur un objectif unique, plutôt une loupe très puissante. Une de ses premières descriptions des bactéries (désignées sous le nom des animalcules) était des échantillons grattés des dents de van Leeuwenhoek lui-même.

Tandis Que de la levure ont été utilisées dans la fermentation et pour faire lever le pain pendant environ 5000 années, c'était en 1860 que Louis Pasteur a décrit la première fois la levure, des Saccharomyces cerevisiae comme effecter de ces procédés. Louis Pasteur a apporté beaucoup de cotisations significatives à la zone de la microbiologie au cours des années, à partir de la description du S. cerevisiae, à ses expériences élégantes pour réfuter la théorie de rétablissement spontané et de son rôle principal dans la théorie de germe de la maladie et de mise au point précoce de vaccin. En fait, un de la réussite de Pasteur dans le domaine de la mise au point de vaccin était d'atténuer le virus de la rage par le chauffage pour l'injection comme vaccin, en dépit de ne pas pouvoir concevoir le virus lui-même dans le tissu affecté.

Les Avancements effectués dans la photomicroscopie par le travail combiné de l'Abbe d'Ernst et Carl Zeiss pendant les 1880s ont davantage étendu la recherche du monde microbiologique. Cependant, comme Abbe lui-même décrit, il y a une limite à la définition de la photomicroscopie, dépendante de la longueur d'onde de la lumière illuminating et de l'ouverture numérique de la lentille. En réalité, la définition de la photomicroscopie est limitée à la moitié de la longueur d'onde de la lumière, ou environ à 250 nanomètre. En soi, l'étude de la structure des virus a dû attendre l'avènement du microscope électronique en 1931 par Ernst Ruska et la cristallisation ultérieure du virus de mosaïque du tabac en 1935 par Wendall Stanley.

Plus récent, le microscope atomique de force a ouvert un chemin neuf pour l'enquête et la manipulation des structures sur une échelle très petite. Un des avantages le plus souvent cités de l'AFM dans l'étude des structures biologiques est le fait que, à la différence de la microscopie électronique, des images de haute résolution peuvent être obtenues dans des conditions physiologiques. Cependant, il y a plus à l'AFM que juste sa capacité pour la représentation de haute résolution. La nature mécanique de l'AFM signifie que l'encorbellement, utilisé pour la représentation, peut également être utilisé pour mesurer des forces d'interaction, dans le domaine de piconewton.

en soi, peut non seulement l'image d'AFM la surface des micros-organismes à la haute résolution, dans des conditions physiologiques, il peut également être utilisée pour vérifier les forces de loi entre les micros-organismes et les surfaces d'objectif.

Le JPK Nanowizard® BioAFM est parfaitement adapté à de telles études. Le Nanowizard® est conçu pour fonctionner simultanément avec la photomicroscopie, et est installé sur un photomicroscope inversé, permettant aux tunnels multiples d'information d'être rassemblés et réduisant le temps expérimental en permettant à l'utilisateur de recenser l'emplacement des cellules d'intérêt optiquement, avant de balayer une région particulière avec l'AFM. Le support particulièrement conçu témoin, le JPK BioCell™, facilite des expériences aux températures entre 15-60°C sur les lamelles en verre minces, tels que la qualité des images optiques dans non réduit. De plus, le JPK Nanowizard® montre la stabilité supérieure, permettant la représentation de haute résolution des composants de cellules, tels que des couches extérieures bactériennes (le Schéma 1) ainsi que représentation physiologique des cellules entières, des prokaryotes aux eucaryotes.

Le Schéma 1. couche de HPI des radiodurans de Deinococcus, image avec bonté fournie par M. Patrick Frederix, Université de Bâle.

Levure

Les cerevisae de la levure S., connus également comme levure de bourgeonnement, est utiles non seulement dans des processus industriels d'effectuer de pain au brassage de la bière, il est également un type organisme dans l'étude des cellules eucaryotes. Car le S. cerevisiae est capable de l'accroissement haploïde ou diploïde et est un organisme unicellulaire avec du temps de doublement de quelques heures, il a bien adapté prouvé à l'étude du fonctionnement de base des cellules eucaryotes.

La levure S. cerevisiae est entourée par une paroi cellulaire composée de protéines, de polysaccharides et de petites quantités de chitine. La Microscopie électronique a prouvé que cette paroi cellulaire est une structure posée s'échelonnant jusqu'à 300 nanomètre profondément. La couche interne prête la force mécanique et se compose d'â1,2-glycan et de chitine. La couche externe est concernée dans des événements de reconnaissance entre les cellules, et se compose en grande partie de mannoproteins fortement glycosylés. La présence des chaînes latérales d'hydrate de carbone sur ces mannoproteins rendent la paroi cellulaire hydrophile et ont comme conséquence les charges négatives multiples au PH physiologique. Si imagée avec l'AFM, la surface de la cellule semble très lisse, et est facilement déformée, rendant nécessaire la lecture attentive à la force minimale (le Schéma 2). La seule caractéristique technique extérieure apparente est la cicatrice de bourgeon à l'extrême inverse de la cellule de mère à la cellule de descendant neuf de formation. La surface semble lisse comme sucres gênent la membrane.

Le Schéma 2. Représentation du S. cerevisiae. Des cellules de Levure ont été situées utilisant la microscopie de DIC (a) et puis en contact le mode imagé en liquide avec l'AFM (b). Dans (c) une image 3D produite du tunnel de hauteur est affiché, mettant en valeur la cicatrice de bourgeon sur la cellule de mère (la flèche jaune.)

Une des fonctionnalités uniques de l'AFM provient de la nature mécanique du microscope elle-même. L'encorbellement flexible peut être étalonné et ultérieurement utilisé pour prévoir des forces d'interaction. Ceci peut alors être employé pour déterminer la force de l'interaction entre un échantillon et l'encorbellement, et la longueur auquel les éléments extérieurs s'étendra avant que la barrette à l'encorbellement soit rompue.

Ici, nous avons mis l'encorbellement en contact avec un certain nombre de remarques sur la surface de la mère et de la cellule de descendant. Au moins 10 courbures de force-distance ont été obtenues aux remarques multiples pour chaque cellule.

Des courbures de force-distance, des données variées peuvent être extraites. Sur le Schéma 3, seulement un des courbures d'étendre (comme encorbellement approche la surface et la déforme) a été tracé en rouge. Tout l'autre courbe correspondent au retracer, ou à la rétraction de l'encorbellement à partir de la surface. Pendant cette phase de rétraction, si un élément extérieur a lié à l'encorbellement, l'encorbellement braquera vers le bas comme mouvements piézo-électriques la puce retenant l'encorbellement à partir de la surface. Car l'encorbellement guide vers le bas la force appliquée à l'élément extérieur fixé à l'encorbellement augmentera. À la force à laquelle l'obligation entre le biomolécule et l'encorbellement est cassée, l'encorbellement s'enclenchera de nouveau à sa position non-guidée.

Le Schéma 3. courbures de Force-Distance de l'interaction entre l'encorbellement et la surface du descendant (a) ou de la cellule de mère (b). En rouge est la courbure d'étendre, tous les autres sont rétractent des courbures. La force défaisante maximale (f) et la distance de séparation (d) peuvent être prévues à partir de ces données. La flèche bleue indique la région de la courbure qui est indicative de l'étirement élastique des molécules.

La forme de la partie de rétraction des courbures de force-distance peut également indiquer quelque chose au sujet des propriétés matérielles du biomolécule joint. Dans ce cas la forme de la courbure prouve que les éléments extérieurs fixés à l'encorbellement déforment élastique, avant que l'interaction avec l'encorbellement soit cassée. Supplémentaire, de ceci retracez la courbure une peut déterminer la force requise pour briser l'obligation et la distance de la séparation de la surface sur laquelle cette interruption en esclavage se produit.

Il y a de variabilité entre les courbures de force-distance obtenues sur la même cellule, étant donné que non chaque interaction entre l'encorbellement et la surface de cellules aura comme conséquence la connexion d'un biomolécule à l'encorbellement, l'encorbellement ne fixera pas toujours à l'extrémité d'une molécule et la composition extérieure est par nature hétérogène. Il est pour cette raison important de saisir un numéro suffisant des courbures de force-distance de sorte que les données puissent effectivement être soumises à l'analyse statistique. Ici, plus de 100 courbures de force ont été mesurés sur chaque cellule, et la force, le F, et la distance défaisants maximaux de séparation à la rupture, D, ont été prévus et sont présentés sur le Schéma 4 comme histogramme. Les valeurs F et D ont été seulement prévues quand une interaction entre une molécule extérieure et l'encorbellement a été trouvée.

Le Schéma 4. Histogrammes de l'extension distancent D (a) et force défaisante maximale F (b) pour les cellules de mère et de descendant.

Dans le cas de la distance à la rupture, l'histogramme des valeurs prouve que pour les deux cellules les données sont normalement distribuées jusqu'à 400 nanomètre (Figue 4A), et alors pour les deux cellules il y a quelques plus grands massifs détachés. Afin de comparer les deux ensembles de données les massifs détachés au-dessus de 400 nanomètre ont été négligés. Dans ces contraintes, pour la cellule de mère D = 139 ± 56 nanomètre, et pour la cellule de descendant D = 86 ± 43 nanomètre. Ces valeurs ont été déterminées pour être sensiblement différentes, utilisant un T-Test à deux queues d'élève.

Les données la force défaisante maximale prouvent que, en moyenne, la force défaisante pour la cellule de mère est plus élevée que celle de la cellule de descendant (mère, F = 352 NA : descendant, F = 167 NA). Cependant, dans ce cas, il y a une distribution beaucoup plus grande des forces défaisantes et dans les deux cas, il y avait un certain nombre de courbures de force-distance où il n'y avait aucun fléchissement de l'encorbellement, c.-à-d. aucun grippement des molécules extérieures à l'encorbellement (Figure 4B). Ces données suggèrent une différence dans la structure et la composition de la paroi cellulaire entre la mère et la cellule de descendant.

Bactéries

Car l'AFM est une technique d'imagerie extérieure, il a été employé pour caractériser les structures extérieures à la haute résolution. Quelques bactéries montrent un Tueur, ou la couche extérieure, se composant d'un réseau régulièrement bourré de protéine. L'emballage prête une stabilité structurelle à l'échantillon, Tueurs ainsi d'isolement et cristallins peut être imagé à la haute résolution, différentes sous-unités de protéine d'apparence. La couche intermédiaire hexagonal bourrée des radiodurans de Deinococcus d'archaebacteria (le Schéma 1) est un exemple réputé. Dans des images d'AFM de cette couche de HPI, on peut voir les différentes sous-unités de chaque pore, et que certains de ces pores sont dans une conformation ouverte, alors que d'autres sont fermé.

Tandis Que la plupart des Tueurs de document d'archaebacteria, tensions de laboratoire d'eubacteria ne font pas généralement. Les bactéries de laboratoire les plus utilisées généralement est Eschericia coli, des bacilles gram négatifs. Les Bacilles gram négatifs ont une membrane de plasma, entourée par un espace périplasmique en laquelle il y a une paroi cellulaire rigide mais hautement poreuse de peptidoglycan. Ceci est alors entouré par une membrane externe, de laquelle les lipopolysaccarides de la longueur variable étendent.

Le Schéma 5. images Intermittentes de mode de contact des cellules de DH5a. Hauteur de Synthèse (a) et images de signe d'erreur (b), et une image plus élevée de signe d'erreur d'agrandissement (c) de la surface de la bactérie.

Ici, nous avons des deux tensions imagées d'Escherichia coli, de DH5a et d'OP50. Les images de DH5a affichent le classique, tige-forme de beaucoup de bacilles gram négatifs. Les cellules ont été balayées en air (le Schéma 5) et dans tampon (le Schéma 6). Si imagée en air, la surface des bactéries semble fortement modelée. De plus, un halo autour de la bactérie est apparent. Ces structures correspondent vraisemblablement au pili, qui sont trouvées sur la surface d'Escherichia coli. En revanche, si imagé en liquide (le Schéma 6) la surface de la bactérie semble beaucoup plus lisse. Dans ce cas c'est dû au fait que les structures extérieures seraient facilement déplacées par le mouvement de l'extrémité pendant la lecture, car elles ne sont pas fixées en place.

Le Schéma 6. images Intermittentes de mode de contact de DH5a en liquide. Une image 3D produite des données topographiques (a) et une image plus élevée de signe d'erreur d'agrandissement (b) sont affichées.

La tension OP50, alors qu'aussi Escherichia coli, semble très différente. OP50 a été initialement isolé comme tension qui pourrait être employée pour alimenter le Caenorhabditis elegans. C'est un uracile exigeant la tension qui est plus fragile et plus petite que d'autres tensions d'Escherichia coli. Si imagé en air (le Schéma 7) ces bactéries ne montrent pas la même surface structurée que vue pour le DH5a. De plus, les cellules sont plus fragiles et doivent être soigneusement imagées pour éviter de les retirer de la surface. En liquide, la surface moins est également structurée que celle de DH5a, et des régions de la surface de cellules sont déplacées dans la direction du balayage, correspondant vraisemblablement au déplacement des sucres et d'autres structures flexibles sur la surface de la cellule.

Le Schéma 7. Images des bactéries OP50 imagées en air (Un-Topographie, signe de Berror) et liquide (topographie de C, signe d'erreur de D).

L'encorbellement peut également être utilisé pour sonder des interactions avec des sucres sur la surface des bactéries (comme affiché pour ci-dessus cerevisiae de S.). Cependant, ici nous avons fixé les bactéries à l'encorbellement (utilisant la poly-L-lysine) et avons mesuré l'interaction entre les bactéries et la surface de mica (le Schéma 8). Une Telle technique est seule parce qu'elle permet la quantification des interactions de bactérien-surface, critique pour des études de biofouling dans des processus industriels. L'utilisation du JPK Biocell™ comme support témoin permet à l'ajout in situ des composés de bloquer ces interactions.

Le Schéma 8. curvers Représentatifs de force-distance de l'interaction entre DH5a lié par en porte-à-faux et une surface de mica, dans le tampon. Une courbure d'étendre est présentée en rouge, toutes les courbures bleues sont des courbures de rétraction. L'Augmentation de la force appliquée n'a pas augmenté la force défaisante maximale. Les Flèches indiquent différents événements défaisants.

Des courbures Représentatives de force-distance des interactions de DH5á-mica sont présentées sur le Schéma 8. En comparaison de l'interaction de l'encorbellement avec la surface cerevisiae de S., là n'est aucune déformation élastique de l'échantillon. Un certain nombre d'événements défaisants discrets peuvent être vus, vraisemblablement correspondant à défaire de différents éléments extérieurs. De Nouveau, des courbures une de distance de force peut mesurer la force maximum requise pour séparer les bactéries de la surface, toutefois on peut également commencer à vérifier différents événements défaisants.

Virus

Les Virus sont obligent les parasites intracellulaires composés de matériel génétique environnant de couche externe de protéine qui se compose de l'ADN ou de l'ARN. Ce matériel génétique ne contient pas toute l'information exigée pour la réplication, au lieu de cela le virus doit renverser les machines cellulaires de la cellule hôte pour propager. Les Virus sont extrêmement petits, environ 20 nanomètre à 400 nanomètre. Ceci signifie que la caractérisation de la structure virale exige des techniques d'imagerie de haute résolution, telles que la microscopie atomique de force. Ici nous avons le virus de mosaïque du tabac imagé (TMV), le premier virus imagé utilisant la microscopie électronique.

Le Schéma 9. images Intermittentes de mode de contact des particules de TMV. La Topographie (a), la phase (b) et les images de signe d'erreur (c) de la même région d'échantillon sont présentées.

Les particules de TMV étaient adsorbées au mica et imagées utilisant le mode de contact intermittent. Ces particules de virus sont connues en tant que capsids hélicoïdaux, où les piles de protéine de couche dans une configuration hélicoïdale autour du matériel génétique. Cet empilement hélicoïdal peut être vu dans les tunnels de signe de hauteur, de phase et d'erreur (le Schéma 9). Un avantage important d'utiliser un BioAFM, tel que le JPK Nanowizard®, aux échantillons biologiques d'image, est que la représentation peut être conduite en liquide. En soi, les particules de virus peuvent être imagées sur la surface de leurs cellules cibles, en liquide. Ici, nous avons le virus de la grippe imagé fixé à la surface des hématies, en liquide, utilisant le mode de contact intermittent. Les particules de virus sont de manière dégagée imagées sur la surface des cellules.

Le Schéma 10. particules de Virus de la grippe associées avec la surface d'un globule rouge. L'image de synthèse (a) et une image plus élevée d'agrandissement (b) de la surface d'hématie affichent des particules de virus de la grippe (la flèche blanche)

Conclusions

Le bioAFM de Nanowizard® approprié parfaitement à l'étude des micros-organismes. Le JPK Biocell fournit des conditions physiologiques sans sacrifier la stabilité d'AFM ou la qualité optique. La stabilité du microscope active la représentation de différentes sous-unités de protéine, et l'intégration complète dans un photomicroscope inversé permet à une combinaison des techniques de microscopie d'être conduite simultanément. Non seulement cette plate-forme permet-elle des images de haute résolution des échantillons microbiens, elle peut être employée pour mesurer des forces d'interaction entre les organismes et une surface ou entre les molécules en porte-à-faux et surface-associées.

Remerciements

Merci beaucoup à M. Jeffrey Stear, Max Planck Institute pour la Biologie Cellulaire Moléculaire et la Génétique, des échantillons cerevisiae d'Escherichia coli et de S. TMV a été fourni avec bonté par M. Michael Laue de l'Institut de Robert Koch. Les images de HPI ont été fournies avec bonté par M. Patrick Frederix, Université de Bâle.

Source : Instruments de JPK

Pour plus d'informations sur cette source visitez s'il vous plaît les Instruments de JPK

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:56

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