BioAFM de NanoWizard Serido Perfeitamente Estudando Micro-organismos por Instrumentos de JPK

Assuntos Cobertos

Introdução
Nanotecnologia para a Microbiologia
Fermento
Bactérias
Vírus
Conclusões
Reconhecimentos

Introdução

O termo “microbiologia” descreve geralmente o estudo daqueles organismos invisíveis ao olho humano, em particular fermento, bactérias e vírus. Contudo, estes três tipos de organismos são significativamente diferentes de se. O Fermento e as bactérias são tipos diferentes da pilha (eucariótica e prokaryotic respectivamente), visto que um vírus não é restrita um organismo vivo, sendo um parasita intracelular da obrigação. As ferramentas para conduzir a pesquisa na microbiologia podem ser separadas em uma microscopia principal de dois campos, que seja exigida para o visualização, e a biologia molecular, que foi usada para caracterizar (em alguns casos detalhada) o genético e proteomic compo destes organismos.

Nanotecnologia para a Microbiologia

Os passos iniciais em abrir o campo da microbiologia vieram com o advento dos primeiros microscópios. As Bactérias foram visualizadas primeiramente por Antony camionete Leeuwenhoek, usando um microscópio simples, auto-construído, por volta de 1676. Os microscópios construídos por Leeuwenhoek não eram microscópios compostos, confiando pelo contrário em um único lense, mais como uma lupa muito poderosa. Uma de suas primeiras descrições das bactérias (referidas como animálculos) era das amostras raspadas dos dentes de camionete Leeuwenhoek ele mesmo.

Quando o fermento for usado na fermentação e para fermentar o pão por ao redor 5000 anos, era em 1860 que Louis Pasteur descreveu primeiramente o fermento, Saccharomyces Cerevisiae como o effecter destes processos. Louis Pasteur fez muitas contribuições significativas para o campo da microbiologia ao longo dos anos, da descrição do S. cerevisiae, a suas experiências elegantes para contestar a teoria da geração espontânea e de seu papel fundamental na teoria de germe da doença e da revelação vacinal adiantada. De facto, um dos sucessos de Pasteur no campo da revelação vacinal era atenuar o vírus de raiva através do aquecimento para a injecção como uma vacina, apesar de não poder visualizar o vírus próprio no tecido afetado.

Os Avanços feitos na fotomicroscopia pelo trabalho combinado do Abbe de Ernst e por Carl Zeiss nos 1880s estenderam mais a pesquisa do mundo microbiológico. Contudo, como Abbe ele mesmo descrito, há um limite à definição da fotomicroscopia, dependente do comprimento de onda da luz illuminating e da abertura numérica da lente. Na realidade, a definição da fotomicroscopia é limitada à metade do comprimento de onda da luz, ou a ao redor 250 nanômetro. Como tal, o estudo da estrutura dos vírus teve que esperar o advento do microscópio de elétron em 1931 por Ernst Ruska e a cristalização subseqüente do vírus de mosaico de tabaco em 1935 por Wendall Stanley.

Mais recentemente, o microscópio atômico da força abriu um trajecto novo para a investigação e a manipulação das estruturas muito em uma pequena escala. Uma das vantagens o mais frequentemente mencionadas do AFM no estudo de estruturas biológicas é o facto de que, ao contrário da microscopia de elétron, as imagens de alta resolução podem ser obtidas sob circunstâncias fisiológicos. Contudo, há mais ao AFM do que apenas sua capacidade para a imagem lactente de alta resolução. A natureza mecânica do AFM significa que o modilhão, usado para a imagem lactente, pode igualmente ser usado para medir forças da interacção, na escala do piconewton.

como tal, pode não somente a imagem do AFM a superfície dos micro-organismos na alta resolução, sob circunstâncias fisiológicos, ele pode igualmente ser usada para investigar as forças obrigatórias entre micro-organismos e o alvo surge.

O JPK Nanowizard® BioAFM é serido perfeitamente a tais estudos. O Nanowizard® é projectado trabalhar simultaneamente com fotomicroscopia, e instalado em um fotomicroscópio invertido, permitindo os canais múltiplos de informação sejam recolhidos e reduzindo o tempo experimental permitindo que o usuário identifique o lugar das pilhas do interesse óptica, antes de fazer a varredura uma região particular com AFM. O suporte especialmente projetado da amostra, o JPK BioCell™, facilita experiências em temperaturas entre 15-60°C em lamelas de vidro finas, tais que a qualidade de imagens ópticas no não reduzido. Além, o JPK Nanowizard® exibe a estabilidade superior, permitindo a imagem lactente de alta resolução de componentes da pilha, tais como camadas de superfície bacterianas (Figura 1) assim como a imagem lactente fisiológico de pilhas inteiras, dos prokaryotes aos eukaryotes.

Figura 1. camada dos radiodurans de Deinococcus, imagem de HPI fornecida amavelmente pelo Dr. Patrick Frederix, Universidade de Basileia.

Fermento

Os cerevisae do fermento S., conhecidos igualmente como o fermento de brotamento, são não somente do uso em processos industriais da panificação à fabricação de cerveja da cerveja, ele são igualmente um tipo organismo no estudo de pilhas eucarióticas. Porque o S. cerevisiae é capaz do crescimento haploid ou diploid e é um único organismo da pilha com uma estadia de duplicação de um par horas, provou bem - serido ao estudo do funcionamento básico de pilhas eucarióticas.

O fermento S. cerevisiae é cercado por uma parede de pilha compor das proteínas, dos polisacáridos e das pequenas quantidades de chitina. A microscopia de Elétron mostrou que esta parede de pilha é uma estrutura mergulhada que varia até 300 nanômetro densamente. A camada interna empresta a força mecânica e é compor de â1,2-glycan e de chitina. A camada exterior ?a em eventos do reconhecimento entre pilhas, e compor na maior parte de mannoproteins pesadamente glycosylated. A presença das lado-correntes do hidrato de carbono nestes mannoproteins faz a parede de pilha hidrófila e conduz às cargas negativas múltiplas no pH fisiológico. Quando imaged com AFM, a superfície da pilha parece muito lisa, e é deformada facilmente, necessitando a exploração cuidadosa na força mínima (Figura 2). A única característica de superfície aparente é a cicatriz do botão no extremo oposto da pilha de matriz à pilha de filha recentemente de formação. A superfície parece lisa como os açúcares obscurece a membrana.

Figura 2. Imagem Lactente do S. cerevisiae. As pilhas de Fermento foram encontradas usando a microscopia de DIC (a) e então imaged no modo de contacto no líquido com o AFM (b). (c) em uma imagem 3D gerada do canal da altura é indicado, destacando a cicatriz do botão na pilha de matriz (a seta amarela.)

Uma das características originais do AFM provem da natureza mecânica do microscópio própria. O modilhão flexível pode ser calibrado e subseqüentemente usado para calcular forças da interacção. Isto pode então ser usado para determinar a força da interacção entre uma amostra e o modilhão, e o comprimento a que os elementos de superfície esticará antes que a relação ao modilhão esteja rompida.

Aqui, nós trouxemos o modilhão no contacto com um número de pontos na superfície da matriz e da pilha de filha. Pelo menos 10 curvas da força-distância foram obtidas em pontos múltiplos para cada pilha.

Das curvas da força-distância, os vários dados podem ser extraídos. Em Figura 3, somente uma das curvas do alargamento (porque o modilhão aproxima a superfície e se deforma) foi traçado no vermelho. Todo o outro curva corresponde reconstituir, ou a retração do modilhão longe da superfície. Durante esta fase da retração, se um elemento de superfície limitou ao modilhão, o modilhão deflexionará para baixo como os movimentos piezo a microplaqueta que guardara o modilhão longe da superfície. Porque o modilhão deflexiona para baixo a força aplicada ao elemento de superfície anexado ao modilhão aumentará. Na força em que a ligação entre a biomolécula e o modilhão é quebrada, o modilhão agarrará de volta a sua posição não-deflexionada.

Figura 3. curvas da Força-Distância da interacção entre o modilhão e a superfície da filha (a) ou da pilha de matriz (b). No vermelho é a curva do alargamento, toda a outro é retrai curvas. A força desatando-se máxima (f) e a distância da separação (d) podem ser calculadas destes dados. A seta azul indica a região da curva que é indicativa do esticão elástico das moléculas.

A forma da secção do retraimanto das curvas da força-distância pode igualmente indicar algo sobre as propriedades materiais da biomolécula anexada. Neste caso a forma da curva mostra que os elementos de superfície anexados ao modilhão se deformam elàstica, antes que a interacção com o modilhão esteja quebrada. Adicionalmente, disto reconstituir a curva uma pode determinar a força exigida para quebrar a ligação e a distância da separação da superfície em que este rompimento bond ocorre.

Há uma variabilidade entre as curvas da força-distância obtidas na mesma pilha, devido ao facto de que não cada interacção entre o modilhão e a superfície da pilha conduzirá ao acessório de uma biomolécula ao modilhão, o modilhão não anexará sempre à extremidade de uma molécula e a composição de superfície é inerente heterogênea. É conseqüentemente importante adquirir um suficiente número de curvas da força-distância de modo que os dados possam eficazmente ser sujeitados à análise estatística. Aqui, sobre 100 curvas da força foram medidos em cada pilha, e a força, o F, e a distância desatando-se máximos na ruptura, D da separação, foram calculados e são apresentados em Figura 4 como um histograma. Os valores F e D foram calculados somente quando uma interacção entre uma molécula de superfície e o modilhão foi detectada.

A Figura 4. Histogramas da extensão afasta D (a) e a força desatando-se máxima F (b) para as pilhas da matriz e de filha.

No caso da distância à ruptura, o histograma dos valores mostra que para ambas as pilhas os dados estão distribuídos normalmente até 400 nanômetro (Figo 4A), e então para ambas as pilhas há alguns outliers maiores. A fim comparar as duas séries de dados os outliers acima de 400 nanômetro foram negligenciados. Dentro destas limitações, para a pilha de matriz D = 139 ± 56 nanômetro, e para a pilha de filha D = 86 ± 43 nanômetro. Estes valores foram determinados ser significativamente diferentes, usando um T-Teste dois-atado do estudante.

Os dados para a força desatando-se máxima mostram que, em média, a força se desatando para a pilha de matriz é mais alta do que aquela da pilha de filha (matriz, F = 352 pN: filha, F = 167 pN). Contudo, neste caso, há uma distribuição muito mais larga de desatar forças e em ambos os casos, havia um número de curvas da força-distância onde não havia nenhuma deflexão do modilhão, isto é nenhum emperramento das moléculas de superfície ao modilhão (Figura 4B). Estes dados sugerem uma diferença na estrutura e na composição da parede de pilha entre a matriz e a pilha de filha.

Bactérias

Porque o AFM é uma técnica de imagem lactente de superfície, foi usado para caracterizar as estruturas de superfície na alta resolução. Algumas bactérias exibem um Assassino, ou a camada de superfície, consistindo em uma estrutura regularmente embalada da proteína. A embalagem empresta uma estabilidade estrutural à amostra, Assassinos assim isolados, cristalinos pode ser imaged na alta resolução, secundário-unidades individuais da proteína da exibição. A camada intermediária sextavada embalada dos radiodurans de Deinococcus do archaebacteria (Figura 1) é um exemplo conhecido. Em imagens do AFM desta camada de HPI, uma puder ver as subunidades individuais de cada poro, e que alguns destes poros estão em uma conformação aberta, quando outro é fechado.

Quando a maioria de Assassinos da exibição do archaebacteria, tensões do laboratório do eubacteria não fizerem geralmente. As bactérias as mais de uso geral do laboratório são Eschericia coli, um relvado - bactérias negativas. Relvado - as bactérias negativas têm uma membrana de plasma, cercada por um espaço periplásmico em que há uma parede de pilha rígida mas altamente porosa de peptidoglycan. Isto é cercado então por uma membrana exterior, de que os lipopolysaccarides do comprimento de variação estendem.

Figura 5. imagens Intermitentes do modo de contacto de pilhas de DH5a. A altura da Vista Geral (a) e o erro sinalizam (b) imagens, e uma imagem mais alta do sinal do erro da ampliação (c) da superfície da bactéria.

Aqui, nós temos duas tensões imaged de Escherichia Coli, de DH5a e de OP50. As imagens de DH5a mostram o clássico, haste-forma de muito relvado - bactérias negativas. As pilhas foram feitas a varredura no ar (Figura 5) e no amortecedor (Figura 6). Quando imaged no ar, a superfície das bactérias parece modelada altamente. Além, um halo em torno da bactéria é aparente. Estas estruturas correspondem provavelmente ao pili, que são encontradas na superfície de Escherichia Coli. Ao contrário, quando imaged no líquido (Figura 6) a superfície da bactéria parece muito mais lisa. Neste caso isto é devido ao facto de que as estruturas de superfície estariam deslocadas facilmente pelo movimento da ponta durante a exploração, porque não são fixadas no lugar.

Figura 6. imagens Intermitentes do modo de contacto de DH5a no líquido. Uma imagem 3D gerada dos dados topográficos (a) e uma imagem mais alta do sinal do erro da ampliação (b) são indicadas.

A tensão OP50, quando também Escherichia Coli, parecer bastante diferente. OP50 foi isolado originalmente como uma tensão que poderia ser usada para alimentar elegans de Caenorhabditis. É um uracil que exige a tensão que é mais frágil e menor do que outras tensões de Escherichia Coli. Quando imaged no ar (Figura 7) estas bactérias não exibem a mesma superfície estruturada que vista para o DH5a. Além, as pilhas são mais frágeis e devem ser com cuidado imaged evitar removê-los da superfície. No líquido, a superfície é estruturada igualmente menos do que aquela de DH5a, e as regiões da superfície da pilha são deslocadas no sentido de varredura, correspondendo provavelmente ao deslocamento dos açúcares e de outras estruturas flexíveis na superfície da pilha.

Figura 7. Imagens das bactérias OP50 imaged no ar (Um-Topografia, sinal de Berror) e no líquido (topografia do C, de erro do D sinal).

O modilhão pode igualmente ser usado para sondar interacções com os açúcares na superfície das bactérias (como mostrado para acima cerevisiae do S.). Contudo, aqui nós anexamos as bactérias ao modilhão (que usa a poli-L-lisina) e medimos a interacção entre as bactérias e a superfície de mica (Figura 8). Tal técnica é original que permite a quantificação de interacções da bacteriano-superfície, crítico para estudos de biofouling em processos industriais. O uso do JPK Biocell™ como um suporte da amostra permite que a adição in situ de compostos obstrua estas interacções.

Figura 8. curvers Representativos da força-distância da interacção entre o modilhão-limite DH5a e uma superfície de mica, no amortecedor. Uma curva do alargamento é apresentada no vermelho, todas as curvas azuis é curvas da retração. Aumentar a força aplicada não aumentou a força desatando-se máxima. As Setas indicam o indivíduo que desata eventos.

As curvas Representativas da força-distância de interacções de DH5á-mica não são apresentadas em Figura 8. Em comparação com a interacção do modilhão com a superfície cerevisiae do S., lá são nenhuma deformação elástica da amostra. Um número de eventos desatando-se discretos podem ser considerados, provavelmente correspondendo a desatar-se de elementos de superfície individuais. Além Disso, das curvas uma da distância da força pode determinar a força máxima exigida para separar as bactérias da superfície, porém uma pode igualmente começar investigar o indivíduo que desata eventos.

Vírus

Os Vírus são obrigam os parasita intracelulares compor de um material genético circunvizinho do revestimento exterior da proteína que consista no ADN ou no RNA. Este material genético não contem toda a informação exigida para a réplica, em lugar do vírus precisa de subverter a maquinaria celular da pilha de anfitrião para propagar. Os Vírus são extremamente pequenos, ao redor 20 nanômetro a 400 nanômetro. Isto significa que a caracterização da estrutura viral exige técnicas de imagem lactente de alta resolução, tais como a microscopia atômica da força. Aqui nós temos vírus de mosaico de tabaco imaged (TMV), a microscopia de elétron de utilização imaged do primeiro vírus.

Figura 9. imagens Intermitentes do modo de contacto de partículas de TMV. A Topografia (a), a fase (b) e as imagens do sinal do erro (c) da mesma região da amostra são apresentadas.

As partículas de TMV foram fixadas à mica e a modo de contacto intermitente de utilização imaged. Estas partículas do vírus são sabidas como os capsids helicoidais, onde as pilhas da proteína do revestimento em um teste padrão helicoidal em torno do material genético. Este empilhamento helicoidal pode ser considerado nos canais de sinal da altura, da fase e do erro (Figura 9). Uma vantagem significativa de usar um BioAFM, tal como o JPK Nanowizard®, às amostras biológicas da imagem, é que a imagem lactente pode ser conduzida no líquido. Como tal, as partículas do vírus podem ser imaged na superfície de suas pilhas de alvo, no líquido. Aqui, nós temos virus da gripe imaged anexado à superfície de glóbulos vermelhos, no líquido, usando o modo de contacto intermitente. As partículas do vírus são claramente imaged na superfície das pilhas.

Figura 10. partículas do Virus da gripe associadas com a superfície de um eritrócite. A imagem da vista geral (a) e uma imagem mais alta da ampliação (b) da superfície vermelha do glóbulo mostram partículas do virus da gripe (a seta branca)

Conclusões

O bioAFM de Nanowizard® é serido perfeitamente para o estudo dos micro-organismos. O JPK Biocell fornece circunstâncias fisiológicos sem sacrificar a estabilidade do AFM ou a qualidade óptica. A estabilidade do microscópio permite a imagem lactente de subunidades individuais da proteína, e a integração completa em um fotomicroscópio invertido permite uma combinação de técnicas da microscopia de ser conduzida simultaneamente. Não somente esta plataforma permite imagens de alta resolução de amostras microbianas, pode ser usada para determinar forças da interacção entre organismos e uma superfície ou entre o modilhão e as moléculas superfície-associadas.

Reconhecimentos

Muitos agradecimentos ao Dr. Jeffrey Stear, Max Planck Institute para a Biologia Celular e a Genética Moleculars, para as amostras cerevisiae de Escherichia Coli e de S. TMV foi fornecido amavelmente pelo Dr. Michael Laue do Instituto de Robert Koch. As imagens de HPI foram fornecidas amavelmente pelo Dr. Patrick Frederix, Universidade de Basileia.

Source: Instrumentos de JPK

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Instrumentos de JPK

Date Added: Jan 17, 2009 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 21:20

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