완벽하게 JPK 계기에 의해 미생물 공부를 위해 적응되는 NanoWizard bioAFM

커버되는 토픽

소개
미생물학을 위한 나노 과학
효모
박테리아
바이러스
결론
수신 확인

소개

기간 "미생물학"는 일반적으로 육안, 특히 효모, 박테리아 및 바이러스에 보이지 않는 그 유기체의 연구 결과를 기술합니다. 그러나, 유기체의 이 3가지의 모형은 서로와 현저하게 다릅니다. 바이러스가 엄격히 살아있는 유기체가 아니더라도 반면 효모와 박테리아는 의무를 지우 세포내 기생충인 다른 세포 모형 (진핵과 prokaryotic 각각)입니다. 미생물학에 있는 연구를 하는 공구는 2개 구상을 위해 요구되는 주요 필드 현미경 검사법으로 분리될 수 있습니다, (어떠한 경우에는 포괄적으로) 유전 및 proteomic 성격을 나타내기 위하여 이용된 분자 생물학, 이 유기체의 구성합니다.

미생물학을 위한 나노 과학

미생물학의 필드를 열기에 있는 첫 걸음은 첫번째 현미경의 출현으로 왔습니다. 박테리아는 간단한, 각자 건축된 현미경, 약 1676년을 사용하여 Antony van Leeuwenhoek에 의해 처음으로 구상되었습니다. Leeuwenhoek에 의해 건축된 현미경은 단 하나 lense를 대신 의지하는 합성 현미경이, 아주 강력한 확대경 같이 더 많은 것 아니었습니다. (극미동물로 불리는) 박테리아의 그의 첫번째 묘사 중 하나는 van Leeuwenhoek의 그 자신 이에서 긁힌 견본에서 이었습니다.

효모는 발효작용에서 약 5000 년간 빵을 발효시키는 위하여 이용되는 동안, 1860형의 루이 파스퇴르가 처음으로 기술했다 효모를, 이 프로세스의 effecter로 Saccharomyces Cerevisiae에 이고. 루이 파스퇴르는 그의 우아한 실험에, cerevisiae S.의 묘사에게서 미생물학의 필드에 많은 질병과 초기 백신 발달의 세균 이론에 있는 자연스러운 발생 그리고 그의 기본적인 역할의 이론을 반증하기 위하여 획기적인 공헌을, 수년에 걸쳐 했습니다. 실제로, 백신 발달의 필드에 있는 Pasteur의 성공의 한개는 영향 받은 조직에서 바이러스 자체를 구상할 수 있지 않는에도 불구하고 백신으로 주입을 위한 난방을 통해서 광견병 바이러스를, 약하게 하기 위한 것이었습니다.

1880 년대에 있는 Ernst Abbe와 칼 Zeiss의 결합한 일에 의해 가벼운 현미경 검사법에서 한 전진은 미생물학 세계의 연구를 더 확장했습니다. 그러나, 기술되는 Abbe 그 자신, 렌즈의 illuminating 빛 그리고 수 가늠구멍의 파장에 의존하는 가벼운 현미경 검사법의 해결책에 한계가 있습니다. 사실상, 가벼운 현미경 검사법의 해결책은 빛의 파장 반, 또는 약 250 nm로 제한됩니다. 따라서, 바이러스의 구조물의 연구 결과는 Wendall Stanley 에의한 Ernst Ruska와 1935년에 담배 모자이크 바이러스의 연속적인 결정화 에의한 1931년에 전자 현미경의 출현을 기다려야 했습니다.

최근에, 원자 군대 현미경은 아주 소규모에 구조물의 수사 그리고 조작을 위한 새로운 경로를 열었습니다. 생물학 구조물의 연구 결과에 있는 AFM의 수시로 인용한 이점의 한개는, 전자 현미경 검사법과는 다른, 고해상 심상이 생리적인 조건 하에서 장악될 수 있다 는 사실입니다. 그러나, AFM에 고해상 화상 진찰을 위한 다만 그것의 수용량 보다는 더 많은 것이 있습니다. AFM의 기계적인 본질은 화상 진찰에 사용된 상호 작용 군대를 측정하기 위하여 외팔보가 또한, 사용될 수 있다는 것을, 의미합니다 piconewton 범위에서.

등과 같은, 뿐만 아니라 AFM 심상은 또한, 생리적인 조건 하에서, 고해상에 미생물의 표면 그것 미생물과 표적 표면 사이 구속력을 조사하기 위하여 사용될 수 있습니다 할 수 있습니다.

JPK Nanowizard® BioAFM는 그 같은 연구 결과에 완벽하게 적응됩니다. Nanowizard®는 가벼운 현미경 검사법으로 동시에 작동하기 위하여 디자인되고, 거꾸로 한 가벼운 현미경에 설치되, 사용자를 AFM를 가진 특정한 지구를 검사하기 전에 관심사의 세포의 위치를, 광학적으로 확인하는 허용해서 집합되어 허용하고 실험적인 시간을 인 정보의 다중 채널 통신로를 감소시키. 특별히 디자인한 견본 홀더, JPK BioCell™는 얇은 유리제 coverslips에 15-60°C, 그 같은 사이 온도에, 실험을 감소시키지 않는에 있는 광학적인 심상의 질 촉진합니다. 추가적으로, JPK Nanowizard®는 우량한 안정성을 전시해, 세균성 지상 층 (숫자 1) 뿐 아니라 prokaryotes에서 진핵생물과 같은 세포 분대의 고해상 화상 진찰을에 전체적인 세포의 생리적인 화상 진찰 허용하.

Deinococcus radiodurans에서 숫자 1. HPI 층, 친절하게 박사가 패트릭 Frederix 의 바젤의 대학 제공하는 심상.

효모

싹트는 효모로 또한 알려진 효모 S. cerevisae는 또한 빵 만들기에서 맥주, 그것의 양조에 공업 공정에 있는, 뿐만 아니라입니다 진핵 세포의 연구 결과에 있는 모형 유기체 유익합니다. cerevisiae S.는 단일 2중 성장 도 할 수 있고기 2 시간의 구보를 가진 단세포 유기체이기 때문에, 진핵 세포의 기본적인 작용의 연구 결과에 적절해던 증명했습니다.

cerevisiae 효모 S.는 키틴질의 단백질, 다당류 및 적은 양으로 구성된 세포벽에 의해 포위됩니다. 전자 현미경 검사법은 이 세포벽이 두껍게 구역 수색하는 층구조 300 까지 nm이다는 것을 보여주었습니다. 안 층은 기계적인 병력을 빌려주고 â1,2-glycan와 키틴질로 구성됩니다. 외부 층은 세포 사이 승인 사건에서 관련시키고, 몹시 glycosylated mannoproteins로 주로 구성됩니다. 세포벽이 이 mannoproteins에 탄수화물 곁사슬의 존재에 의하여 친수성에게 하고 다중 음전하 생리적인 PH.에 귀착됩니다. AFM에 imaged 때, 최소 군대 (숫자 2)에 주의깊은 스캐닝을 필요로 하는 세포의 표면은 아주 매끄러운 것처럼 보이고, 쉽게 모양없이 합니다. 유일하게 명백한 지상 특징은 새로 형성 딸 세포에 어머니 세포의 반대측에 새싹 흉터입니다. 표면은 설탕으로 매끄러운 어둡게 합니다 막을 것처럼 보입니다.

cerevisiae S.의 숫자 2. 화상 진찰. 효모 세포는 AFM (b)를 가진 액체에 있는 접촉형에서 DIC 현미경 검사법 (a)를 사용하여 그 후에 imaged 있고. (c) 고도 채널 통신로에서 생성된 3D 심상에서는 디스플레이되, 강조하 어머니 세포 (노란 화살.)에 새싹 흉터를

현미경의 기계적인 본질 자체가 AFM의 유일한 특징의 한에 의하여 유래합니다. 유연한 외팔보는 상호 작용 군대를 산출하기 위하여 측정되고 연속적으로 사용될 수 있습니다. 이것은 외팔보에 링크가 파열되기 전에 그 때 견본과 및 길이가 면적소 기지개할 외팔보 사이 상호 작용의 군대를 둘 다 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다.

여기에서, 우리는 어머니 및 딸 세포 둘 다의 표면에 다수 점과의 접촉으로 외팔보를 가져왔습니다. 적어도 10 군대 거리 곡선은 각 세포를 위한 다중 포인트에 장악되었습니다.

군대 거리 곡선에서, 각종 데이터는 추출될 수 있습니다. 숫자 3에서는, 연장 곡선의 단지 하나는 공산분자에서 (외팔보로 표면에 접근하고 모양없이 합니다) 음모를 꾸몄습니다. 그 외는 표면에서 외팔보의 되돌아가, 또는 수축력에 모두를 대응합니다 멀리 구부립니다. 이 수축력 단계 도중, 면적소가 외팔보에 바운스되는 경우에, 외팔보는 piezo 움직임으로 외팔보를 표면에서 떨어져 있을 것이다 붙드는 칩을 아래쪽으로 빗나가게 할 것입니다. 외팔보가 아래쪽으로 빗나가게 하기 때문에 외팔보에 붙어 있던 면적소에 적용된 군대는 증가할 것입니다. 유생분자와 외팔보 사이 유대가 부서지는 군대에, 외팔보는 그것의 비 빗나가게 된 위치로 다시 물 것입니다.

숫자 3. 딸 (a) 어머니 세포 (b)의 외팔보와 표면 사이 상호 작용의 군대 거리 곡선. 공산분자에서는 연장 곡선은, 다른 것들 입니다 끌어 넣습니다 곡선을 입니다. 극대 방면 군대 (f) 및 별거 거리 (d)는 이 데이터에서 산출될 수 있습니다. 파란 화살은 분자의 탄력 있는 기지개를 표시하는 곡선의 지구를 표시합니다.

군대 거리 곡선의 끌어 넣 단면도의 모양은 또한 붙어 있던 유생분자의 물자 속성에 관하여 무언가를 표시할 수 있습니다. 이런 경우에 곡선의 모양은 외팔보와의 상호 작용이 부서질 전에 외팔보에 붙어 있던 면적소가 탄력 있 모양없이 한다는 것을 보여줍니다. 게다가, 이것에서 곡선 사람을 이 노예 중단이 일어나는 표면에서 별거의 유대 그리고 거리를 끊을 것을 요구된 군대를 결정할 수 있습니다 되돌아가십시오.

분자의 끝에 외팔보와 세포 표면 사이 각 상호 작용이 아닙니다 외팔보에 유생분자의 부착 귀착될 는 사실 때문에 동일 세포에 장악된 군대 거리 곡선 사이 가변성이, 외팔보 항상 붙이지 않을 것입니다 있고 지상 구성은 본래부터 이질적입니다. 데이터가 통계 분석을 효과적으로 복종될 수 있다 그래야 그러므로 군대 거리 곡선의 충분한 수를 취득하는 것이 중요합니다. 여기에서, 100개의 군대 곡선 이상 각 세포에 측정되고, 파열에 극대 방면 군대, F 및 별거 거리, D는 막대 그래프로 숫자 4에서, 산출되고 제출됩니다. 지상 분자와 외팔보 사이서만 상호 작용이 검출될 때 가치 F와 D는 산출되었습니다.

D (a)와 (b) 어머니와 딸 세포를 위한 극대 방면 군대 F가 연장의 숫자에 의하여 4. 막대 그래프 멀어집니다.

파열에 거리의 경우에, 가치의 막대 그래프는 두 세포 전부를 위해 데이터가 일반적으로 400 까지 nm (그림 4A) 분산된다는 것을 보여줍니다, 그 때 두 세포 전부를 위해 몇몇 더 큰 국외자가 있습니다. 2개의 자료 집합을 비교하기 위하여는 400 nm 이상 국외자는 무시되었습니다. 를 위한 이 제한 안에, 어머니 세포를 위한 D = 139 ± 56 nm, 그리고 딸 세포 D = 86 ± 43 nm. 이 가치는 2 꼬리가 달린 학생 T 시험을 사용하여 현저하게 다르기, 위하여 결정되었습니다.

극대 방면 군대의 데이터는, 평균, 어머니 세포를 위한 방면 군대가 딸 세포 (어머니, F = 352 pN의 그것 보다는 더 높다는 것을 보여줍니다: 딸, F = 167 pN). 그러나, 이 경우에는, 방면 군대의 매우 더 넓은 배급이 있고 양쪽의 경우에, 외팔보 (숫자 4B)에 외팔보의 아무 편향도도 없던 다수 군대 거리 곡선이, 지상 분자의 i.e 바인딩 있었습니다. 이 데이터는 어머니와 딸 세포 사이 세포벽의 구조물 그리고 구성에 있는 다름을 건의합니다.

박테리아

AFM는 지상 화상 기술이기 때문에, 고해상에 지상 구조물을 성격을 나타내기 위하여 이용되었습니다. 몇몇 박테리아는 살해자, 또는 단백질의 정규로 포장한 격자로 이루어져 있는 지상 층을 전시합니다. 패킹은 견본, 이렇게 고립시킨, 크리스탈 살해자에 구조상 안정성을 고해상, 전시 개별적인 단백질 소단위에 imaged 일 수 있습니다 빌려줍니다. 시원 세균 Deinococcus radiodurans에서 6각형으로 포장된 중간 레이어 (숫자 1)는 유명한 보기입니다. 이 HPI 층의 AFM 심상에서는, 사람은 몇몇이의 이 숨구멍 열리는 구조에 있다, 그러나 그 외 닫히는 각 숨구멍의 개별적인 소단위를 보골.

대부분의 시원 세균 전시회 살해자, eubacteria의 실험실 긴장이 일반적으로 동안. 통용되는 실험실 박테리아는 Eschericia 콜라이 그램 음성 박테리아입니다. 그램 음성 박테리아에는 periplasmic 공간에 의해 peptidoglycan의 경직되어 있는 그러나 높게 다공성 세포벽이 있는 포위된 원형질막이 있습니다. 이것은 다양한 길이의 lipopolysaccarides가 연장하는 외부 막에 의해 그 때 포위됩니다.

숫자 5. 간헐적인 DH5a 세포의 접촉형 심상. 개관 고도 (a)와 과실은 (b) 박테리아의 표면의 심상 및 더 높은 확대 과실 신호 심상 (c)를 신호합니다.

여기에서, 우리는 대장균, DH5a 및 OP50의 imaged 긴장 2개 있습니다. DH5a의 심상은 고전, 많은 그램 음성 박테리아의 로드 모양을 보여줍니다. 세포는 공기 (버퍼 (숫자 6)에서에서 숫자 5)와 검사되었습니다. 공기에서 imaged 때, 박테리아의 표면은 높게 모방해 나타납니다. 추가적으로, 박테리아의 주위에 달무리는 명백합니다. 대장균의 표면에 있는 이 구조물은 pili에 아마 대응합니다. 액체에서 imaged 때 대조적으로, (숫자 6)는 박테리아의 표면 매우 더 매끄러운 것처럼 보입니다. 이런 경우에 이것은 그 자리에 고쳐지지 않기 때문에, 지상 구조물이 스캐닝 도중 끝의 운동에 의해 쉽게 전치될 는 사실 때문이.

숫자 6. 간헐적인 액체에 있는 DH5a의 접촉형 심상. 지형도 작성 데이터 (a)에서 생성된 3D 심상 및 더 높은 확대 과실 신호 심상 (b)는 디스플레이됩니다.

OP50 긴장은, 그러나 또한 대장균, 확실히 다른 것처럼 보입니다. OP50는 Caenorhabditis elegans를 공급하기 위하여 이용될 수 있던 긴장으로 원래 고립되었습니다. 대장균 그밖 긴장 보다는 더 허약하고 더 작은 긴장을 요구하는 우라실입니다. 공기에서 imaged 때 (숫자 7)는 DH5a를 위해 보이는과 이 박테리아 동일 구축한 표면을 전시하지 않습니다. 추가적으로, 세포는 표면에서 그(것)들을 제거하는 것을 피하도록 더 허약하 주의깊게 imaged 이어야 합니다. 액체에서는, 표면은 또한 DH5a의 그것 보다는 보다 적게 구축되고, 세포 표면의 지구는 세포의 표면에 설탕 그리고 그밖 유연한 구조물의 진지변환에 일치하는 확률이 높은 검사 방향에서 전치됩니다.

공기 (지세, Berror 신호)와 액체 (C- 지세, D- 과실 신호)에서 imaged OP50 박테리아의 숫자 7. 심상.

(S. cerevisiae 위를 위해 보이는) 외팔보는 또한 박테리아의 표면에 설탕과의 상호 작용을 시험하기 위하여 사용될 수 있습니다. 그러나, 여기에서 우리는 외팔보에 박테리아를 (많 L 리진을 사용하는) 붙이고 박테리아와 돌비늘 표면 (숫자 8) 사이 상호 작용이라고 측정했습니다. 그런 기술은 세균성 표면 상호 작용의 정량화를 허용하다 유일합니다 에서, 공업 공정에서 biofouling의 연구 결과를 위해 중요한. 견본 홀더로 JPK Biocell™의 사용은 화합물의 제자리 추가가 이 상호 작용을 막는 것을 허용합니다.

숫자 8. 대표적인 공가 경계 DH5a와 버퍼에서 돌비늘 표면 사이 상호 작용의 군대 거리 curvers. 연장 곡선은 공산분자에서, 모든 파란 곡선입니다 수축력 곡선 제출됩니다. 적용되는 군대를 증가하는 것은 극대 방면 군대를 증가하지 않았습니다. 화살은 개별적인 방면 사건을 표시합니다.

DH5á 돌비늘 상호 작용의 대표적인 군대 거리 곡선은 S. cerevisiae 표면을 가진 외팔보의 상호 작용과 비교하여 숫자 8.에서, 거기 없습니다 견본의 탄력 있는 개악이 제출됩니다. 다수 분리된 방면 사건은, 개별적인 면적소의 방면에 일치하는 확률이 높은 보일 수 있습니다. 사람이 또한 개별적인 방면 사건을 조사하는 것을 시작할 수 있다 그러나, 또 다시, 군대 거리 곡선 사람에서 표면에서 박테리아를 분리할 것을 요구된 최대 군대의 양을 정할 수 있습니다.

바이러스

바이러스에 의하여 의무를 지웁니다 DNA 또는 RNA로 이루어져 있는 외부 단백질 외투 주위 유전 물질로 구성된 세포내 기생충이 입니다. 이 유전 물질은 복제를 위해 요구된 모든 정보를 포함하지 않습니다, 대신 바이러스는 전파하기 위하여 호스트 세포의 셀 방식 기계장치를 파괴할 필요가 있습니다. 바이러스는 400 nm에 극단적으로 작습니다, 약 20 nm. 이것은 바이러스성 구조물의 특성이 고해상 화상 기술을 요구한다는 것을 의미합니다 원자 군대 현미경 검사법과 같이. 여기에서 우리는 imaged 담배 모자이크 바이러스, (TMV) 전자 현미경 검사법을 사용하여 imaged 첫번째 바이러스가 있습니다.

숫자 9. 간헐적인 TMV 입자의 접촉형 심상. 지세 (a), 단계 (b) 및 동일 견본 지구의 과실 신호 심상 (c)는 제출됩니다.

TMV 입자는 돌비늘에 간헐적인 접촉형을 사용하여 imaged 흡착되고. 이 바이러스 입자가 나선형 capsids로, 유전 물질의 주위에 나선형 패턴에 있는 외투 단백질 더미 알려지는. 이에게 나선형에게 겹쳐 쌓이는 것은 고도, 단계 및 과실 신호 채널 (숫자 9)에서 보일 수 있습니다. BioAFM JPK Nanowizard®와 같은 심상 생물학 견본에 사용의 1개 중요한 이점은, 화상 진찰이 액체에서 수행될 수 있다 입니다. 따라서, 바이러스 입자는 액체에서 그들의 표적 세포의 표면에 imaged, 일 수 있습니다. 여기에서, 우리는, 액체에서, 간헐적인 접촉형을 사용하여 적혈구의 표면에 붙어 있던 imaged 유행성감기 바이러스가 있습니다. 바이러스 입자는 명확하게 세포의 표면에 imaged 입니다.

적혈구의 표면과 관련되었던 숫자 10. 유행성감기 바이러스 입자. 개관 심상 (a) 및 적혈구 표면의 더 높은 확대 심상 (b)는 보여줍니다 유행성감기 바이러스 입자 (백색 화살)를

결론

Nanowizard® bioAFM는 미생물의 연구 결과를 위해 완벽하게 적응됩니다. JPK Biocell는 AFM 안정성 또는 광학적인 질 희생 없이 생리적인 조건을 제공합니다. 현미경의 안정성은 개별적인 단백질 소단위의 화상 진찰을 가능하게 하고, 거꾸로 한 가벼운 현미경으로 가득 차있는 통합은 현미경 검사법 기술의 조합을 동시에 수행되는 가능하게 합니다. 뿐만 아니라 이 플래트홈은 미생물 견본의 고해상 심상을 허용합니까, 유기체와 표면 또는 공가와 표면 관련되는 분자 사이 상호 작용 군대의 양을 정하기 위하여 이용될 수 있습니다.

수신 확인

대장균과 S. cerevisiae 견본을 위한 분자 세포 생물학 및 유전학을 위한 박사에게 Jeffrey Stear, Planck 최대 학회 많은 감사. TMV는 로베르트 코흐 학회에게서 박사에 의해 마이클 Laue 친절하게 제공되었습니다. HPI 심상은 박사에 의해 패트릭 Frederix 의 바젤의 대학 친절하게 제공되었습니다.

근원: JPK 계기

이 근원에 추가 정보를 위해 JPK 계기를 방문하십시오

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:09

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