NanoWizard bioAFM perfeitamente adequado para estudo dos microrganismos por JPK Instruments

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Temas Abordados

Introdução
Nanotecnologia para Microbiologia
Levedura
Bactérias
Vírus
Conclusões
Agradecimentos

Introdução

O termo "microbiologia" geralmente descreve o estudo desses organismos invisíveis ao olho humano, na levedura especial, bactérias e vírus. No entanto, estes três tipos de organismos são significativamente diferentes um do outro. Leveduras e bactérias são diferentes tipos de células (eucarióticas e procarióticas, respectivamente), enquanto que um vírus não é estritamente um organismo vivo, sendo um parasita intracelular obrigatório. As ferramentas para realizar pesquisas em microbiologia podem ser separados em dois principais campos de microscopia, o que é necessário para a visualização, e biologia molecular, que tem sido utilizado para caracterizar (em alguns casos de forma abrangente) a genética e proteômica compõem destes organismos.

Nanotecnologia para Microbiologia

Os passos iniciais na abertura do campo da microbiologia veio com o advento dos primeiros microscópios. As bactérias foram os primeiros visualizado por Antony van Leeuwenhoek, utilizando um simples microscópio auto-construídas, cerca de 1676. Os microscópios construído por Leeuwenhoek não foram microscópios compostos, contando apenas com uma lente única, mais como uma lente de aumento muito poderosas. Uma de suas primeiras descrições de bactérias (referido como animálculos) foi a partir de amostras de raspados os dentes de van Leeuwenhoek si mesmo.

Enquanto levedura têm sido usados ​​em fermentação e para fermentar o pão por cerca de 5.000 anos, foi em 1860 que Louis Pasteur descrita pela primeira vez na levedura Saccharomyces cerevisiae como o effecter desses processos. Louis Pasteur fez muitas contribuições significativas para a área da microbiologia ao longo dos anos, a partir da descrição de S. cerevisiae, para seus experimentos elegantes para refutar a teoria da geração espontânea e seu papel fundamental na teoria dos germes da doença e desenvolvimento de uma vacina mais cedo. De fato, um dos sucessos de Pasteur no campo do desenvolvimento de vacinas foi para atenuar o vírus da raiva através de aquecimento para injeção como uma vacina, apesar de não ser capaz de visualizar o próprio vírus no tecido afetado.

Avanços feitos na microscopia de luz com o trabalho combinado de Ernst Abbe e Carl Zeiss na década de 1880 prorrogado a pesquisa do mundo microbiológico. No entanto, como Abbe mesmo descreveu, há um limite para a resolução de microscopia de luz, dependendo do comprimento de onda da luz que ilumina e da abertura numérica da lente. Na realidade, a resolução da microscopia de luz é limitada à metade do comprimento de onda da luz, ou cerca de 250 nm. Como tal, o estudo da estrutura de vírus tiveram que esperar para o advento do microscópio eletrônico em 1931 por Ernst Ruska ea cristalização subseqüente do vírus do mosaico do tabaco em 1935 por Stanley Wendall.

Mais recentemente, o microscópio de força atômica, abriu um novo caminho para a investigação e manipulação de estruturas em uma escala muito pequena. Uma das vantagens mais citadas da AFM no estudo das estruturas biológicas é o fato de que, ao contrário de microscopia eletrônica, imagens de alta resolução podem ser obtidas em condições fisiológicas. No entanto, há mais para a AFM do que apenas a sua capacidade para geração de imagens em alta resolução. A natureza mecânica do AFM significa que o cantilever, usado para geração de imagens, também pode ser usado para medir forças de interação, na faixa piconewton.

Como tal, não só a imagem de AFM da superfície de microorganismos em alta resolução, em condições fisiológicas, também pode ser usado para investigar as forças de ligação entre microrganismos e superfícies alvo.

O JPK NanoWizard ® BioAFM é perfeitamente adequado para tais estudos. O NanoWizard ® é projetado para funcionar em simultâneo com microscopia de luz, e é instalado em um microscópio de luz invertida, permitindo que múltiplos canais de informações a serem coletadas e reduzindo o tempo experimental, permitindo ao usuário identificar a localização das células de interesse opticamente, antes de digitalizar uma determinada região com AFM. O porta-amostras especialmente concebidos, o JPK BioCell ™ , facilita experimentos a temperaturas entre 15-60 ° C em lamínulas de vidro fino, de tal forma que não a qualidade das imagens ópticas em reduzida. Além disso, o JPK NanoWizard ® apresenta estabilidade superior, permitindo que imagens de alta resolução de componentes de célula, como camadas de superfície bacteriana (Figura 1), bem como imagens fisiológicas de células inteiras, a partir de procariontes de eucariontes.

Figura 1. HPI camada de Deinococcus radiodurans, imagem gentilmente cedida pelo Dr. Patrick Frederix, Universidade de Basel.

Levedura

A levedura S. cerevisiae, também conhecido como levedura de brotamento, não é apenas de uso em processos industriais de panificação para a fermentação da cerveja, é também um organismo tipo no estudo das células eucarióticas. Como S. cerevisiae é capaz de haplóides ou diplóides de crescimento e é um organismo de célula única, com um tempo de duplicação de um par de horas, tem-se revelado bem adequado para o estudo do funcionamento básico das células eucarióticas.

A levedura S. cerevisiae é cercado por uma parede celular composta de proteínas, polissacarídeos e pequenas quantidades de quitina. Microscopia eletrônica mostrou que essa parede celular é uma estrutura em camadas que vão até 300 nm de espessura. A camada interna empresta resistência mecânica e é composta de A1 ,2-glicano e quitina. A camada exterior está envolvida em eventos de reconhecimento entre as células, e é na sua maioria composta de manoproteínas fortemente glicosilada. A presença do carboidrato cadeias laterais nesses manoproteínas fazer a parede celular hidrofílica e resultar em várias cargas negativas em pH fisiológico. Quando fotografado com a AFM, a superfície da célula parece muito bom, e é facilmente deformado, necessitando de digitalização cuidado com a força mínima (Figura 2). A única característica de superfície aparente é a cicatriz bud na extremidade oposta da célula-mãe para a célula filha recém-formando. A superfície parece suave como os açúcares obscuro da membrana.

Figura 2. Imagem de S. cerevisiae. Células de levedura foram localizados através de microscopia DIC (A) e depois com imagens no modo de contato do líquido com o AFM (B). Em (C) uma imagem 3D gerada a partir da altura do canal é exibido, com destaque para a cicatriz bud na célula-mãe (seta amarela).

Uma das características únicas do AFM decorre da natureza mecânica do microscópio em si. O cantilever flexível pode ser calibrado e, posteriormente, utilizados para calcular forças de interação. Este pode então ser usada para determinar tanto a força de interação entre uma amostra e os cantilever, eo comprimento para o qual elementos de superfície vai esticar antes do link para o cantilever é rompido.

Aqui, nós trouxemos o cantilever em contato com um número de pontos na superfície da mãe ea célula filha. Pelo menos 10 força-distância curvas foram obtidas em vários pontos para cada célula.

A partir das curvas força-distância, vários dados podem ser extraídos. Na Figura 3, apenas uma das curvas de estender (como o cantilever se aproxima da superfície e deforma) foi plotado em vermelho. As curvas de todos os outros correspondem ao refazer, ou retração do cantilever de distância da superfície. Durante esta fase de retração, se um elemento de superfície tem ligado ao carro, o cantilever irá desviar para baixo como o piezo move o chip segurando o cantilever de distância da superfície. Como o cantilever desvia para baixo a força aplicada ao elemento de superfície ligado à cantilever irá aumentar. Na força que o elo entre o biomolécula eo cantilever é quebrado, o cantilever irá pular de volta para sua posição de não-desviados.

Figura 3. Força-distância curvas da interação entre o cantilever ea superfície da filha (A) ou célula-mãe (B). Em vermelho é a curva de estender, todos os outros são retrair curvas. A força máxima unbinding (F) ea distância de separação (D) pode ser calculado a partir destes dados. A seta azul indica a região da curva que é indicativo de elástico que se estende das moléculas.

A forma da seção retrair das curvas de força-distância também pode indicar algo sobre as propriedades do material da biomolécula em anexo. Neste caso, o formato da curva mostra que os elementos de superfície ligado à cantilever deformar elasticamente, antes da interação com o cantilever está quebrado. Além disso, a partir desta curva retrace pode-se determinar a força necessária para quebrar o vínculo ea distância de separação da superfície em que esta perturbação obrigação ocorrer.

Existe uma variabilidade entre as curvas de força-distância obtidos na mesma célula, devido ao fato de que não todas as interações entre o cantilever ea superfície da célula irá resultar na fixação de uma biomolécula ao carro, o cantilever nem sempre atribuem ao final de uma molécula ea composição da superfície é inerentemente heterogêneo. Portanto, é importante para adquirir um número suficiente de força-distância curvas para que os dados possam efetivamente ser submetido à análise estatística. Aqui, mais de 100 curvas força foram medidos em cada célula, ea força máxima unbinding, F, ea distância de separação na ruptura, D, foram calculados e são apresentados na Figura 4 como um histograma. Os valores de F e D foram calculados apenas quando uma interação entre uma molécula de superfície e do cantilever foi detectado.

Figura 4. Histogramas de extensão a distância D (A) e F a força máxima unbinding (B) para as células mãe e filha.

No caso da distância até a ruptura, o histograma de valores mostra que para ambas as células os dados são normalmente distribuídos até 400 nm (Fig. 4A), e depois para ambas as células há alguns outliers maiores. , A fim de comparar os dois conjuntos de dados a outliers acima de 400 nm foram desconsiderados. Dentro destas restrições, para a célula-mãe D = 139 ± 56 nm, e para a célula filha D = 86 ± 43 nm. Estes valores foram determinados a ser significativamente diferentes, usando um estudante bicaudal T-teste.

Os dados para o show força máxima unbinding que, em média, a força de desligamento para a célula-mãe é maior do que a célula-filha (mãe, F = 352 pN: filha, F = 167 pN). No entanto, neste caso, há uma distribuição muito mais ampla das forças de desligamento e em ambos os casos, houve uma série de força-distância curvas onde não havia deflexão do cantilever, isto é, sem ligação de moléculas de superfície para o cantilever (Figura 4B ). Estes dados sugerem uma diferença na estrutura e composição da parede celular entre a mãe ea célula-filha.

Bactérias

Como AFM é uma técnica de imagem em superfície, tem sido usado para caracterizar estruturas de superfície em alta resolução. Algumas bactérias apresentam uma S-camada, ou camada de superfície, que consiste em uma grade regular embalado de proteína. A embalagem dá uma estabilidade estrutural para a amostra, de forma isolada, Slayers cristalina podem ser visualizados em alta resolução, mostrando proteína individual sub-unidades. A camada hexagonal embalado intermédio do Deinococcus radiodurans arqueobactérias (Figura 1) é um exemplo bem conhecido. Em imagens de AFM desta camada HPI, pode-se ver as subunidades individuais de cada poro, e que alguns desses poros estão em uma conformação aberta, enquanto outros estão fechados.

Enquanto exibem mais arqueobactérias S-camadas, estirpes laboratoriais de eubactérias geralmente não. As bactérias de laboratório mais comumente utilizada é Eschericia coli, uma bactéria gram negativa. Bactérias gram-negativas têm uma membrana plasmática, cercado por um espaço periplasmic em que há uma parede celular rígida, mas altamente porosa de peptidoglicano. Este é, então, cercado por uma membrana externa, a partir do qual lipopolysaccarides de comprimento variando estender.

Figura 5. Imagens contato intermitente modo de células DH5a. Altura visão geral (A) e sinal de erro (B) imagens, e uma maior ampliação da imagem do sinal de erro (C) da superfície da bactéria.

Aqui, temos imaged duas cepas de E. coli, DH5a e OP50. As imagens de DH5a mostrar o clássico, rod-shape de muitas bactérias gram-negativas. As células foram digitalizadas no ar (Figura 5) e em tampão (Figura 6). Quando fotografada no ar, a superfície da bactéria parece altamente padronizada. Além disso, um halo em torno da bactéria é aparente. Estas estruturas provavelmente correspondem a pili, que são encontrados na superfície de E. coli. Em contraste, quando fotografada no fluido (Figura 6) da superfície da bactéria parece muito mais suave. Neste caso, isso se deve ao fato de que as estruturas de superfície seria facilmente deslocado pelo movimento da ponta durante a varredura, como eles não são fixos no lugar.

Figura 6. Imagens contato intermitente modo de DH5a no líquido. A imagem 3D gerada a partir de dados topográficos (A) e uma maior ampliação da imagem do sinal de erro (B) são exibidos.

A cepa OP50, ao mesmo tempo E. coli, aparece bem diferente. OP50 foi originalmente isolado como uma tensão que poderia ser usado para alimentar Caenorhabditis elegans. É uma cepa uracil requerendo que é mais frágil e menor do que outras cepas de Escherichia E.. Quando fotografada no ar (Figura 7) estas bactérias não apresentam a mesma superfície estruturada como visto para o DH5a. Além disso, as células são mais frágeis e devem ser cuidadosamente trabalhada para evitar removê-los da superfície. No fluido, a superfície também é menos estruturada do que a de DH5a, e as regiões da superfície celular são deslocados na direção da varredura, provavelmente correspondente ao deslocamento dos açúcares e outras estruturas flexíveis na superfície da célula.

Figura 7. Imagens de OP50 bactérias fotografada no ar (A-topografia, bError sinal) e fluido (C-topografia, D-erro de sinal).

O cantilever também pode ser usado para investigar as interações com os açúcares na superfície das bactérias (como mostrado por S. cerevisiae acima). No entanto, aqui temos as bactérias associadas à cantilever (usando poli-L-lisina) e mediu a interação entre a bactéria ea superfície de mica (Figura 8). Tal técnica é o único que permite a quantificação da superfície bacteriana interações, essenciais para estudos de incrustação em processos industriais. O uso da Biocell JPK ™ como um suporte de amostra permite que o além situ de compostos para bloquear essas interações.

Figura 8. Representante força-distância curvers da interação entre cantilever-bound DH5a e uma superfície de mica, em buffer. Uma curva de estender é apresentado em vermelho, azul todas as curvas são curvas de retração. Aumentar a força aplicada não aumentar a força máxima unbinding. Setas indicam eventos individuais unbinding.

Representante força-distância curvas de DH5á-mica interações são apresentados na Figura 8. Em comparação com a interação do cantilever com a superfície S. cerevisiae, não há deformação elástica da amostra. Uma série de eventos discretos desligamento pode ser visto, provavelmente correspondente ao desligamento de elementos de superfície individual. Novamente, a partir das curvas distância vigor um pode quantificar a força máxima necessária para separar as bactérias da superfície, no entanto também se pode começar a investigar os eventos individuais unbinding.

Vírus

Vírus são parasitas obrigatórios do interior composto por uma camada de proteína exterior em torno do material genético, que consiste de DNA ou RNA. Este material genético não contém todas as informações necessárias para a replicação, o vírus necessita, em vez de subverter a maquinaria celular da célula do hospedeiro para se propagar. Os vírus são extremamente pequenas, cerca de 20 nm até 400 nm. Isto significa que a caracterização da estrutura viral requer técnicas de alta resolução de imagem, tais como microscopia de força atômica. Aqui temos imaged vírus do mosaico do tabaco (TMV), o primeiro vírus fotografada usando microscopia eletrônica.

Figura 9. Imagens contato intermitente modo de partículas TMV. Topografia (A), fase (B) e imagens de erro de sinal (C) da região mesma amostra são apresentados.

As partículas de TMV foram absorvidos em mica e fotografada usando o modo de contato intermitente. Estas partículas de vírus são conhecidos como helicoidais capsídeos, onde as pilhas de revestimento da proteína em um padrão helicoidal ao redor do material genético. Este helicoidal de empilhamento pode ser visto na altura, e os canais de fase do sinal de erro (Figura 9). Uma vantagem significativa da utilização de um BioAFM, como o NanoWizard JPK ® , a amostras biológicas de imagem, é que as imagens podem ser conduzidas em fluidos. Como tal, as partículas do vírus podem ser visualizados na superfície de suas células-alvo, no líquido. Aqui, temos imaged vírus da gripe ligado à superfície das células vermelhas do sangue, no líquido, utilizando o modo contato intermitente. As partículas do vírus são claramente visualizados na superfície das células.

Figura 10. Partículas do vírus da gripe associada à superfície de um eritrócito. A imagem panorâmica (A) e imagem de maior ampliação (B) da superfície de glóbulos vermelhos mostram partículas do vírus da gripe (seta branca)

Conclusões

O NanoWizard ® bioAFM é perfeitamente adequado para o estudo dos microrganismos. O Biocell JPK fornece condições fisiológicas, sem sacrificar a estabilidade ou AFM qualidade óptica. A estabilidade do microscópio permite imagens de subunidades da proteína individual, e integração completa em um microscópio de luz invertida permite uma combinação de técnicas de microscopia para ser realizada simultaneamente. Não somente esta plataforma permite imagens de alta resolução de amostras microbianas, que podem ser usados ​​para quantificar as forças de interação entre organismos e uma superfície ou entre o cantilever ea superfície associada moléculas.

Agradecimentos

Muito obrigado ao Dr. Jeffrey Stear, Max Planck Institute for Molecular Cell Biology e Genética, para a E. coli e amostras de S. cerevisiae. TMV foi gentilmente cedido pelo Dr. Michael Laue do Instituto Robert Koch. As imagens foram gentilmente cedidas HPI pelo Dr. Patrick Frederix, Universidade de Basel.

Fonte: Instrumentos JPK

Para mais informações sobre essa fonte por favor visite JPK Instruments