NanoWizard bioAFM Volkomen Geschikt voor het Bestuderen van Micro-organismen door JPK Instrumenten

Besproken Onderwerpen

Inleiding
Nanotechnologie voor de Microbiologie
Gist
Bacteriën
Virussen
Conclusies
Erkenning

Inleiding

De term de „microbiologie“ beschrijft over het algemeen de studie van die organismen onzichtbaar aan het menselijke oog, in het bijzonder gist, bacteriën en virussen. Nochtans, zijn deze drie types van organismen beduidend verschillend van elkaar. De Gist en de bacteriën zijn verschillende celtypes (het eukaryotic en prokaryotic respectievelijk), terwijl een virus strikt geen het leven organisme is, zijn verplichten intracellular parasiet. De hulpmiddelen om onderzoek naar de microbiologie te leiden kunnen in twee de hoofdgebiedenmicroscopie worden gescheiden, die voor visualisatie wordt vereist, en de moleculaire biologie, die is gebruikt om (in sommige gevallen ruim) genetisch en proteomic te kenmerken maakt omhoog van deze organismen.

Nanotechnologie voor de Microbiologie

De eerste stappen in het openen van het gebied van de microbiologie kwamen met de komst van de eerste microscopen. De Bacteriën werden eerst gevisualiseerd door Antony van Leeuwenhoek, gebruikend een eenvoudige, zelf-gebouwde microscoop, rond 1676. De microscopen door Leeuwenhoek worden gebouwd waren samenstellings geen microscopen, die zich in plaats daarvan op één enkele lense, meer zoals een zeer krachtig vergrootglas baseren dat. Één van zijn die eerste beschrijvingen van bacteriën (als microscopisch klein diertjes worden bedoeld) was van steekproeven van de tanden van van Leeuwenhoek zelf worden geschaafd.

Terwijl de gist in gisting en is gebruikt om brood rond 5000 jaar te zuren, was het in 1860 dat Louis Pasteur eerst de gist, Saccharomyces cerevisiae als effecter van deze processen beschreef. Louis Pasteur leverde vele significante bijdragen tot het gebied van de microbiologie in de loop van de jaren, van de beschrijving van S. cerevisiae, aan zijn elegante experimenten om de theorie van spontane generatie en zijn fundamentele rol in de kiemtheorie van ziekte en vroege vaccinontwikkeling te weerleggen. In feite, moest één van de successen van Pasteur op het gebied van vaccinontwikkeling hondsdolheidsvirus door het verwarmen voor injectie als vaccin verminderen, ondanks het kunnen niet het virus zelf in het beïnvloede weefsel visualiseren.

De Vorderingen in de lichte microscopie door het gecombineerde werk van Ernst Abbe en Carl Zeiss in 1880s worden gemaakt breidden verder het onderzoek van de microbiologische wereld die uit. Nochtans, als beschreven Abbe zelf, is er een grens aan de resolutie van de lichte microscopie, afhankelijk van de golflengte van het verlichtende licht en de numerieke opening van de lens. In werkelijkheid, is de resolutie van de lichte microscopie beperkt tot de helft van de golflengte van licht, of rond 250 NM. Als dusdanig, moest de studie van de structuur van virussen op de komst van de elektronenmicroscoop in 1931 door Ernst Ruska en de verdere kristallisatie van het virus van het tabaksmozaïek in 1935 door Wendall Stanley wachten.

Meer onlangs, heeft de atoomkrachtmicroscoop een nieuwe weg voor het onderzoek en de manipulatie van structuren op zeer kleinschalig geopend. Één van de vaakst aangehaalde voordelen van AFM in de studie van biologische structuren is het feit dat, in tegenstelling tot elektronenmicroscopie, de hoge resolutiebeelden in de fysiologische omstandigheden kunnen worden verkregen. Nochtans, zijn er meer aan AFM dan enkel zijn capaciteit voor hoge resolutieweergave. De mechanische die aard van AFM betekent dat de cantilever, voor weergave wordt gebruikt, ook kan worden gebruikt om interactiekrachten, in de piconewtonwaaier te meten.

als dusdanig, niet alleen kan het beeld AFM de oppervlakte van micro-organismen bij hoge resolutie, in de fysiologische omstandigheden, kan het ook worden gebruikt om de bandkrachten tussen micro-organismen en doeloppervlakten te onderzoeken.

JPK Nanowizard® BioAFM is volkomen geschikt voor dergelijke studies. Nanowizard® wordt ontworpen om gelijktijdig met de lichte microscopie te werken, en is geïnstalleerd op een omgekeerde lichte microscoop die, die veelvoudige kanalen van informatie toelaten om worden verzameld en experimentele tijd verminderen door de gebruiker toe te staan om de plaats van cellen van belang optisch, vóór het aftasten van een bepaald gebied met AFM te identificeren. De speciaal ontworpen steekproefhouder, JPK BioCell™, vergemakkelijkt experimenten bij temperaturen tussen 15-60°C op dunne glascoverslips, dusdanig dat de kwaliteit van optische beelden in verminderd niet. Bovendien stelt JPK Nanowizard® superieure stabiliteit tentoon, die hoge resolutieweergave van celcomponenten toestaan, zoals bacteriële oppervlaktelagen (Figuur 1) evenals fysiologische weergave van gehele cellen, van prokaryotes aan eukaryotes.

Figuur 1. Laag HPI van Deinococcus radiodurans, beeld vriendelijk door Dr. Patrick Frederix, Universiteit wordt verstrekt van Bazel dat.

Gist

Ook gekende gistS. cerevisae, zoals de ontluikende gist, niet alleen van gebruik in industriële processen die van brood is aan het brouwen van bier maken, het is ook een typeorganisme in de studie van eukaryotic cellen. Aangezien cerevisiae S. geschikt voor haploid of diploïde groei is en een eencellig organisme met een verdubbelende tijd van een paar uren is, is het passend aan de studie van het fundamentele functioneren van eukaryotic cellen gebleken.

De cerevisiae gist S. wordt door een celwand omringd uit proteïnen, polysacchariden en kleine hoeveelheden chitine wordt samengesteld dat. De elektronenmicroscopie heeft aangetoond dat deze celwand een gelaagde structuur die tot 300 NM dik uitstrekken zich is. De binnenlaag leent mechanische sterkte en is samengesteld uit â1,2-glycan en chitine. De buitenlaag is betrokken bij erkenningsgebeurtenissen tussen cellen, en is meestal samengesteld uit zwaar glycosylated mannoproteins. De aanwezigheid van de koolhydraatzijketens op deze mannoproteins maakt de celwand en resultaat in veelvoudige negatieve lasten bij fysiologisch pH hydrofiel. Wanneer imaged met AFM, lijkt de oppervlakte van de cel zeer vlot, en is gemakkelijk misvormd, vergend zorgvuldig aftasten bij minimale kracht (Figuur 2). De enige duidelijke oppervlakteeigenschap is het knoplitteken op het tegenovergestelde eind van de moedercel aan de zich onlangs het vormen dochtercel. De oppervlakte lijkt vlot aangezien de suikers het membraan verduisteren.

Figuur 2. Cerevisiae Weergave van S. Cellen van de Gist werden gevestigd gebruikend DIC de microscopie (a) en toen imaged op contactwijze in vloeistof met AFM (b). In (c) die een 3D beeld van hoogte wordt geproduceerd wordt het kanaal getoond, benadrukkend het knoplitteken op de moedercel (gele pijl.)

Één van de unieke eigenschappen van AFM stamt uit de mechanische aard van de microscoop zelf. De flexibele cantilever kan worden gekalibreerd en later worden gebruikt om interactiekrachten te berekenen. Dit kan dan worden gebruikt om zowel de kracht van interactie tussen een steekproef als de cantilever te bepalen, en de lengte waaraan duikt op zullen de elementen zich uitrekken alvorens de link met de cantilever wordt verbroken.

Hier, hebben wij de cantilever in contact met een aantal punten op de oppervlakte van zowel de moeder als de dochtercel gebracht. Minstens 10 werden de kracht-afstand krommen verkregen op veelvoudige punten voor elke cel.

Van de kracht-afstand krommen, kunnen diverse gegevens worden gehaald. In Figuur 3, breidt slechts één van krommen (aangezien de cantilever de oppervlakte nadert en) uit misvormt is in kaart gebracht in rood. Andere buigt allen beantwoordt aan reconstitueert, of intrekken van de cantilever vanaf de oppervlakte. Tijdens deze intrekkenfase, als een oppervlakteelement aan de cantilever heeft gebonden, zal de cantilever als piezo bewegingen naar beneden de spaander houdend de cantilever vanaf de oppervlakte doen afwijken. Aangezien de cantilever naar beneden doet afwijken zal de kracht op het oppervlakteelement in bijlage wordt toegepast aan de cantilever die stijgen. Bij de kracht waarbij de band tussen de biomolecule en de cantilever gebroken is, zal de cantilever terug naar zijn niet-doen afwijken positie breken.

Figuur 3. Kracht-Afstand krommen van de interactie tussen de cantilever en de oppervlakte van de dochter (a) of moedercel (b). In rood is uitbreiden kromme, zijn al anderen intrekken krommen. De maximale losmakende kracht (f) en de scheidingsafstand (d) kunnen vanaf dit gegeven worden berekend. De blauwe pijl wijst op het gebied van de kromme die van zich het elastische uitrekken van de molecules indicatief is.

De vorm van trekt sectie kracht-afstand krommen in kan op iets over de materiële eigenschappen van de biomolecule in bijlage ook wijzen. In dit geval toont de vorm van de kromme aan dat de oppervlakteelementen in bijlage aan de cantilever elastically misvormen, alvorens de interactie met de cantilever wordt gebroken. Bovendien, van dit reconstitueer kromme men de kracht kan bepalen wordt vereist om de band en de afstand te breken van scheiding van de oppervlakte waaraan deze bandverstoring die voorkomt.

Er is veranderlijkheid tussen kracht-afstand de krommen op de zelfde cel, wegens het feit worden verkregen dat niet elke interactie tussen de cantilever en de celoppervlakte in de gehechtheid van een biomolecule aan de cantilever zal resulteren, zal de cantilever niet altijd vastmaken aan het eind van een molecule en de oppervlaktesamenstelling die is inherent heterogeen. Het is daarom belangrijk om een voldoende aantal kracht-afstand krommen te verwerven zodat de gegevens effectief aan statistische analyse kunnen worden onderworpen. Hier, werden meer dan 100 krachtkrommen gemeten op elke cel, en maximale losmakende kracht, F, en de scheidingsafstand bij breuk, D, werd berekend en wordt voorgesteld in Figuur 4 als histogram. De waarden F en D werden slechts berekend toen een interactie tussen een oppervlaktemolecule en de cantilever werd ontdekt.

Figuur 4. Histogrammen van uitbreidingsafstand D (a) en maximale losmakende kracht F (b) voor de moeder en dochtercellen.

In het geval van de afstand om te verbreken, toont de histogram van waarden aan dat voor beide cellen de gegevens normaal tot 400 NM worden verspreid (Fig. 4A), en dan voor beide cellen zijn er sommige grotere uitlopers. om de twee gegevensreeksen te vergelijken werden de uitlopers boven 400 NM genegeerd. Binnen deze beperkingen, voor de moedercel D = 139 ± 56 NM, en voor de dochtercel D = 86 ± 43 NM. Deze waarden werden bepaald beduidend verschillend om te zijn, gebruikend een two-tailed studenten t-Test.

De gegevens voor de maximale losmakende kracht tonen aan dat, gemiddeld, de losmakende kracht voor de moedercel hoger is dan dat van de dochtercel (moeder, F = 352 pN: dochter, F = 167 pN). Nochtans, in dit geval, is er een veel bredere distributie van losmakende krachten en in beide gevallen, waren er een aantal kracht-afstand krommen waar er geen afbuiging van de cantilever, d.w.z. geen band van oppervlaktemolecules aan de cantilever was (Cijfer 4B). Deze gegevens stellen een verschil in de structuur en de samenstelling van de celwand tussen de moeder en de dochtercel voor.

Bacteriën

Aangezien AFM een techniek van de oppervlakteweergave is, is het gebruikt om oppervlaktestructuren bij hoge resolutie te kenmerken. Sommige bacteriën stellen S-layer, of oppervlaktelaag tentoon, die uit een regelmatig ingepakt rooster van proteïne bestaan. De verpakking leent een structurele geïsoleerde stabiliteit aan de steekproef, zo, kunnen de kristallijne Moordenaars imaged bij hoge resolutie zijn, die individuele eiwitsubeenheden tonen. De hexagonally ingepakte middenlaag van archaebacteria Deinococcus radiodurans (Figuur 1) is goed - bekend voorbeeld. In beelden AFM van deze laag HPI, kan men de individuele subeenheden van elke porie zien, en dat sommige van deze poriën in een open bouw zijn, terwijl anderen wordt gesloten.

Terwijl meeste S-layers van het archaebacteriatentoongestelde voorwerp, laboratoriumspanningen van eubacteria over het algemeen niet. De het meest meestal gebruikte laboratoriumbacteriën is Eschericia coli, gramnegatieve bacteriën. De Gramnegatieve die bacteriën hebben een plasmamembraan, door een periplasmic ruimte wordt omringd waarin er een stijve maar hoogst poreuze celwand van peptidoglycan is. Dit wordt dan omringd door een buitenmembraan, waarvan lipopolysaccarides van variërende lengte me uitbreid.

Figuur 5. De Intermitterende beelden van de contactwijze van DH5a cellen. De hoogte van het Overzicht (a) en de beelden van het foutensignaal (b), en een hoger het signaalbeeld van de vergrotingsfout (c) van de oppervlakte van de bacterie.

Hier, hebben wij imaged twee spanningen van E. coli, DH5a en OP50. De beelden van DH5a tonen de schrijver uit de klassieke oudheid, staaf-vorm van vele gramnegatieve bacteriën. De cellen werden afgetast in lucht (Figuur 5) en in buffer (Figuur 6). Wanneer imaged in lucht, lijkt de oppervlakte van de bacteriën hoogst gevormd. Bovendien is een halo rond de bacterie duidelijk. Deze structuren die waarschijnlijk beantwoorden aan pili, die aan de oppervlakte van E. coli worden gevonden. In tegenstelling, wanneer imaged in vloeistof (Figuur 6) de oppervlakte van de bacterie lijkt veel meer vlot. In dit geval is dit toe te schrijven aan het feit dat de oppervlaktestructuren gemakkelijk door de beweging van het uiteinde tijdens aftasten zouden verplaatst worden, aangezien zij niet op zijn plaats worden bevestigd.

Figuur 6. De Intermitterende beelden van de contactwijze van DH5a in vloeistof. Een 3D beeld van topografische gegevens (a) wordt geproduceerd en een hoger het signaalbeeld van de vergrotingsfout (b) dat worden getoond.

De OP50 spanning, terwijl ook E. coli, vrij verschillend lijkt. OP50 werd oorspronkelijk geïsoleerd als een spanning die zou kunnen worden gebruikt om Caenorhabditis te voeden elegans. Het is een uracil die spanning vereisen die breekbaarder en kleiner is dan andere spanningen van E. coli. Wanneer imaged in lucht (Figuur 7) deze bacteriën stellen niet de zelfde gestructureerde oppervlakte tentoon zoals die voor DH5a wordt gezien. Bovendien zijn de cellen breekbaarder en moeten zorgvuldig imaged zijn vermijden verwijderend hen uit de oppervlakte. In vloeistof, is de oppervlakte ook minder gestructureerd dan dat van DH5a, en de gebieden van de celoppervlakte worden verplaatst in de aftastenrichting, het waarschijnlijke beantwoorden aan de verplaatsing van de suikers en andere flexibele structuren aan de oppervlakte van de cel.

Figuur 7. Beelden van OP50 bacteriën imaged in lucht (a-Topografie, signaal Berror) en vloeistof (de topografie van C, de foutensignaal van D).

De cantilever kan ook worden gebruikt om interactie met de suikers aan de oppervlakte van de bacteriën (zoals getoond voor cerevisiae bovengenoemd van S.) te sonderen. Nochtans, hier hebben wij de bacteriën aan de cantilever die (poly-l-lysine gebruiken) vastgemaakt en de interactie tussen de bacteriën en de micaoppervlakte gemeten (Figuur 8). Zulk een techniek is uniek in zoverre dat het de getalsmatige weergave van kritieke bacterieel-oppervlakteinteractie toestaat, voor studies van het biofouling in industriële processen. Het gebruik van JPK Biocell™ als steekproefhouder staat de toevoeging in situ van samenstellingen toe om deze interactie te blokkeren.

Figuur 8. Representatieve kracht-afstand curvers van de interactie tussen verbindende DH5a en een micaoppervlakte, in buffer. Breid kromme uit wordt voorgesteld in rood, zijn alle blauwe krommen intrekkenkrommen. Het Verhogen van de toegepaste kracht verhoogde niet de maximale losmakende kracht. De Pijlen wijzen op individuele losmakende gebeurtenissen.

Representatieve worden de kracht-afstand krommen van DH5á-Mica interactie voorgesteld in Figuur 8. In vergelijking met de interactie van de cantilever met de cerevisiae oppervlakte van S., is er geen elastische misvorming van de steekproef. Een aantal afzonderlijke losmakende gebeurtenissen kunnen zijn het gezien, waarschijnlijke beantwoorden aan het losmaken van individuele oppervlakteelementen. Opnieuw, van de krommen van de krachtafstand kan men de maximumdiekracht kwantificeren wordt vereist om de bacteriën van de oppervlakte te scheiden, nochtans kan men ook beginnen om individuele losmakende gebeurtenissen te onderzoeken.

Virussen

De Virussen zijn verplichten intracellular parasieten uit een buiten eiwitlaag worden samengesteld die genetisch materiaal omringen dat uit of DNA of RNA dat bestaat. Dit genetische materiaal bevat al die informatie niet voor replicatie wordt vereist, in plaats daarvan moet het virus de cellulaire machines van de te verspreiden gastheercel ontwrichten zich. De Virussen zijn uiterst klein, rond 20 NM aan 400 NM. Dit betekent dat de karakterisering van virale structuur de technieken van de hoge resolutieweergave, zoals de atoomkrachtmicroscopie vereist. Hier hebben wij imaged virus van het tabaksmozaïek (TMV), de eerste virus imaged gebruikende elektronenmicroscopie.

Figuur 9. De Intermitterende beelden van de contactwijze van deeltjes TMV. De Topografie (a), de fase (b) en de beelden van het foutensignaal (c) van het zelfde steekproefgebied worden voorgesteld.

De deeltjes TMV werden geadsorbeerd aan mica en imaged gebruikende intermitterende contactwijze. Deze virusdeeltjes zijn genoemd geworden spiraalvormige capsids, waar de laag eiwitstapels in een spiraalvormig patroon rond het genetische materiaal. Dit het spiraalvormige stapelen kan in de hoogte, fase en foutensignaalkanalen (Figuur 9) worden gezien. Één significant voordeel om een BioAFM, zoals JPK Nanowizard®, aan beeld biologische steekproeven te gebruiken, is dat de weergave in vloeistof kan worden geleid. Als dusdanig, kunnen de virusdeeltjes op de oppervlakte van hun doelcellen, in vloeistof imaged zijn. Hier, hebben wij imaged griepvirus in bijlage aan de oppervlakte van rode bloedcellen, in vloeistof, die intermitterende contactwijze gebruiken. De virusdeeltjes zijn duidelijk imaged aan de oppervlakte van de cellen.

Figuur 10. Het virusdeeltjes van de Griep verbonden aan de oppervlakte van een erytrociet. Het overzichtsbeeld (a) en het hogere vergrotingsbeeld (b) van de rode bloedceloppervlakte tonen de deeltjes van het griepvirus (witte pijl)

Conclusies

Nanowizard® bioAFM is volkomen geschikt voor de studie van micro-organismen. JPK Biocell verstrekt fysiologische voorwaarden zonder stabiliteit AFM of optische kwaliteit te offeren. De stabiliteit van de microscoop laat weergave van individuele eiwitsubeenheden toe, en de volledige integratie in een omgekeerde lichte microscoop laat dat een combinatie de microscopietechnieken toe gelijktijdig wordt geleid. Niet alleen staat dit platform hoge resolutiebeelden toe van microbiële steekproeven, kan het worden gebruikt om interactiekrachten tussen organismen en een oppervlakte of tussen de cantilever en de oppervlakte-geassocieerde molecules te kwantificeren.

Erkenning

Vele dank aan Dr. Jeffrey Stear, Max Planck Institute voor de de Moleculaire Biologie en Genetica van de Cel, voor de cerevisiae steekproeven van E. coli en van S. TMV werd vriendelijk verstrekt door Dr. Michael Laue van het Instituut van Robert Koch. De beelden HPI werden vriendelijk verstrekt door Dr. Patrick Frederix, Universiteit van Bazel.

Bron: Instrumenten JPK

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve Instrumenten JPK

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 20:52

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit