完全に JPK の器械によって微生物を調査するために適する NanoWizard の bioAFM

カバーされるトピック

導入
微生物学のためのナノテクノロジー
イースト
細菌
ウイルス
結論
確認応答

導入

ターム 「微生物学」は一般に人間の目、特にイースト、細菌およびウイルスに見えないそれらの有機体の調査を記述します。 ただし、この 3 つのタイプの有機体は互いと著しく異なります。 ウイルスが厳しく生きている有機体ではない一方イーストおよび細菌は義務づけの細胞内の寄生虫である異なったセルタイプ (eukaryotic および prokaryotic それぞれ) です。 微生物学の研究を行なうツールは 2 つの視覚化に必要となる、 (場合によっては包括的に) 遺伝および proteomic 特徴付けるのに使用されていた分子生物学、これらの有機体より構成します主要なフィールド顕微鏡検査に分けることができ。

微生物学のためのナノテクノロジー

微生物学のフィールドの開始の第一歩は最初の顕微鏡の出現で来ました。 細菌は簡単な、自己製の顕微鏡、およそ 1676 を使用してアントニー van Leeuwenhoek によって最初に、視覚化されました。 Leeuwenhoek によって構築された顕微鏡は単一の lense に代りに頼る混合顕微鏡非常に強力な拡大鏡のような多くではなかったです。 細菌の彼の最初記述の 1 つは (animalcules と言われる) van Leeuwenhoek の彼自身歯から擦れたサンプルからありました。

イーストは発酵でおよびおよそ 5000 年間パンを発酵させるために使用される間、ルイ・パスツールが最初にイーストを記述したこと 1860 型の、これらのプロセスの effecter として Saccharomyces Cerevisiae にでした。 ルイ・パスツールは彼の優雅な実験に、 cerevisiae S. の記述から病気および早いワクチン開発の細菌理論に於いての自然発生そして彼の基本的な役割の理論を反証するために微生物学のフィールドへの多くの重要な貢献を、長年かけて作りました。 実際は、ワクチン開発のフィールドの Pasteur の成功の 1 つは影響を受けたティッシュのウイルス自体を視覚化できないことにもかかわらずワクチンとして注入のための暖房を通して狂犬病ウイルスを、減少させることでした。

1880 年代のエルンストの聖職者およびカールツァイスの結合された作業によって光学顕微鏡検査でなされた進歩は更に微生物学的な世界の研究を拡張しました。 ただし、ように記述されている聖職者彼自身レンズの明快なライトそして開口数の波長に依存した光学顕微鏡検査の解像度へ限界があります。 実際には、光学顕微鏡検査の解像度はライトの波長半分、かおよそ 250 nm に限定されます。 したがって、ウイルスの構造の調査は Wendall スタンリーによってエルンスト Ruska および 1935 年にタバコモザイク病ウイルスのそれに続く結晶化によって 1931 年に電子顕微鏡の出現を待たなければなりませんでした。

もっと最近、原子力の顕微鏡は非常に小規模の構造の調査そして処理のための新しい経路を開きました。 生物的構造の調査の AFM の最も頻繁に引用された利点の 1 つは、電子顕微鏡検査とは違って、高リゾリューションの画像が生理学的な条件の下で得ることができるという事実です。 ただし、高リゾリューションイメージ投射のためのちょうど容量より AFM へ多くがあります。 AFM の機械性質はイメージ投射に使用する相互作用力を測定するのに片持梁がまた使用することができることを意味します piconewton の範囲で。

それ自体、しか AFM の画像はまた、生理学的な条件の下で、高リゾリューションで微生物の表面それ使用することができます微生物とターゲット表面間の拘束力を調査するのにできません。

JPK Nanowizard® BioAFM はそのような調査に完全に適します。 Nanowizard® は光学顕微鏡検査を同時に使用するように設計され逆にされた光学顕微鏡でインストールされていて、ユーザーの AFM との特定領域をスキャンする前に興味のセルの位置を、光学的に識別することを許可によって集められてし、実験時間を情報のマルチチャネルが減らします。 特に設計されていたサンプルホールダー、 JPK BioCell™は薄いガラス coverslips の 15-60°C、そのような物間の温度で、実験をこと減らされないの光学画像の品質促進します。 さらに、 JPK Nanowizard® は優秀な安定性を表わしま、細菌の表面層 (図 1)、また prokaryotes からの真核生物のようなセルコンポーネントの高リゾリューションイメージ投射を、への全セルの生理学的なイメージ投射、許可します。

Deinococcus の radiodurans からの図 1. HPI の層、親切に先生がパトリック Frederix のバーゼルの大学提供する画像。

イースト

発芽のイーストとしてまた知られているイースト S. cerevisae はまたパン作りからのビール、それの醸造に工業プロセスの使用だけです eukaryotic セルの調査のタイプ有機体です。 cerevisiae S. は単相か diploid 成長が可能で、幾つかの時間のダブルタイムの単一セルの有機体であるので、 eukaryotic セルの基本的な作用の調査にうってつけを証明しました。

cerevisiae イースト S. はキチンの蛋白質、多糖類および少量で構成される細胞壁によって囲まれます。 電子顕微鏡検査はこの細胞壁が厚く及ぶ層状構造 300 まで nm であることを示しました。 内部の層は機械強さを貸し、 â1,2-glycan およびキチンで構成されます。 外の層はセル間の認識のイベントにかかわり、重く glycosylated mannoproteins で大抵構成されます。 これらの mannoproteins の炭水化物の側鎖の存在は細胞壁を親水性にし、多重負電荷で生理学的な PH. で起因します。 AFM と視覚化されたとき、最小力 (図 2) の注意深いスキャンを要するセルの表面は非常にスムーズなようで、容易に変形します。 唯一の明白な表面機能は最近形成娘細胞へ母細胞の反対側に芽の傷です。 表面は砂糖としてスムーズな覆います膜をようです。

cerevisiae S. の図 2. イメージ投射。 次にイースト菌は AFM (b) が付いている液体の接触モードに DIC の顕微鏡検査 (a) を使用して視覚化されたあり。 (c) 高さチャネルから生成される 3D 画像では表示され、強調します母細胞 (黄色い矢。) の芽の傷を

AFM の一義的な機能の 1 つは顕微鏡の機械性質自体から生じます。 適用範囲が広い片持梁は相互作用力を計算するために目盛りが付き、続いて使用することができます。 これがサンプルと片持梁へのリンクが破裂する前におよび長さが表面要素伸びる片持梁間の相互作用の力を両方定めるのにそれから使用することができます。

ここでは、私達は母および娘細胞両方の表面のいくつかのポイントが付いている接触に片持梁を持って来ました。 少なくとも 10 の力間隔のカーブは各セルのための複数のポイントで得られました。

力間隔のカーブから、さまざまなデータは得ることができます。 図 3 では、延長カーブの 1 つだけは赤で (片持梁として表面に近づき、変形します) 計画されました。 他は表面からの片持梁の再トレース、か引き込みにすべてを対応します曲げます。 この引き込み段階の間に、表面要素が片持梁に区切たら、片持梁は piezo 移動として片持梁を表面から離れた保持するチップを下方に逸らします。 片持梁が下方に逸れるので片持梁に接続した表面要素に加えられた力は増加します。 生体物質と片持梁間の結束が壊れている力で、片持梁は非逸らされた位置に戻って止まります。

図 3. 娘 (a) または母細胞 (b) の片持梁と表面間の相互作用の力間隔のカーブ。 赤では延長カーブは、他あります引き込めますカーブをあります。 極大アンバインド力 (f) および分離の間隔 (d) はこのデータから計算することができます。 青い矢は分子の伸縮性がある伸張を表しているカーブの領域を明記します。

力間隔のカーブの引き込めセクションの形はまた接続された生体物質の物質的な特性についての何かを明記できます。 この場合カーブの形は片持梁との相互作用が壊れている前に片持梁に接続する表面要素が弾力的に変形することを示します。 さらに、これからカーブ 1 をこのとらわれの中断が行われる表面からの分離の結束そして間隔を壊すために必要な力を定めることができます再トレースして下さい。

分子の端に片持梁とセル表面間のあらゆる相互作用が片持梁に生体物質の接続機構で起因しないという事実による同じセルで得られる力間隔のカーブ間に可変性が、片持梁常に接続しませんあり、表面の構成は本来異質です。 従ってデータが統計分析に効果的に服従させることができるように力間隔のカーブの十分な番号を得ることは重要です。 ここでは、 100 つの力のカーブに各セルで測定され、破裂の極大アンバインド力、 F および分離の間隔、 D はヒストグラムとして図 4 で、計算され、示されます。 表面の分子と片持梁間の相互作用が検出されたときにだけ値 F および D は計算されました。

拡張の図 4. ヒストグラムは D (a) および (b) 母および娘細胞のための極大アンバインド力 F を遠のけます。

破裂への間隔の場合には、値のヒストグラムは両方のセルのためにデータが普通 400 まで nm (図 4A) 配られる、およびそれから両方のセルのためあるより大きい飛び地ですことを示します。 2 つのデータセットを比較するためには 400 nm の上の飛び地は無視されました。 のためのこれらの抑制の中では、母細胞のための D = 139 ± 56 nm、そして娘細胞 D = 86 ± 43 nm。 これらの値は両側学生 T テストを使用して著しく異なる、ために定められました。

極大アンバインド力のデータは、平均すると、母細胞のためのアンバインド力が娘細胞 (母、 F = 352 pN のそれより高いことを示します: 娘、 F = 167 pN)。 ただし、この場合、アンバインド力の大いにより広い分布があり、いずれの場合も、片持梁の偏向のいくつかの力間隔のカーブは片持梁 (図 4B) へ、表面の分子のすなわち結合ありませんでした。 これらのデータは母と娘細胞間の細胞壁の構造そして構成の相違を提案します。

細菌

AFM は表面の映像技術であるので高リゾリューションで表面の構造を特徴付けることを、使用しました。 ある細菌は殺害者、か蛋白質の規則的に詰められた格子から成っている表面層を表わします。 パッキングはサンプル、そう隔離された、結晶の殺害者に構造安定性を高リゾリューション、提示個々の蛋白質の亜単位で視覚化されます貸します。 archaebacteria の Deinococcus の radiodurans からの六角形に詰められた中間層 (図 1) は有名な例です。 この HPI の層の AFM の画像では、 1 つはこれらの気孔のいくつかが開いた構造にあること、が他閉じる各気孔の個々の亜単位を見。

ほとんどの archaebacteria の展示品の殺害者、 eubacteria の実験室の緊張が一般に間。 最も広く使われた実験室の細菌は Eschericia 大腸菌グラム陰性の細菌です。 グラム陰性の細菌に periplasmic スペースによって peptidoglycan の堅いしかし非常に多孔性の細胞壁がある囲まれる血しょう膜があります。 これはさまざまな長さの lipopolysaccarides が伸びる外の膜によってそれから囲まれます。

図 5. 断続的な DH5a のセルの接触モードの画像。 概要の高さ (a) およびエラーは (b) 細菌の表面の画像およびより高い拡大のエラーシグナルの画像 (c) に信号を送ります。

ここでは、私達にエシェリヒア属大腸菌、 DH5a および OP50 の視覚化された緊張 2 つあります。 DH5a の画像はクラシック、多くのグラム陰性の細菌の棒形を示します。 セルは空気 (バッファ (図 6) ので図 5) およびスキャンされました。 空気で視覚化されたとき、細菌の表面は非常に模造されてようです。 さらに、細菌のまわりのハローは明白です。 エシェリヒア属大腸菌の表面にあるこれらの構造は pili に多分対応します。 それに対して液体で視覚化された場合、 (図 6) は細菌の表面大いによりスムーズなようです。 この場合これは修復されないので、表面の構造がスキャンの間に先端の動きによって容易に転置されるという事実が原因です。

図 6. 断続的な液体の DH5a の接触モードの画像。 地勢データ (a) から生成される 3D 画像およびより高い拡大のエラーシグナルの画像 (b) は表示されます。

OP50 緊張は、がまたエシェリヒア属大腸菌、かなり異なっているようです。 OP50 は Caenorhabditis の elegans を入れるのに使用できる緊張として最初に隔離されました。 それはエシェリヒア属大腸菌の他の緊張よりより壊れやすく、小さい緊張を必要とするウラシルです。 空気で視覚化された場合 (図 7) は DH5a については見られるとこれらの細菌同じ構成された表面を表わしません。 さらに、セルは表面からそれらを除去することを避けるようにより壊れやすく、注意深く視覚化されなければなりません。 液体では、表面はまた DH5a のそれよりより少なく構成され、セル表面の領域はセルの表面の砂糖そして他の適用範囲が広い構造の変位に相当して本当らしいスキャン方向で転置されます。

空気 (地形、 Berror のシグナル) および液体 (C- の地形、 D- のエラーシグナル) で視覚化された OP50 細菌の図 7. 画像。

(S. の cerevisiae 上のために示されている) また片持梁が細菌の表面で砂糖との相互作用を厳密に調べるのに使用することができます。 ただし、ここに私達は片持梁に細菌を (多 L リジンを使用して) 接続し、細菌と雲母の表面 (図 8) 間の相互作用測定しました。 そのような技術は細菌表面の相互作用の定量化を可能にすること一義的、工業プロセスの biofouling の調査のために重大です。 サンプルホールダーとして JPK Biocell™の使用は混合物のそのままの付加がこれらの相互作用を妨げるようにします。

図 8. 代表的なバッファの片持梁行きの DH5a と雲母の表面間の相互作用の力間隔の curvers。 延長カーブは赤で、すべての青いカーブです引き込みのカーブ示されます。 応用力を高めることは極大アンバインド力を高めませんでした。 矢は個々のアンバインドのイベントを明記します。

DH5á 雲母の相互作用の代表的な力間隔のカーブは S. の cerevisiae 表面が付いている片持梁の相互作用と比べて図 8. で、そこにですサンプルの伸縮性がある変形示されません。 いくつかの離散アンバインドのイベントは個々の表面要素のアンバインドに相当して本当らしい見ることができます。 再度 1 がまた個々のアンバインドのイベントを調査し始めることができるどんなに、力の間隔のカーブ 1 から表面から細菌を分けるために必要な最大力の量を示すことができます。

ウイルス

ウイルスは義務づけます DNA か RNA から成っている外蛋白質のコートの周囲の遺伝物質で構成される細胞内の寄生虫をあります。 この遺伝物質は複製に必要なすべての情報を含んでいませんその代りウイルスは伝播するために宿主細胞の細胞機械装置を覆す必要があります。 ウイルスは 400 nm に非常に小さいです、およそ 20 nm。 これはウイルスの構造の性格描写が高リゾリューションの映像技術を必要とすることを、意味します原子力の顕微鏡検査のような。 ここに私達に視覚化されたタバコモザイク病ウイルス、 (TMV)電子顕微鏡検査を使用して視覚化された最初のウイルスがあります。

図 9. 断続的な TMV の粒子の接触モードの画像。 地形 (a)、段階 (b) および同じサンプル領域のエラーシグナルの画像 (c) は示されます。

TMV の粒子は雲母に断続的な接触モードを使用して視覚化された吸着され。 これらのウイルスの粒子が螺旋形の capsids として、遺伝物質のまわりの螺旋形パターンのコート蛋白質スタック知られている。 この螺旋形のスタッキングは高さ、段階およびエラーシグナルチャネル (図 9) で見ることができます。 BioAFM を、 JPK Nanowizard® のような、画像の生物的サンプルへ使用する 1 つの重要な利点は、イメージ投射が液体で行なうことができることです。 したがって、ウイルスの粒子は液体の標的細胞の表面で視覚化されます。 ここでは、私達に、液体で、断続的な接触モードを使用して赤血球の表面に接続する視覚化されたインフルエンザウイルスがあります。 ウイルスの粒子ははっきりセルの表面で視覚化されています。

赤血球の表面と関連付けられる図 10. インフルエンザウイルスの粒子。 概要の画像 (a) および赤血球の表面のより高い拡大の画像 (b) は示しますインフルエンザウイルスの粒子 (白い矢) を

結論

Nanowizard® の bioAFM は微生物の調査に完全に適します。 JPK Biocell は AFM の安定性か光学品質を犠牲にしないで生理学的な条件を提供します。 顕微鏡の安定性は個々の蛋白質の亜単位のイメージ投射を可能にし、逆にされた光学顕微鏡への完全な統合は顕微鏡検査の技術の組合せが同時に行なわれることを可能にします。 このプラットホームは微生物サンプルの高リゾリューションの画像しか可能にしません有機体と表面または片持梁および表面準の分子間の相互作用力の量を示すのに、使用することができます。

確認応答

エシェリヒア属大腸菌および S. の cerevisiae サンプルへの分子細胞生物学および遺伝学への先生のおかげで Jeffrey Stear、 Planck の最大協会多くの。 TMV はロベルト・コッホの協会からの先生によってミハエル Laue 親切に提供されました。 HPI の画像は先生によってパトリック Frederix のバーゼルの大学親切に提供されました。

ソース: JPK の器械

このソースのより多くの情報のために JPK の器械を訪問して下さい

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:06

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