BioAFM di NanoWizard Adatto Perfettamente per lo Studio dei Microrganismi dagli Strumenti di JPK

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Introduzione
Nanotecnologia per Microbiologia
Lievito
Batteri
Virus
Conclusioni
Ringraziamenti

Introduzione

Il termine “microbiologia„ descrive generalmente lo studio su quegli organismi invisibili all'occhio umano, in particolare lievito, batteri e virus. Tuttavia, questi tre tipi di organismi sono significativamente differenti l'uno dall'altro. Il Lievito ed i batteri sono tipi differenti delle cellule (eucariotico e prokaryotic rispettivamente), mentre un virus non è rigorosamente un organismo vivente, che sono stato un parassita intracellulare dell'obbligazione. Gli strumenti per condurre la ricerca in microbiologia possono essere separati in una microscopia principale di due campi, che è richiesta per visualizzazione e la biologia molecolare, che è stata usata per caratterizzare (in alcuni casi completamente) il genetico e proteomic compone di questi organismi.

Nanotecnologia per Microbiologia

I passi iniziali nell'apertura del campo di microbiologia sono venuto con l'arrivo dei primi microscopi. I Batteri in primo luogo sono stati visualizzati da Antony van Leeuwenhoek, facendo uso di un microscopio semplice e auto costruito, verso il 1676. I microscopi costruiti da Leeuwenhoek non erano microscopi composti, contanti invece su un singolo lense, più simile ad una lente d'ingrandimento molto potente. Una delle sue prime descrizioni dei batteri (citati come microbi) proveniva dai campioni raschiati dai denti di van Leeuwenhoek egli stesso.

Mentre il lievito è stato utilizzato nella fermentazione e fare lievitare il pane per intorno 5000 anni, era nel 1860 che Louis Pasteur in primo luogo ha descritto il lievito, Saccharomyces cerevisiae come il effecter di questi trattamenti. Louis Pasteur ha dato molti contributi significativi al campo di microbiologia nel corso degli anni, dalla descrizione dello S. cerevisiae, ai suoi esperimenti eleganti per confutare la teoria della generazione spontanea e del suo ruolo fondamentale nella teoria di germe della malattia e dello sviluppo del vaccino iniziale. Infatti, uno dei successi di Pasteur nel campo di sviluppo del vaccino era di attenuare il virus della rabbia attraverso il riscaldamento per l'iniezione come vaccino, malgrado non potere visualizzare il virus stesso nel tessuto commovente.

Gli Avanzamenti fatti nella microscopia leggera dal lavoro combinato delle Abbe di Ernst e da Carl Zeiss nei 1880s più ulteriormente hanno esteso la ricerca del mondo microbiologico. Tuttavia, come Abbe egli stesso descritte, c'è un limite alla risoluzione di microscopia leggera, dipendente dalla lunghezza d'onda dell'indicatore luminoso illuminante e dall'apertura diaframma numerica della lente. In realtà, la risoluzione di microscopia leggera è limitata alla metà della lunghezza d'onda di indicatore luminoso, o ad intorno 250 nanometro. Come tale, lo studio sulla struttura dei virus ha dovuto aspettare l'arrivo del microscopio elettronico nel 1931 da Ernst Ruska e la cristallizzazione successiva del virus del mosaico del tabacco nel 1935 da Wendall Stanley.

Più recentemente, il microscopio atomico della forza ha aperto un nuovo percorso per la ricerca e la manipolazione delle strutture molto su una piccola scala. Uno dei vantaggi il più spesso citati del AFM nello studio sulle strutture biologiche è il fatto che, a differenza di microscopia elettronica, le immagini di alta risoluzione possono essere ottenute nelle circostanze fisiologiche. Tuttavia, ci sono più al AFM che appena la sua capacità per la rappresentazione di alta risoluzione. La natura meccanica del AFM significa che la trave a mensola, utilizzata per la rappresentazione, può anche essere utilizzata per misurare le forze di interazione, nell'intervallo del piconewton.

come tale, non solo può l'immagine del AFM la superficie dei microrganismi all'alta risoluzione, nelle circostanze fisiologiche, può anche essere usata per studiare le forze vincolanti fra i microrganismi e le superfici dell'obiettivo.

Il JPK Nanowizard® BioAFM è adatto perfettamente a tali studi. Il Nanowizard® è destinato per lavorare simultaneamente con microscopia leggera e che è installato su un microscopio ottico invertito, permettendo i canali multipli di informazioni siano raccolti e diminuendo il tempo sperimentale permettendo che l'utente identifichi la posizione delle celle di interesse otticamente, prima della scansione della regione particolare con il AFM. Il supporto specialmente progettato del campione, il JPK BioCell™, facilita gli esperimenti alle temperature fra 15-60°C sulle lamelle di vetro sottili, tali che la qualità delle immagini ottiche in non diminuito in. Inoltre, il JPK Nanowizard® esibisce la stabilità superiore, permettendo la rappresentazione di alta risoluzione delle componenti delle cellule, quali gli strati superficiali batterici (Figura 1) come pure rappresentazione fisiologica di intere celle, dai prokaryotes agli eucarioti.

Figura 1. livello dai radiodurans di Deinococcus, immagine di HPI fornita gentilmente da Dott. Patrick Frederix, Università di Basilea.

Lievito

I cerevisae del lievito S., conosciuti anche come lievito germogliante, è utili non solo nei processi industriali da panificazione a fare della birra, è egualmente un tipo organismo nello studio sulle celle eucariotiche. Poichè lo S. cerevisiae è capace della crescita aploide o diploide ed è un organismo unicellulare con un tempo di raddoppiamento di una coppia di ore, ha provato ben adattato allo studio sul funzionamento di base delle celle eucariotiche.

Il lievito S. cerevisiae è circondato da una parete cellulare composta di proteine, di polisaccaridi e di piccole quantità di chitina. La microscopia elettronica ha indicato che questa parete cellulare è una struttura stratificata che varia densamente fino a 300 nanometro. Il livello interno presta la concentrazione meccanica ed è composto di â1,2-glycan e di chitina. Il livello esterno è compreso negli eventi del riconoscimento fra le celle e principalmente è composto di mannoproteins molto glicosilati. La presenza delle catene laterali del carboidrato su questi mannoproteins rende la parete cellulare idrofila e provoca le cariche negative multiple a pH fisiologico. Una Volta imaged con il AFM, la superficie della cella sembra molto regolare e facilmente è deformata, necessitante lo scansione attento alla forza minima (Figura 2). La sola funzionalità della superficie apparente è la cicatrice del germoglio all'estremo opposto della cella di madre alla cellula figlia recentemente di formazione. La superficie sembra regolare come gli zuccheri oscura la membrana.

Figura 2. Rappresentazione dello S. cerevisiae. Le celle di Lievito sono state situate facendo uso di microscopia di DIC (A) e poi imaged nel modo di contatto in liquido con il AFM (B). In (C) un'immagine 3D generata dal canale di altezza video, evidenziante la cicatrice del germoglio sulla cella di madre (freccia gialla.)

Una delle funzionalità uniche del AFM proviene dalla natura meccanica del microscopio stessa. La trave a mensola flessibile può essere calibrata e successivamente essere utilizzata per calcolare le forze di interazione. Ciò può poi essere usata per determinare sia la forza di interazione fra un campione che la trave a mensola e la lunghezza a cui elementi di superficie allungherà prima che il collegamento alla trave a mensola sia rotto.

Qui, abbiamo messo la trave a mensola in contatto con una serie di punti sulla superficie sia della madre che della cellula figlia. Almeno 10 curve di forza-distanza sono state ottenute ai punti multipli per ogni cella.

Dalle curve di forza-distanza, i vari dati possono essere estratti. Nella Figura 3, soltanto una delle curve dell'estensione (come la trave a mensola si avvicina alla superficie e deforma) è stata tracciata nel rosso. L'altro curva tutto corrisponde alla ricostruzione, o alla ritrazione della trave a mensola a partire dalla superficie. Durante questa fase di ritrazione, se un elemento di superficie ha limitato alla trave a mensola, la trave a mensola devierà verso il basso come i movimenti piezo-elettrici il chip che tiene la trave a mensola a partire dalla superficie. Poichè la trave a mensola devia verso il basso la forza applicata all'elemento di superficie fissato alla trave a mensola aumenterà. Alla forza a cui l'obbligazione fra la biomolecola e la trave a mensola è rotta, la trave a mensola si romperà di nuovo alla sua posizione non deviata.

Figura 3. curve di Forza-Distanza dell'interazione fra la trave a mensola e la superficie del derivato (A) o della cella di madre (B). Nel rosso è la curva dell'estensione, tutti gli altre è ritira le curve. La forza sciogliente massima (F) e distanza di separazione (D) può essere calcolato da questi dati. La freccia blu indica la regione della curva che è indicativa di allungamento elastico delle molecole.

La forma della sezione di ritiro delle curve di forza-distanza può anche indicare qualcosa circa i beni materiali della biomolecola fissata. In questo caso la forma della curva indica che gli elementi di superficie fissati alla trave a mensola deformano elastico, prima che l'interazione con la trave a mensola sia rotta. Ulteriormente, da questo ritracci la curva una può determinare la forza richiesta per rompere l'obbligazione e la distanza della separazione dalla superficie a cui questa rottura schiava si presenta.

C'è la variabilità fra le curve di forza-distanza ottenute sulla stessa cella, data che non ogni interazione fra la trave a mensola e la superficie delle cellule provocherà il collegamento di una biomolecola alla trave a mensola, la trave a mensola sempre non fisserà all'estremità di una molecola e la composizione di superficie è inerentemente eterogenea. È quindi importante acquistare un numero sufficiente delle curve di forza-distanza in moda da potere efficacemente sottoporre i dati all'analisi statistica. Qui, oltre 100 curve della forza sono stati misurati su ogni cella e la forza, la F e la distanza scioglienti massime alla rottura, D della separazione, sono state calcolate e sono presentate nella Figura 4 come istogramma. I valori F e D sono stati calcolati soltanto quando un'interazione fra una molecola di superficie e la trave a mensola è stata individuata.

La Figura 4. Istogrammi dell'estensione distanzia la D (A) e la forza sciogliente massima F (B) per la madre e le cellule figlie.

Nel caso della distanza alla rottura, l'istogramma dei valori indica che per entrambe celle i dati si distribuiscono normalmente fino a 400 il nanometro (Fico 4A) e poi per entrambe le celle ci sono alcuni più grandi valori erratici. Per confrontare i due insiemi di dati i valori erratici superiore a 400 nanometro sono stati non presi in considerazione. All'interno di questi vincoli, per la cella di madre D = 139 ± 56 nanometro e per la cellula figlia D = 86 ± 43 nanometro. Questi valori sono stati determinati per essere significativamente differenti, facendo uso di una T-Prova a due code dello studente.

I dati per la forza sciogliente massima indicano che, in media, la forza sciogliente per la cella di madre è superiore a quella della cellula figlia (madre, F = 352 PN: figlia, F = 167 PN). Tuttavia, in questo caso, c'è una distribuzione molto più vasta delle forze scioglienti ed in entrambi i casi, c'erano una serie di curve di forza-distanza in cui non c'era deformazione della trave a mensola, cioè nessun'associazione delle molecole di superficie alla trave a mensola (Figura 4B). Questi dati suggeriscono una differenza nella struttura e nella composizione della parete cellulare fra la madre e la cellula figlia.

Batteri

Poichè il AFM è una tecnica di rappresentazione di superficie, è stato usato per caratterizzare le strutture di superficie all'alta risoluzione. Alcuni batteri esibiscono un S-Livello, o lo strato superficiale, consistente di una grata regolarmente imballata di proteina. L'imballaggio presta una stabilità strutturale al campione, Assassini così isolati e cristallini può essere imaged all'alta risoluzione, diversi sottounità della proteina di rappresentazione. Il livello intermedio esagonale imballato dai radiodurans di Deinococcus di archaebacteria (Figura 1) è un esempio ben noto. Nelle immagini del AFM di questo livello di HPI, uno può vedere i diversi sottounità di ogni poro e che alcuni di questi pori sono in una conformazione aperta, mentre altri è chiuso.

Mentre la maggior parte dei S-Livelli della mostra di archaebacteria, sforzi del laboratorio di eubacteria non fanno generalmente. I batteri del laboratorio più comunemente usati è Eschericia coli, batteri gram-negativi. I batteri Gram-negativi hanno una membrana di plasma, circondata da uno spazio periplasmico in cui c'è una parete cellulare rigida ma altamente porosa di peptidoglycan. Ciò poi è circondata da una membrana esterna, da cui i lipopolysaccarides della lunghezza variante estendono.

Figura 5. immagini Intermittenti di modo di contatto di celle di DH5a. Altezza di Generalità (A) e segnale di errore (B) immagini e un'più alta immagine del segnale di errore di ingrandimento (C) della superficie del batterio.

Qui, abbiamo due sforzi imaged di Escherichia coli, di DH5a e di OP50. Le immagini di DH5a mostrano il classico, bastoncino-forma di molti batteri gram-negativi. Le celle sono state scandite in aria (Figura 5) ed in buffer (Figura 6). Una Volta imaged in aria, la superficie dei batteri sembra altamente modellata. Inoltre, un alone intorno al batterio è evidente. Queste strutture probabilmente corrispondono al pili, che sono trovate alla superficie di Escherichia coli. Al contrario, una volta imaged in liquido (Figura 6) la superficie del batterio sembra molto più regolare. In questo caso questo è dovuto il fatto che le strutture di superficie sarebbero spostate facilmente tramite il movimento del suggerimento durante lo scansione, poichè non sono fissate sul posto.

Figura 6. immagini Intermittenti di modo di contatto di DH5a in liquido. Un'immagine 3D generata dai dati topografici (A) e un'più alta immagine del segnale di errore di ingrandimento (B) video.

Lo sforzo OP50, mentre però Escherichia coli, sembra abbastanza differente. OP50 originalmente è stato isolato come sforzo che potrebbe essere usato per alimentare i elegans di Caenorhabditis. È un uracile che richiede lo sforzo che è più fragile e più piccolo di altri sforzi di Escherichia coli. Una Volta imaged in aria (Figura 7) questi batteri non esibisce la stessa superficie strutturata del veduta di per il DH5a. Inoltre, le celle sono più fragili e devono essere con attenzione imaged evitare rimuoverli dalla superficie. In liquido, la superficie egualmente più di meno è strutturata che quella di DH5a e le regioni della superficie delle cellule sono spostate nella direzione di scansione, probabilmente corrispondente allo spostamento degli zuccheri e di altre strutture flessibili alla superficie della cella.

Figura 7. Immagini dei batteri OP50 imaged in aria (Un-Topografia, segnale di Berror) e liquido (topografia di C, segnale di errore di D).

La trave a mensola può anche essere utilizzata per sondare le interazioni con gli zuccheri alla superficie dei batteri (come indicato per di cui sopra cerevisiae dello S.). Tuttavia, qui abbiamo fissato i batteri alla trave a mensola (facendo uso di poli-L-lisina) ed abbiamo misurato l'interazione fra i batteri e la superficie della mica (Figura 8). Una Tal tecnica è unica in quanto permette la quantificazione delle interazioni della batterico-superficie, critico per gli studi su biofouling nei processi industriali. L'uso del JPK Biocell™ come supporto del campione permette che l'aggiunta in situ dei composti blocchi queste interazioni.

Figura 8. curvers Rappresentativi di forza-distanza dell'interazione fra a DH5a diretto a a mensola e una superficie della mica, in buffer. Una curva dell'estensione è presentata nel rosso, tutte le curve blu è curve di ritrazione. L'Aumento della forza applicata non ha aumentato la forza sciogliente massima. Le Frecce indicano i diversi eventi scioglienti.

Le curve Rappresentative di forza-distanza delle interazioni di DH5á-mica sono presentate nella Figura 8. In confronto all'interazione della trave a mensola con la superficie cerevisiae dello S., là non è deformazione elastica del campione. Una serie di eventi scioglienti discreti possono essere veduti, probabilmente corrispondendo a sciogliere di diversi elementi di superficie. Di Nuovo, dalle curve una di distanza della forza può quantificare la forza massima richiesta per separare i batteri dalla superficie, comunque una può anche cominciare studiare i diversi eventi scioglienti.

Virus

I Virus sono obbligano i parassiti intracellulari composti di materiale genetico circostante del cappotto esterno della proteina che consiste del DNA o del RNA. Questo materiale genetico non contiene tutte le informazioni richieste per la replica, invece il virus deve sovvertire il macchinario cellulare della cellula ospite per propagarsi. I Virus sono estremamente piccoli, intorno 20 nanometro a 400 nanometro. Ciò significa che la caratterizzazione della struttura virale richiede le tecniche di rappresentazione di alta risoluzione, quale microscopia atomica della forza. Qui abbiamo virus del mosaico del tabacco imaged (TMV), il primo virus imaged facendo uso di microscopia elettronica.

Figura 9. immagini Intermittenti di modo di contatto di particelle di TMV. Topografia (A), fase (B) ed immagini del segnale di errore (C) della stessa regione del campione sono presentati.

Le particelle di TMV sono state adsorbite a mica ed imaged facendo uso del modo di contatto intermittente. Queste particelle del virus sono conosciute come capsids elicoidali, in cui le pile della proteina del cappotto in un reticolo elicoidale intorno al materiale genetico. Questo impilamento elicoidale può essere veduto nei canali di segnale di altezza, di fase e di errore (Figura 9). Un vantaggio significativo di usando un BioAFM, quale il JPK Nanowizard®, ai campioni biologici di immagine, è che la rappresentazione può essere condotta in liquido. Come tale, le particelle del virus possono essere imaged sulla superficie delle loro cellule bersaglio, in liquido. Qui, abbiamo virus dell'influenza imaged fissato alla superficie dei globuli rossi, in liquido, facendo uso del modo di contatto intermittente. Le particelle del virus sono chiaramente imaged alla superficie delle celle.

Figura 10. particelle del Virus dell'influenza connesse con la superficie di un eritrocito. L'immagine di generalità (A) e più alta immagine di ingrandimento (B) delle particelle del virus dell'influenza di manifestazione della superficie del globulo rosso (freccia bianca)

Conclusioni

Il bioAFM di Nanowizard® è adatto perfettamente per lo studio dei microrganismi. Il JPK Biocell fornisce le circostanze fisiologiche senza sacrificare la stabilità del AFM o la qualità ottica. La stabilità del microscopio permette alla rappresentazione di diversi sottounità della proteina e l'integrazione completa in un microscopio ottico invertito permette ad una combinazione di tecniche di microscopia di essere condotta simultaneamente. Non solo questa piattaforma permette le immagini di alta risoluzione dei campioni microbici, può essere usata per quantificare le forze di interazione fra gli organismi e una superficie o fra le molecole a mensola e superficie-associate.

Ringraziamenti

Molte grazie a Dott. Jeffrey Stear, Max Planck Institute per Biologia Cellulare e la Genetica Molecolari, per i campioni cerevisiae dello S. e di Escherichia coli. TMV è stato fornito gentilmente dal Dott. Michael Laue dall'Istituto di Robert Koch. Le immagini di HPI sono state fornite gentilmente dal Dott. Patrick Frederix, Università di Basilea.

Sorgente: Strumenti di JPK

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego gli Strumenti di JPK

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:03

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